一种SARS-CoV-2特异性抗原和SARS-COV-2免疫球蛋白的检测试剂盒的制作方法

一种sars-cov-2特异性抗原和sars-cov-2免疫球蛋白的检测试剂盒
技术领域
[0001]
本申请属于生物检测技术领域，尤其涉及一种sars-cov-2特异性抗原和sars-cov-2免疫球蛋白的检测试剂盒。本申请要求2020年10月21日提交的美国专利(专利申请号为us17/076,034)的权益，在此将上述申请的内容引用并入本文。


背景技术：

[0002]
新型冠状病毒sars-cov-2(又称covid-19)引起的流行疾病对世界构成了挑战。covid-19感染人类并可能导致严重的肺炎，并伴有大量炎性细胞因子的产生(“细胞因子风暴”)。与covid-19病毒有关的疾病具有典型的肺炎症状，并伴有其他一些症状，例如肺炎、肌肉疼痛、头痛和喉咙痛。目前，尚无针对covid-19感染的有效治疗方法。然而，预后状态很大程度上取决于宿主免疫系统的功效，因此，及时对患者体内针对病毒的特异性抗体进行检测能够有效评判患者的治愈程度。
[0003]
目前，已经开发出针对covid-19病毒特异性igm和igg抗体的早期诊断试剂盒，以及检测covid-19病毒水平的q-rt-pcr试剂盒，但是仍在一些患者中出现了较高的免疫球蛋白引起的假阳性率。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本申请提供了一种sars-cov-2特异性抗原和sars-cov-2免疫球蛋白的检测试剂盒，改善针对covid-19免疫球蛋白检测的可信度。
[0005]
本申请的具体技术方案如下：
[0006]
本申请第一方面提供一种sars-cov-2特异性抗原，包括刺突蛋白片段；
[0007]
所述刺突蛋白片段的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
[0008]
优选的，还包括核衣壳蛋白片段；
[0009]
所述核衣壳蛋白片段的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0010]
优选的，所述sars-cov-2特异性抗原由所述刺突蛋白片段以及所述核衣壳蛋白片段直接混合得到。
[0011]
本申请第二方面提供所述特异性抗原在制备sars-cov-2抗体或sars-cov-2免疫球蛋白的检测产品中的应用。
[0012]
本申请第三方面提供一种sars-cov-2免疫球蛋白的检测试剂盒，包括固相载体和试剂；
[0013]
所述固相载体包括试验板；
[0014]
所述试验板包被有所述的特异性抗原。
[0015]
优选的，所述固相载体还包括控制板；
[0016]
所述控制板包被有血清白蛋白。
[0017]
优选的，所述特异性抗原的包被浓度为20-200ng/ml，所述血清白蛋白的包被浓度
为340-1000ng/ml。
[0018]
优选的，所述试剂包括阳性对照品、第二抗体或所述特异性抗原、封闭液、底物溶液以及终止液；
[0019]
所述第二抗体或所述特异性抗原的标记物选自酶、荧光素、同位素和生物素中的一种。
[0020]
优选的，所述阳性对照品为含有抗sars-cov-2抗原的人igg、igm或iga抗体的血清；
[0021]
所述酶选自尿素酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化氢酶；
[0022]
所述封闭液选自牛血清白蛋白、酪蛋白、奶粉溶液和tris-cov-2阻断缓冲液中的一种；
[0023]
所述底物溶液为tmb溶液。
[0024]
所述终止液为硫酸溶液。
[0025]
优选的，所述试剂还包括样品缓冲液和样品稀释液；
[0026]
所述样品缓冲液的溶质选自牛血清白蛋白、牛丙种球蛋白、酪蛋白和吐温20中一种或多种，溶剂为pbs缓冲液；
[0027]
所述样品稀释液为含0.5％普鲁卡因的样品缓冲液。
[0028]
优选的，所述sars-cov-2免疫球蛋白为iga、igm和igg中的一种或多种。
[0029]
