LINC02474作为结直肠癌诊断标志物和治疗靶点的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种结直肠癌诊断标志物和治疗靶点及其应用。

背景技术：

长链非编码RNA是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200nt，高度保守的长链非编码RNA分子，可以通过组织特异性或发育阶段特异性的方式表达。在多层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）参与基因的调控。近年来，长链非编码RNA由于生物学功能广泛而引起了生物医学研究者的兴趣，其功能正在被不断解析。

长链非编码RNA的生物学功能主要分以下3种：（1）长链非编码RNA在转录调控中的作用；（2）长链非编码RNA在转录后水平调节mRNA加工的不同方面；（3）长链非编码RNA影响包括组蛋白和DNA甲基化、组蛋白乙酰化等在内的多种表观遗传修饰。

近年来，长链非编码RNA与癌症的关系已经成为癌症研究领域的一个重要问题，数百个长链非编码RNA已经被证明在包括结直肠癌在内的各种人类癌症中异常表达。已发现长链非编码RNA与细胞增殖、凋亡、上皮间质转化（EMT）、癌细胞的侵袭和转移有关，因此，长链非编码RNA可作为疾病诊断的生物标志物。

目前临床上对于结直肠癌诊断的方式主要为直肠镜检和影像学检查，然而直肠镜检为有创性检查，有出血及感染风险。影像学检查判断淋巴结转移存在辐射剂量积累及费用高昂等问题。因此，发现结直肠癌早期诊断标志物，能够减少直肠镜检和PET-CT的使用，使结直肠癌的早期诊断更为准确和经济。

技术实现要素：

本发明针对传统结直肠癌诊断和治疗中存在的问题提出一种新型的结直肠癌诊断标志物和治疗靶点及其应用。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

本发明从TCGA数据库中下载结直肠癌数据集数据，利用生物信息学的方法分析结直肠癌组织样本和癌旁组织样本中的差异表达基因，选择差异表达明显的LINC02474作为研究目标。另外，从组织标本库中选取结直肠癌和癌旁正常组织各80例，提取组织RNA，反转录为cDNA,再通过qRT-PCR验证LINC02474在组织标本中的表达量，发现LINC02474在结直肠癌组织中表达显著上调；LINC02474可以促进结直肠癌侵袭与转移。

一种长链非编码RNA LINC02474，其来源于人类的第1号染色体, 脱氧核糖核苷酸序列为

>NR_149071.1 Homo sapiens long intergenic non-protein coding RNA 2474 (LINC02474), long non-coding RNA

CCTCCTGCTCTTTGCTCCGTGAGAAAGATCCACCTACGACCTCAGGTCCTCAGACCGACTAGCCCAAGAAACATCTCACCAATTTCAAATCTGACCTTTGCAAGAGGGTCCGAGACATTTGCATCATCATTCAGTGAGACCTGTAAACACAGCATCTGCCTTTGACCACATCCATCTGGAAGAACCTGAGAGATAATCCATTTTATGAAATTTTCCCTACCCTGAAATGGGAGAATGAATCTAATTTGAAGCACTGAGAAGGATAAGGCATCCATTTGAAAAGGACTCCTATATTGCAACATGAATTCTGCTAAAATTGAAGCAAGAACAAACATCAAATTTATGATGAAGTTTGGGTAGAAGAACGATGAAATTAGTGACGCTTTATAAAAAGTTTATTGGGACAATACCCCAAATGAATCAGCAGTTTAAAAATGGATA。该长链非编码RNA LINC02474在染色体中的位置如图1所示。

本发明提出上述长链非编码RNA LINC02474作为结直肠癌分子生物学标志物的应用。检测来自可疑结直肠癌患者样品中LINC02474的表达量，其中LINC02474的较高表达量与所述对象患有结直肠癌以及预后不佳的高可能性相关。

本发明提出上述长链非编码RNA LINC02474在制备结直肠癌诊断试剂或试剂盒中的应用。LINC02474分子标志物的检测方法，包括样品总RNA提取、RNA反转录、实时荧光定量PCR扩增。具体步骤包括，第一步：总RNA提取，使用飞捷fast2000试剂盒，第二步：使用prime-Script将RNA逆转录成cDNA，GAPDH作为内部对照，使用SYBR Green PCR Master Mix进行所有qRT-PCR反应。

