一种柯萨奇病毒及其在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法

本发明属于抗肿瘤药物领域，更具体地，涉及一种柯萨奇病毒及其应用。

背景技术：

溶瘤病毒具备感染并在肿瘤细胞中增殖，进而破坏肿瘤组织的特性。在临床研究中，多种具备溶瘤特性的病毒用于治疗不同癌症的安全性和治疗效力已被报道和证实。

柯萨奇病毒b3株(cvb3，coxsackieb3)是一种包含7.4kb基因组的正链rna病毒，由于其生长周期特性具备相对的遗传安全性，被广泛认为可以用于溶瘤病毒治疗，或作为基因传递的病毒载体。但是在临床上，该病毒野生型通常会导致温和的病毒感染症状，有时也会在儿童和弱免疫力的成人身上导致严重的心脏、胰脏和中枢神经系统疾病。因此，过去20年中有多种cvb3的减毒株被发现或设计构建出来，用于治疗溶瘤治疗，或作为基因传递的载体。

当前对cvb3的溶瘤研究主要集中在对肺癌的预防和治疗。cvb3对其他癌症的溶瘤效果研究尚有待证实。目前的研究显示cvb3对不同的癌症的溶瘤效果存在差异，同时不同株系的cvb3病毒对不同的癌症的溶瘤效果亦存在比较明显的特异性。

目前尚没有办法通过定向的手段，改变溶瘤病毒对于组织的选择性，从而加强溶瘤病毒对特定肿瘤的治疗效果。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种柯萨奇病毒，其目的在于通过对柯萨奇病毒的基因突变分析、功能鉴定以及其抑制肝癌细胞的药效及安全性实验，证实其具有良好的肝癌选择特异性，由此提供一种安全性更高、副作用更小且效果更好的抗肝癌药物。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种柯萨奇病毒，其为柯萨奇病毒b3株，其基因组包括以下突变g749a、t751g、a881g、t883c、g1419t、和/或c1420t。

优选地，所述柯萨奇病毒，其基因组还包括以下突变：

t96c、g1180a、t1654c、t1756c、g2276a、a2685c、g2690a、c3120a，a3231g、g4327a、t5088c、a5270g、c7026t、和/或g7192a。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述柯萨奇病毒的应用，其应用于抗肝癌药物的制备。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明提供的柯萨奇病毒b3突变株，相对于野生型的病毒株具备明显的肝癌选择特异性，能更有效的抑制肝癌细胞，同时对心肌细胞的毒性明显降低，能应用于制备抗肝癌药物。

附图说明

图1是实施例1提供的真核表达载体pvax1的结构示意图；

图2是实施例1提供的puc19载体结构示意图；

图3是本发明实施例5提供的突变株和nancy株对心肌细胞的毒性比较结果图；

图4是本发明实施例6提供的突变株和nancy株对肝癌细胞的抑制效果比较结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明提供给了一种柯萨奇cvb3病毒，其包含如下突变：g749a、t751g、a881g、t883c、g1419t、和/或c1420t；

cvb3通过与细胞表面的car受体结合进入细胞，而car受体在不同组织和细胞表面的表达水平是有差异的，这也导致了cvb3病毒对不同生物组织的溶瘤效果具有选择特异性。

本专利利用dna改组技术获得病毒文库在肝癌细胞中连续传代，通过定向进化的方式将有特定靶向作用的病毒株筛选出来。并进行遗传分析实验，证实病毒株的遗传稳定性，及其对肝癌的选择特异性，证实该cvb3毒株对肝癌的溶瘤效果较野生cvb3病毒有明显提高，同时由于对肝细胞的选择特异性，其常见于cvb3病毒的心肌毒性得到明显改善。这可能是由于以上突变，被包含在cvb3病毒vp4蛋白和vp2蛋白的表达区域，可能通过改变cvb3病毒外壳蛋白，影响cvb3病毒与细胞表面受体结合的效率以及稳定性，使得本发明提供的柯萨奇cvb3病毒，对肝癌具有选择特异性，溶瘤效果较野生型柯萨奇cvb3病毒更好，同时降低了对心肌的毒性，副作用更小。

以下为实施例：

实施例1puc19-cvb3(1-1845)质粒的构建

柯萨奇病毒b3(coxsackieb3)nancy株的全基因序列见genebankid：jx312064.1。本公司使用的重组柯萨奇病毒变异减毒株包含如下碱基突变位点：t96c，g1180a、t1654c、t1756c、g2276a，a2685c、g2690a、c3120a，a3231g、g4327a、t5088c、a5270g、c7026t、g7192a。重组柯萨奇病毒变异减毒株的完整cdna序列由本公司合成并通过分子生物学的方法构建到真核表达载体pvax1上(图1)。