本申请提供了一种sars-cov-2特异性抗原和sars-cov-2免疫球蛋白的检测试剂盒，本申请的刺突蛋白片段的氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，本申请的核衣壳蛋白片段的氨基酸序列如seq id no.3所示，作为特异性抗原检测sars-cov-2免疫球蛋白，具有更低的假阳性和假阴性率，改善针对sars-cov-2免疫球蛋白检测的可信度。本申请的检测试剂盒基于elisa的检测方法，具有更高的灵敏度、特异性以及更低的检出限。本申请的检测试剂盒可用于定性或定量检测sars-cov-2的iga、igm和igg抗体，具有特异性、灵敏度、准确性高的优点。本申请提供的检测试剂盒中igg检测的特异性为98.07％，灵敏度为95.72％，准确性为97.34％，临界值为1.23，kappa值为0.9536，auc值为0.9839。igm检测的特异性为98.48％，灵敏度为83.47％，准确性为93.93％，临界值为23.09，kappa值为0.90，auc值为0.9609。iga检测的特异性为98.10％，灵敏度为82.60％，准确性为93.40％，临界值为6.36，kappa值为0.89，auc值为0.9441。
附图说明
[0030]
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0031]
图1为本申请实施例中检测试剂盒的原理示意图；
[0032]
图2本申请实施例2中试验板a(上:igg-s)和试验板b(下:igg-s+n)的roc图；
[0033]
图3为本申请实施例3中试验板a(上:igg-s-albumin)和试验板b(下:igg-s+n-albumin)的roc图；
[0034]
图4为本申请实施例4中试验板a(上:igm-s)和试验板b(下:igm-s+n)的roc图；
[0035]
图5为本申请实施例3中试验板a(上:igm-s-albumin)和试验板b(下:igm-s+n-albumin)的roc图；
[0036]
图6为本申请实施例6中试验板a(上:iga-s)和试验板b(下:iga-s+n)的roc图；
[0037]
图7为本申请实施例3中试验板a(上:iga-s-albumin)和试验板b(下:iga-s+n-albumin)的roc图；
[0038]
图8为本申请实施例10中在人血清和人血浆中检测igg、igm和iga抗体的相关性线性拟合图；
[0039]
图9为本申请实施例11中在人血清和人指尖血中检测igg、igm和iga抗体的相关性线性拟合图。
具体实施方式
[0040]
为使得本申请的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而非全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。
[0041]
本申请实施例中使用的试剂均为市售。本申请实施例中未注明具体条件的，将按照常规条件或制造商建议的条件进行。本申请实施例中使用的刺突蛋白片段(sars-cov-2-srbd抗原)的氨基酸序列如seq id no：1所示，使用的核衣壳蛋白片段(sars-cov-2-n抗原)的氨基酸序列如seq id no：3所示。
[0042]
实施例1检测试剂盒的制备
[0043]
用包被缓冲液(10mm ph7.2的pbs)稀释sars-cov-2-srbd抗原至浓度为150ng/ml，包被于96孔微孔板上，得到试验板a。用包被缓冲液共同稀释sars-cov-2-srbd抗原和sars-cov-2-n抗原，其中，sars-cov-2-srbd抗原的浓度为150ng/ml，sars-cov-2-n抗原的浓度为50ng/ml，包被于96孔微孔板上，得到试验板b。用包被缓冲液稀释sars-cov-2-n抗原至浓度为150ng/ml，包被于96孔微孔板上，得到对照板。用包被缓冲液配置血清白蛋白溶液至浓度为340ng/ml，包被于96孔微孔板上，得到控制板。取定量后的含有抗sars-cov-2抗原的人igg、igm和iga抗体的灭活血清，分别得到阳性对照品1、2和3。血清白蛋白溶液为血清白蛋白的pbs溶液。样品缓冲液为含有0.2％吐温20的pbs溶液，封闭液为含有20％bsa的pbs溶液，样品稀释液为含0.5％普鲁卡因的样品缓冲液。第二抗体为辣根过氧化氢酶标记的抗人igg、igm或iga的抗体。