检测RNA LINC02474表达量高低的物质在制备结直肠癌诊断试剂或试剂盒中的应用。

特异性扩增RNA LINC02474的引物，引物序列为，

前向TGCAAGAGGGTCCGAGACAT，反向ATGTGGTCAAAGGCAGATGCT。

一种结直肠癌的诊断试剂盒，所述试剂盒含有如下引物：前向TGCAAGAGGGTCCGAGACAT，反向ATGTGGTCAAAGGCAGATGCT；内参引物：前向ACCCACTCCTCCACCTTTGAC，反向TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT。

下调RNA LINC02474表达水平的特异性小干扰RNA在制备治疗结直肠癌药物中的应用，所述特异性小干扰RNA的序列为

si-LINC02474#1：

正向GGGUCCGAGACAUUUGCAUTT，反向AUGCAAAUGUCUCGGACCCTT；si-LINC02474#2：

正向GGUAGAAGAACGAUGAAAUTT，反向AUUUCAUCGUUCUUCUACCTT。

下调RNA LINC02474表达水平的特异性小干扰RNA在制备治疗结直肠癌药物中的应用，作用对象为DLD-1细胞株。

本发明的第一个目的是提供一个结直肠癌潜在诊断生物标志物和治疗靶点，其为LINC02474。

本发明的第二个目的是提供特异性识别LINC02474的引物对，包括前向引物和后向引物。引物的核苷酸序列如表1。

本发明的第三个目的是公开LINC02474在结直肠癌患者肿瘤组织中的表达情况。

本发明的第四个目的是公开LINC02474在结直肠癌细胞中发挥的功能。

本发明提出长链非编码RNA LINC02474作为一种新的潜在的结直肠癌分子诊断标志物的应用，涉及LINC02474分子标志物的发现、检测、应用，设计并合成出特异性用于实时荧光定量PCR的检测引物及体外干扰LINC02474的小干扰RNA（siRNA）。与正常对照相比，LINC02474在结直肠癌患者组织样本中表达均显著上调。体外实验显示LINC02474可促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移。本发明研究结果表明LINC02474可作为结直肠癌患者的诊断标志物，针对目标人群对结肠镜检筛查依从性差,并且该方法有创，以及临床上确诊的结直肠癌患者绝大多数都是中晚期，早期诊断率总体偏低的现状，在结直肠癌病变进程中找到理想的早期分子预警信号，有针对性的进行早期筛查，确诊病例，以减轻病人痛苦，避免过度医疗，节省医疗资源。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1.本发明首次提出LINC02474可作为结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点，为结直肠癌的诊断和治疗提供新思路。

2.研究显示与正常对照相比，LINC02474在结直肠癌患者肿瘤组织显著上调，本发明提出的生物标志物具有较高的准确性。

3.本发明的结果表明干扰LINC02474可以抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力，表明LINC02474在结直肠癌的发生发展中发挥促进癌基因的作用，为临床治疗结直肠癌提供了新的思路，有望获取患者更易接受、临床切实可行的诊断和治疗方案。

附图说明

图1为LINC02474在染色体上的位置示意图。

图2为使用LINC02474特异性引物进行qRT-PCR后所得电泳的结果图。

图3为使用LINC02474特异性引物对结直肠癌患者组织表达量检测的结果图。*代表p值<0.05。其中，图3A为qRT-PCR结果图；图3B为受试者工作特征曲线。

图4为LINC02474小干扰RNA（siRNA）在DLD-1细胞系中转染敲减效率的qRT-PCR验证图。si-NC代表阴性对照组；si-LINC02474#1、si-LINC02474#2和si-LINC02474#3分别代表转染三种靶向LINC02474反向剪接位点的siRNA组。

图5为用siRNA干扰LINC02474表达后，结直肠癌细胞株DLD-1迁移与侵袭能力变化的结果图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