使用两端有酶切位点的引物将cvb3基因组1-1845的片段扩增出来并连接到puc19载体的mcs区域(图2)。引物序列为：

forward:5’-cagcaaaatgggagctcaagtatcaacgca-3’；

reverse:5’-cttgagctcccattttgctgtattcaactt-3’。

实施例2dna改组和有性pcr

将实施例1提供的包含cvb3基因组片段的puc19质粒dna消化后进行有性pcr反应。

(1)dnase1的消化：取5ug的puc19-cvb3(1-1845)质粒，0.02u的dnase1消化酶，配制20ul反应体系在37℃反应25min后95℃终止反应。

(2)有性pcr反应：上述反应产物取2ul，加入2×buffer10ul，1ultaq酶，配制20ul反应体系进行有性pcr。反应条件为94℃4min-(94℃30s-45℃30s-72℃90s)×35cycles-72℃5min。

(3)使用上述引物扩增目的片段，反应体系为有性pcr产物2ul，taq酶1ul，2×buffer10ul，引物各1ul，配制20ul反应体系。反应条件为94℃4min-(94℃30s-45℃30s-72℃90s)×35cycles-72℃5min。使用axygen胶回收试剂盒回收1800bp左右片段。

实施例3连接pvax1载体，病毒库连续传代和筛选

将上述回收片段酶切后与同样酶切的pvax1-cvb3质粒连接，使用fermentasligase连接。连接产物与病毒包装试剂混合进行包装(vero细胞)。收集的病毒液在肝癌细胞(sk-hep-1)中连续传两代，每代病毒液检测病毒滴度。随后收集的病毒液在vero细胞中传两代，每代病毒液检测病毒滴度。然后收集的病毒液在肝癌细胞中连续传两代，每代病毒液检测病毒滴度。

每代病毒液pfu如下：

表中可见传代g5和g6代病毒增值率有增高的趋势。说明传代过程中出现了优势病毒株，其具有较高的肝癌细胞选择特异性。

实施例4空斑纯化病毒，遗传分析

将实施例3传代最后一轮回收的病毒液进行空斑纯化，挑取10个空斑扩增特定区域后进行测序；其中9个克隆包括如下突变：g749a、t751g、a881g、t883c、g1419t、c1420t。

对nancy株(全基因序列见genebankid：jx312064.1)进行点突变，包含以下突变位点：g749a、t751g、a881g、t883c、g1419t、c1420t、t96c、g1180a、t1654c、t1756c、g2276a、a2685c、g2690a、c3120a、a3231g、g4327a、t5088c、a5270g、c7026t、g7192a，获得柯萨奇病毒b3突变株。

实施例5柯萨奇病毒b3突变株和nancy株对心肌细胞的毒性比较

柯萨奇病毒nancy株和柯萨奇病毒b3突变株对照，两个样品均设定8个剂量，浓度依次为：1×10⁷pfu/ml、1×10⁶pfu/ml、1×10⁵pfu/ml、1×10⁴pfu/ml、1×10³pfu/ml、1×10²pfu/ml、1×10¹pfu/ml、0。每个浓度设3个平行孔，给药72小时后，先观察细胞的cpe效应，然后进行mtt法检测细胞增殖抑制情况。

如图3所示，柯萨奇病毒b3突变株与nancy株相比有较低的心肌细胞毒性。

实施例6柯萨奇病毒b3突变株和nancy株对sk-hep-1细胞抑制率比较

柯萨奇病毒nancy株和柯萨奇病毒b3突变株对照，两个样品均设定8个剂量，浓度依次为：1×10⁷pfu/ml、1×10⁶pfu/ml、1×10⁵pfu/ml、1×10⁴pfu/ml、1×10³pfu/ml、1×10²pfu/ml、1×10¹pfu/ml、0。每个浓度设3个平行孔，给药72小时后，先观察细胞的cpe效应，然后进行mtt法检测细胞增殖抑制情况。

如图4所示，突变株对sk-hep-1细胞的ic50为6.8×10¹pfu/ml，nancy株对sk-hep-1细胞的ic50为2.3×10²pfu/ml。突变株对肝癌细胞的抑制效果明显好于nancy株。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。