[0044]
本申请实施例中检测试剂盒的原理示意图如图1所示，其中，1为包被特异性抗原，2为温育阳性对照品或受试者体外样品与特异性抗原进行结合，3为温育第二抗体与特异性抗体进行结合，4为温育底物溶液与第二抗体上的生物素发生显色反应，5为终止显色反应。
[0045]
实施例2igg的roc图绘制
[0046]
(1)将试剂盒中的试剂置于室温，分别用去离子水稀释样品稀释液和样品缓冲液至浓度为1
×
。用样品稀释液以体积比为1500：1的比例稀释阳性对照品1，期间避免样品出现严重的溶血、沉淀、细菌污染或蛋白质悬浮液，再将稀释后的阳性对照品1进行梯度稀释至7个浓度；
[0047]
(2)分别在试验板a和b上，加入200μl不同浓度的阳性对照品1，在室温下温育1h
后，倒出孔内液体，在孔内加入300μl样品缓冲液冲洗并甩干；
[0048]
(3)分别在试验板a和b上，加入200μl封闭液，在室温下温育1h后，倒出孔内液体，在孔内加入300μl样品缓冲液冲洗并甩干；
[0049]
(4)用样品缓冲液将辣根过氧化氢酶标记的抗人igg抗体稀释800倍。分别在试验板a和b上加入100μl抗人igg抗体，在室温下温育30min后，倒出孔内液体，在孔内加入300μl样品缓冲液冲洗并甩干；
[0050]
(5)加入100μl 3,3,5,5'-四甲基联苯胺作为底物溶液，在黑暗中轻轻摇动，室温下温育15min后，加入50μl 0.2m硫酸终止液，立即测量每个孔内415nm处的吸光度；
[0051]
(6)将得到的a和b试验板的所有孔的信号值，使用sigaa图或excel软件，绘制校准曲线，x轴表示阳性对照品1的浓度(单位/ml)，y轴表示吸光度；
[0052]
(7)重复上述步骤得到264组标准曲线，根据软件拟合绘制roc图，并得到特异性、灵敏度、准确度、临界值、kappa值以及auc值。
[0053]
其中，特异性指识别待测样品的能力，灵敏度指测量值随待测样品浓度的变化程度，准确度指测量值与实际值的相近程度，临界值指最小检测浓度，kappa值指测量值的重复稳定性，auc值指线性拟合率。
[0054]
检测的结果如图2所示，图2为本申请实施例2中试验板a(上:igg-s)和试验板b(下:igg-s+n)的roc图。
[0055]
实施例3igg的roc图绘制-去除控制板的背景值
[0056]
采用实施例2的试验方法，区别仅在于步骤(2)中还在控制板上进行试验，在实施例2得到的所有孔的信号值中均减去控制板测得的信号值，其余步骤与实施例2一致。
[0057]
检测的结果如图3所示，图3为本申请实施例3中试验板a(上:igg-s-albumin)和试验板b(下:igg-s+n-albumin)的roc图。
[0058]
结果表明，采用sars-cov-2-srbd抗原与sars-cov-2-n共同作为特异性抗原，或去除白蛋白背景值后，igg检测的特异性、灵敏度、准确性、kappa值以及auc值更高，临界值更低，检测的可信度有所提升。本申请提供的检测试剂盒中igg检测的特异性为98.07％，灵敏度为95.72％，准确性为97.34％，临界值为1.23，kappa值为0.9536，auc值为0.9839。
[0059]
实施例4igm的roc图绘制
[0060]
采用实施例2的试验方法，区别仅在于步骤(1)和步骤(2)中采用阳性对照品2，步骤(4)中采用抗人igm抗体，其余步骤与实施例2一致。
[0061]
检测的结果如图4所示，图4为本申请实施例4中试验板a(上:igm-s)和试验板b(下:igm-s+n)的roc图。
[0062]
实施例5igm的roc图绘制-去除控制板的背景值
[0063]