本实施例根据LINC02474在结直肠癌中的表达及其对结直肠癌生物学功能的调节作用的研究，提供了LINC02474在结直肠癌诊断方面的应用。

LINC02474相应的脱氧核糖核苷酸序列如下所示，其来源于人类的第1号染色体,位置如图1所示。

>NR_149071.1 Homo sapiens long intergenic non-protein coding RNA 2474 (LINC02474), long non-coding RNA

CCTCCTGCTCTTTGCTCCGTGAGAAAGATCCACCTACGACCTCAGGTCCTCAGACCGACTAGCCCAAGAAACATCTCACCAATTTCAAATCTGACCTTTGCAAGAGGGTCCGAGACATTTGCATCATCATTCAGTGAGACCTGTAAACACAGCATCTGCCTTTGACCACATCCATCTGGAAGAACCTGAGAGATAATCCATTTTATGAAATTTTCCCTACCCTGAAATGGGAGAATGAATCTAATTTGAAGCACTGAGAAGGATAAGGCATCCATTTGAAAAGGACTCCTATATTGCAACATGAATTCTGCTAAAATTGAAGCAAGAACAAACATCAAATTTATGATGAAGTTTGGGTAGAAGAACGATGAAATTAGTGACGCTTTATAAAAAGTTTATTGGGACAATACCCCAAATGAATCAGCAGTTTAAAAATGGATA。

本实施例从组织标本中选取了结直肠癌和癌旁正常组织各80例，Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA.USA)提取组织总RNA，反转录为cDNA,再通过qRT-PCR验证LINC02474在组织标本中的表达量，发现LINC02474在结直肠癌组织中表达显著上调。如图3所示。

通过采用实时荧光定量PCR的方法验证LINC02474在结直肠癌组织样本中的表达差异。

提取结直肠癌细胞系DLD-1中的总RNA，每份RNA的容量小于1ug，加入4ul 5XPrimeScript Buffer(for real time)，1ul PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ,1ul Oligo dT Primer，用RNase-free water将体系补足至20ul，37℃反应30min，85℃保持5s，将RNA逆转为cDNA并用前向及反向引物进行qRT-PCR，扩增转录本LINC02474。

1.实验材料与方法

临床样本收集：收集结直肠癌及对应的癌旁新鲜组织，样本收集标准为：（1）病理学检查确诊为结直肠癌；（2）未合并其他恶性肿瘤或疾病；（3）术前未接受任何放化疗等治疗；（4）将术后组织用预冷的PBS清洗组织表面残余的血液，在冰上分装，迅速置于液氮速冻30min，-80℃超低温冰箱中保存。

细胞系及细胞培养：人结直肠癌细胞系DLD-1，购自中国科学院上海生命科学研究院。结直肠癌细胞系DLD-1培养在含有10 %胎牛血清的DMEM培养基中，添加100U/ml青霉素链霉素混合液，在37℃含有5% CO2的环境中培养细胞。

RNA提取及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：采用Trizol提取组织的总RNA；采用RNA提取试剂盒fast2000提取细胞的总RNA。逆转录试剂盒采用PrimeScriptTM RT reagent Kit；实时荧光定量PCR试剂盒采用TB Green TM Premix Ex TaqTM II；采用CFX96实时荧光定量PCR仪器进行PCR反应；采用GAPDH作为内参；采用2^-ΔΔCt法计算RNA相对表达量；引物由济南博尚生物技术有限公司合成；引物序列见表1。

表1 qRT-PCR使用的引物序列

转染：靶向LINC02474反向剪接位点的特异性小干扰RNA（siRNA）及阴性对照（si-NC）由吉玛基因（上海）合成；利用Lipofectamine3000将80umol的siRNA转入结直肠癌细胞DLD-1中；siRNA序列见表2.干扰效率见图4。

