新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒核酸快速检测试剂盒的制作方法

本发明涉及病毒检测技术，特别涉及用于新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒核酸的快速检测。
背景技术：
：新型冠状病毒属巢病毒目、冠状病毒科、正冠状病毒亚科，为单股正链RNA病毒，会引起新型冠状病毒肺炎，临床上表现为发热、乏力、干咳、腹泻等症状，并逐渐出现呼吸困难的现象，严重者会出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢酸性中毒和出凝血功能障碍，部分患者起病症状较轻，可无发热，多数患者预后良好，少数患者病情危重甚至死亡。新型冠状病毒的传染性强、潜伏期长(可至14天)、传播速度快、控制难度大。目前针对新型冠状病毒感染的肺炎确诊方法主要有两种：(1)实时荧光逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测新型冠状病毒核酸阳性；(2)病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。对新型冠状病毒的检测以核酸检测作为金标准，然后辅以血清学检测。测序法在疫情初期对病原体的鉴别起到了至关重要的作用，也为后续开展新型冠状病毒的基因扩增检测提供了基因组序列信息，但是测序法仪器昂贵、操作复杂、耗时长，且需要专业人员进行分析，无法在临床上大范围推广应用。等温扩增法适合快速检测，但是该技术具有引物设计要求高、不能扩增较长的目的片段、易产生假阳性等局限，同时检测通量较低，能否在临床上大范围应用还需进一步评估。酶联免疫吸附法灵敏度高，载体标准化难度较低，但检测速度慢、易污染、步骤较为繁琐。胶体金免疫层析法操作简单、检测速度快，适用于大规模的快速检测。化学发光法灵敏度高、特异性好且线性范围宽，但是该方法对仪器、操作及使用环境的要求较高，没有快速检测的优势。RT-qPCR技术具有灵敏度高、特异性好和操作简单的特点，相对适合在临床上大范围的推广应用。与血清学检测相比，核酸检测能够检测到处于窗口期或病毒载量低的患者，能及早发现感染者，对辅助确诊和进行大规模的人群筛查有重要意义，但普通RT-qPCR通常需要一个半小时，如能大幅缩短检测时间对于疫情防控具有重要意义。流行性感冒，简称流感，是一种由流感病毒(influenzavirus)感染引起的急性呼吸道传染病，具有高度的传染性，它的流行特点是在短期内突然发生，迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴发流行及散发，发病率高并伴有一定的死亡率。流感病毒有甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型极少引起流行。依据外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为17个H亚型(H1-H17)和10个N亚型(N1-N10)。由于编码HA和NA的核酸序列容易发生突变，致使HA和NA的抗原表位发生改变，这种抗原性的转变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。乙型流感病毒和丙型流感病毒的抗原很稳定，很少发生变异。乙型流感病毒分Yamagata(BY)及Victoria(BV)两个型别。流感病毒经空气飞沫传播，常引起发热、乏力、肌肉酸痛以及轻到中度的呼吸道症状，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸检测试剂可用于流感的辅助诊断，甲型流感病毒各亚型检测试剂还可用于区分季节性流感病毒和新型甲型流感病毒，并可获得关于流感爆发的流行病学信息。在新冠肺炎的典型症状和寻常的季节性流感症状里，像发烧、咳嗽、胸闷等，都十分相似。因此在临床上实现区分是非常有必要的。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒核酸快速检测试剂盒。为解决上述技术问题，本发明采用的解决方案是：提供一种新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒核酸快速检测试剂盒，该试剂盒中包括：(1)检测缓冲液；(2)引物探针混合液；该混合液中含有12条引物和探针，其序列如SEQIDNO：1～12所示；(3)混合酶液；(4)阳性质控品；该阳性质控品中含有新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒基因片段，以及作为内标的人源基因片段的装甲RNA；(5)阴性质控品；该阴性质控品中含有作为内标的人源基因片段的质粒；阳性质控品中的新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和人源基因片段的序列如SEQIDNO：13～16所示；阴性质控品中的人源基因片段的序列如SEQIDNO：17所示。