采用实施例4的试验方法，区别仅在于步骤(2)中还在控制板上进行试验，在实施例4得到的所有孔的信号值中均减去控制板测得的信号值，其余步骤与实施例4一致。
[0064]
检测的结果如图5所示，图5为本申请实施例3中试验板a(上:igm-s-albumin)和试验板b(下:igm-s+n-albumin)的roc图。
[0065]
结果表明，采用sars-cov-2-srbd抗原与sars-cov-2-n共同作为特异性抗原，或去除白蛋白背景值后，igm检测的特异性、灵敏度、准确性、kappa值以及auc值更高，临界值更低，检测的可信度有所提升。本申请提供的检测试剂盒中igm检测的特异性为98.48％，灵敏
度为83.47％，准确性为93.93％，临界值为23.09，kappa值为0.90，auc值为0.9609。
[0066]
实施例6iga的roc图绘制
[0067]
采用实施例2的试验方法，区别仅在于步骤(1)和步骤(2)中采用阳性对照品3，步骤(4)中采用抗人iga抗体，其余步骤与实施例2一致。
[0068]
检测的结果如图6所示，图6为本申请实施例6中试验板a(上:iga-s)和试验板b(下:iga-s+n)的roc图。
[0069]
实施例7iga的roc图绘制-去除控制板的背景值
[0070]
采用实施例6的试验方法，区别仅在于步骤(2)中还在控制板上进行试验，在实施例6得到的所有孔的信号值中均减去控制板测得的信号值，其余步骤与实施例6一致。
[0071]
检测的结果如图7所示，图7为本申请实施例3中试验板a(上:iga-s-albumin)和试验板b(下:iga-s+n-albumin)的roc图。
[0072]
结果表明，采用sars-cov-2-srbd抗原与sars-cov-2-n共同作为特异性抗原，或去除白蛋白背景值后，iga检测的特异性、灵敏度、准确性、kappa值以及auc值更高，临界值更低，检测的可信度有所提升。本申请提供的检测试剂盒中iga检测的特异性为98.10％，灵敏度为82.60％，准确性为93.40％，临界值为6.36，kappa值为0.89，auc值为0.9441。
[0073]
对比例1对照板igg、igm和iga的roc图绘制
[0074]
采用实施例2的试验方法，区别在于步骤(1)和步骤(2)中分别采用阳性对照品1、2和3，并使用对照板进行试验，步骤(4)中分别采用抗人igg、igm和iga抗体，其余步骤与实施例2一致。
[0075]
检测结果为：igg检测(igg-n)的特异性为98.37％，灵敏度为76.54％，准确性为92.96％，临界值为22.81，kappa值为0.89，auc值为0.9359。igm检测(igm-n)的特异性为98.21％，灵敏度为10.00％，准确性为84.84％，临界值为668.83，kappa值为0.82，auc值为0.7893。iga检测(iga-n)的特异性为98.21％，灵敏度为80.00％，准确性为95.45％，临界值为33.72，kappa值为0.94，auc值为0.95。
[0076]
对比例2对照板igg的roc图绘制-去除控制板的背景值
[0077]
采用对比例1的试验方法，区别仅在于步骤(2)中还在控制板上进行试验，在对比例1得到的所有孔的信号值中均减去控制板测得的信号值，其余步骤与对比例1一致。
[0078]
检测结果为：igg检测(igg-n-albumin)的特异性为98.21％，灵敏度为80.00％，准确性为95.45％，临界值为33.72，kappa值为0.94，auc值为0.95。
[0079]
对比实施例2～7和对比例1～2的数据可知，相比单独采用sars-cov-2-n特异性抗原，采用sars-cov-2-srbd抗原与sars-cov-2-n共同作为特异性抗原，检测的特异性、灵敏度、准确性、kappa值以及auc值更高，临界值更低，因而检测出假阳性和假阴性的几率更低，检测的可信度有所提升。同样地，测得的信号值除去白蛋白背景值得到的检测结果也具有更优的检测性能，能够降低检测误差。
[0080]
实施例8待测样品检测
[0081]