表2 siRNA序列

将24孔池放入24孔板中。胰酶消化细胞，含有10%胎牛血清的培养基终止消化，并进行细胞计数，以8000个细胞/孔，取出相应的细胞数，800rpm室温离心5分钟，弃上清，用无血清培养基重悬。接种8000个细胞/200ul于24孔池中。下室加入含有20%胎牛血清的培养基。37℃，5% CO2的环境中培养24h后，弃上清及下室培养基，用棉签擦去上室中未发生转移的细胞，PBS洗两次，4%多聚甲醛固定1h。固定后，弃固定液，PBS洗两次，使用吉姆萨染液染小室2-4h。PBS洗两次，将小室孔膜割下，中性树胶固定。采用蔡司显微镜拍照。对细胞进行计数。

将24孔细胞池放入24孔板中。上室加入60ul 基质胶，置于37℃，5% CO2的环境1-2h，待凝胶凝固为胶冻状。胰酶消化细胞，用含有10%胎牛血清的培养基终止消化，并进行细胞计数，以10000个细胞/孔取出相应的细胞数，800rpm室温离心5分钟，弃上清，用无血清培养基重悬细胞。接种10000个细胞/200ul于24孔细胞池中。下室加入含有20%胎牛血清的培养基。37℃，5% CO2的环境中培养48h后，弃上清及下室培养基，用棉签擦去上室中未发生侵袭细胞，PBS洗两次，4%多聚甲醛固定1h。固定后，弃固定液，PBS洗两次，使用吉姆萨染液染小室2-4h。PBS洗两次，将小室孔膜割下，中性树胶固定。采用蔡司显微镜拍照。对细胞数进行计数。

统计分析：使用SPSS23.0软件对结果进行统计分析。使用GraphPad Prism7.0软件作图。根据情况采用t检验或者Wilcoxon符号秩和检验进行统计学分析。数据来自三次独立实验。数据以均数±标准差的形式表示，所有P值均为双侧，P＜0 .05被认为有统计学意义。

2. 实验结果：

如图1所示，LINC02474来源于1号染色体，图1显示了其位置。

如图2所示，根据LINC02474的序列设计特异性的引物，并应用上述引物对DLD-1细胞提取的cDNA进行扩增，结果显示该特异性引物能够扩增出产物。

如图3A所示，qRT-PCR结果显示，与正常组织相比，LINC02474在结直肠癌组织中表达显著上调。如图3B所示，受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)下面积（AUC）为0.6118，诊断效能较好。*代表p值<0.05。

如图4所示，转染LINC02474的siRNA后，能显著下调DLD-1细胞株中LINC02474的表达水平。

如图5所示，转染LINC02474的siRNA后，能显著抑制结直肠癌细胞系DLD-1的迁移侵袭能力。

上述结果表明LINC02474在结直肠癌组织中表达上调；体外实验显示LINC02474能促进结直肠癌细胞DLD-1的迁移和侵袭能力，表明LINC02474在结直肠癌中发挥促癌作用；LINC02474有望成为一种新的结直肠癌诊断生物标志物和治疗靶点。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> LINC02474作为结直肠癌诊断标志物和治疗靶点的应用

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctcctgctc tttgctccgt gagaaagatc cacctacgac ctcaggtcct cagaccgact 60

agcccaagaa acatctcacc aatttcaaat ctgacctttg caagagggtc cgagacattt 120

gcatcatcat tcagtgagac ctgtaaacac agcatctgcc tttgaccaca tccatctgga 180

agaacctgag agataatcca ttttatgaaa ttttccctac cctgaaatgg gagaatgaat 240

ctaatttgaa gcactgagaa ggataaggca tccatttgaa aaggactcct atattgcaac 300

atgaattctg ctaaaattga agcaagaaca aacatcaaat ttatgatgaa gtttgggtag 360

aagaacgatg aaattagtga cgctttataa aaagtttatt gggacaatac cccaaatgaa 420

tcagcagttt aaaaatggat a 441

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcaagaggg tccgagacat atgtggtcaa aggcagatgc t 41

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acccactcct ccacctttga ctgttgctgt agccaaattc gtt 43

<210> 4

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggguccgaga cauuugcaut taugcaaaug ucucggaccc ttgguagaag aacgaugaaa 60

uttauuucau cguucuucua cctt 84