采用实施例2的试验方法，区别在于分别采用试验板b和控制板进行试验，步骤(1)和步骤(2)中将阳性对照品换为待测血清样品稀释至一定浓度加入至孔中，步骤(4)中分别采用抗人igg、igm和iga抗体。将试验板b得到的所有孔的信号值均减去控制板测得的信号值，其余步骤与实施例2一致，分别测试115个待测血清样品中sars-cov-2免疫球蛋白igg、
igm和iga的浓度。分别根据实施例3、5和7得到的igg、igm和iga的roc图，将测得的吸光度信号值转换为待测样品的浓度值，其中，若igg的浓度值大于1.23unit/ml，则待测样品的判定结果为阳性；若igg的浓度值小于1.23unit/ml，则待测样品的判定结果为阴性。若igm的浓度值大于23.09unit/ml，则待测样品的判定结果为阳性；若igm的浓度值小于23.09unit/ml，则待测样品的判定结果为阴性。若iga的浓度值大于6.36unit/ml，则待测样品的判定结果为阳性；若iga的浓度值小于6.36unit/ml，则待测样品的判定结果为阴性。
[0082]
实施例9检测试剂盒的假阳性和假阴性评价
[0083]
将实施例8中采用sars-cov-2-srbd抗原和sars-cov-2-n作为特异性抗原，且去除白蛋白背景值后得到的igg、igm和iga的roc图(igg-s+n-albumin、igm-s+n-albumin和iga-s+n-albumin)检测115个待测样品的判定结果中出现假阳性和假阴性的样本数量分别记为#of samples as fp和#of samples as fn。采用sars-cov-2-n作为特异性抗原，且去除白蛋白背景值后得到的igg、igm和iga的roc图(igg-n-albumin、igm-n-albumin和iga-n-albumin)再次检测这些出现假阳性或假阴性的血清样本，两次测试的判定结果出现一致的数量分别记为#of similarly of fp和#of similarly of fn，检测的结果见下表1所示。
[0084]
表1中，115例血清样品中igg-s+n-albumin仅检测到4例igg假阳性样品，5例假阴性样品，且无一例假阳性判定结果与igg-n-albumin一致，有4例假阴性判定结果与igg-n-albumin一致。115例血清样品中igm-s+n-albumin仅检测到4例假阳性样品，19例假阴性样品，且无一例假阳性判定结果与igm-n-albumin一致，仅有4例假阴性判定结果与igm-n-albumin一致。115例血清样品中iga-s+n-albumin仅检测到5例假阳性样品，20例假阴性样品，且无一例假阳性判定结果与iga-n-albumin一致，仅有4例假阴性判定结果与iga-n-albumin一致。结果表明，检测出假阳性和假阴性的几率与检测的特异性和灵敏度高度相关，特异性和灵敏度越高，检测中出现假阳性和假阴性的几率越低，说明采用sars-cov-2-srbd抗原和sars-cov-2-n共同作为特异性抗原具有更高的可信度。另外，本申请的检测试剂盒测得的判定结果，相比采用sars-cov-2-n单独作为特异性抗原得到的igg、igm和iga检测标准曲线检测得到的错误判定结果的相关度较低，说明两个检测方法的特异性结合原理存在实质差异。本申请的检测试剂盒中采用sars-cov-2-srbd抗原和sars-cov-2-n共同作为特异性抗原具有协同作用，能够提升检测sars-cov-2免疫球蛋白的检测性能。
[0085]
表1
[0086][0087]
分别采用sars-cov-2-srbd抗原和sars-cov-2-n作为特异性抗原得到的igm的roc图(igm-s和igm-n)检测实施例8中的115个待测样品，得到的判定结果中出现假阳性和假阴性的样本数量分别记为#of samples as fp和#of samples as fn。采用sars-cov-2-n作为特异性抗原，且去除白蛋白背景值后得到的igm的roc图(igm-n-albumin)再次检测这些出现假阳性或假阴性的血清样本，两次测试的判定结果出现一致的数量分别记为#of similarly of fp和#of similarly of fn，检测的结果见下表2所示。
[0088]
表2中，115例血清样品中igm-s仅检测到5例igm假阳性样品，39例假阴性样品，且
无一例假阳性判定结果与igm-n-albumin一致，仅有1例假阴性判定结果与igm-n-albumin一致。115例血清样品中igm-n仅检测到1例假阳性样品，9例假阴性样品，且无一例假阳性判定结果与igm-n-albumin一致，仅有1例假阴性判定结果与igm-n-albumin一致。结果表明，采用sars-cov-2-srbd和sars-cov-2-n作为特异性抗原的错误判定结果的相关度较低，说明两个检测方法的特异性结合原理存在实质差异。另外，采用sars-cov-2-n作为特异性抗原，与采用sars-cov-2-n作为特异性抗原同时去除白蛋白背景值后检测得到的判定结果相关度较低，说明去除白蛋白背景值能够有效将假阳性和假阴性的判定结果区分，对于降低假阳性和假阴性出现几率有重要意义。
[0089]
表2
[0090][0091]
分别采用sars-cov-2-srbd抗原和sars-cov-2-n作为特异性抗原得到的iga的roc图(iga-s和iga-n)检测实施例8中的115个待测样品，得到的判定结果中出现假阳性和假阴性的样本数量分别记为#of samples as fp和#of samples as fn。采用sars-cov-2-n作为特异性抗原，且去除白蛋白背景值后得到的iga的roc图(iga-n-albumin)再次检测这些出现假阳性或假阴性的血清样本，两次测试的判定结果出现一致的数量分别记为#of similarly of fp和#of similarly of fn，检测的结果见下表3所示。
[0092]
表3中，115例血清样品中iga-s仅检测到5例igm假阳性样品，85例假阴性样品，且无一例假阳性判定结果与iga-n-albumin一致，仅有2例假阴性判定结果与iga-n-albumin一致。115例血清样品中iga-n仅检测到1例假阳性样品，2例假阴性样品，且无一例假阳性判定结果与iga-n-albumin一致，有2例假阴性判定结果与iga-n-albumin一致。结果表明，采用sars-cov-2-srbd和sars-cov-2-n作为特异性抗原的错误判定结果的相关度较低，说明两个检测方法的特异性结合原理存在实质差异。
[0093]
表3
[0094][0095]
实施例10与人体血浆的相关性
[0096]
采用试验板b，分别采用实施例3、5和7的试验方法，区别仅在于步骤(1)和步骤(2)分别采用相同浓度的含有抗sars-cov-2抗原的人igg、igm和iga抗体的灭活人血浆样品，其余步骤与实施例2一致。
[0097]
将测得的igg、igm和iga的roc图分别与实施例3、5和7得到的igg、igm和iga的roc图进行相关性分析。图8为本申请实施例10中在人血清和人血浆中检测igg、igm、iga抗体的相关性线性拟合图。图8表明，除了igg以外，相关性曲线的r2均大于0.97，p值小于0.05，说明本申请提供的检测试剂盒可用于人血浆样品igm和iga抗体的检测。
[0098]
实施例11与人指尖血的相关性
[0099]
采用试验板b，分别采用实施例3、5和7的试验方法，区别仅在于步骤(1)和步骤(2)分别采用相同浓度的含有抗sars-cov-2抗原的igg、igm和iga抗体的灭活人指尖血样品，其余步骤与实施例2一致。
[0100]
将测得的igg、igm和iga的roc图分别与实施例3、5和7得到的igg、igm和iga的roc图线进行相关性分析。图9为本申请实施例11中在人血清和人指尖血中检测igg、igm、iga抗体的相关性曲线图。图9表明，仅igm相关性曲线的r2大于0.97，说明本申请提供的检测试剂盒可用于灭活人指尖血样品igm抗体的检测。
[0101]
以上所述，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的精神和范围。