本发明中，所述检测缓冲液中含有脱氧三磷酸核苷和镁离子，各自的浓度分别为5mM和0.3mM。本发明中，所述引物探针混合液中，各引物的浓度均为0.08μM，各探针的浓度均为0.04μM。本发明中，所述混合酶液中含有DNA聚合酶和逆转录酶，各自的添加量分别为2U和20U。本发明中，所述阳性质控品中，由新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和内标四种基因片段组成的装甲RNA浓度为1000000copies/mL。本发明中，所述阴性质控品中，人源内标基因片段的浓度为1000000copies/mL。本发明进一步提供了利用前述试剂盒同时检测新型冠状病毒和流感病毒核酸的快速检测方法，包括以下步骤：(1)准备扩增试剂：提取待检测的临床样本、阳性质控品和阴性质控品；(2)准备PCR反应液：将检测缓冲液、引物探针混合液和混合酶液置于冰上或在4℃条件下，融化后摇匀；然后按12.5μL∶6.3μL∶1.2μL的比例取检测缓冲液、引物探针混合液和混合酶液，加入离心管中，充分混匀、离心，得到PCR反应液，配置完毕后进行PCR反应液的分装，在每一个PCR反应孔加入20.0μLPCR反应液；(3)加样在装有PCR反应液的PCR反应孔中加入步骤(1)中提取的临床样本核酸、阳性质控品和阴性质控品，添加量为5.0μL/孔；(4)PCR反应将反应管放入荧光PCR检测仪中，循环参数设定如下：数据采集温度为58℃；各检测通道的荧光信号对应关系为：FAM-新型冠状病毒、VIC-乙型流感病毒、ROX-甲型流感病毒和CY5-人源基因片段；(3)结果描述及判定反应结束后，仪器自动保存结果；阴性质控品内标的CY5通道的Ct值≤35.00，FAM、VIC和ROX通道应为阴性；阳性质控品FAM、VIC、ROX和CY5通道的Ct值均≤35.00；以上条件需要在同一次试验中同时满足，否则认为PCR反应无效，需要重新进行检测；具体结果的判定方法如下表所示：样本中内标阴性而靶基因阳性，可直接报告为靶基因阳性，也可重新取样进行检测；样本内标阴性而靶基因阴性，需要重新取样检测。发明原理描述：该试剂盒采用RT-PCR结合Taqman荧光探针技术对人咽拭子或痰液样本中新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒进行定性检测，可用于临床对新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒的辅助诊断。冠状病毒的分类主要以ORF1ab基因的序列为依据，因此本发明选取该基因保守性和特异性较高的区段设计引物探针，同时选取甲型流感病毒M1基因与乙型流感病毒NS1基因保守性和特异性高的区段设计引物探针，在检测是否为新冠感染的同时，能够确定是否是由于相似症状的甲、乙流病毒感染造成的，给予临床诊断双重的依据。在检测体系中加入了人源基因的检测作为内参，能够提示采样及核酸提取过程是否正常，避免因采样不合格或者核酸提取操作失误而引入的假阴性结果。本发明中的试剂盒采用快速RT-qPCR技术，能够做到不漏检、不多检，从而避免假阳性和假阴性的结果。同时，通过调整体系各组分和比例，实现快速检测的目的。该试剂盒采用RT-PCR结合Taqman荧光探针技术，通过各种调试筛选出适用快速检测的体系，在不降低单次检测通量的前提下，将常规RT-PCR检测时间由90分钟左右缩短至40分钟左右。在检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的同时加入甲型、乙型流感病毒的检测，在分辨是否为新冠感染的情况下，同时确定是否由具有相似症状甲、乙流病毒感染造成的，给予临床诊断双重的依据。本试剂适用于人咽拭子或痰液样本中新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒的定性检测，可用于临床对新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒的辅助诊断。本发明在检测体系中加入了人源基因的检测作为内参，能够提示采样及核酸提取过程是否正常，避免因采样不合格或者核酸提取操作失误而引入的假阴性结果。与现有技术相比，本发明的技术效果是：1、本发明中的试剂盒以人源内标来监控采样、提取和PCR扩增整个过程，能有效避免因采样或实验操作可能造成的假阴性。2、本发明采用新型冠状病毒和甲流病毒、乙流病毒的设计方案，在检测是否为新冠感染的同时能够确定是否是由于相似症状的甲、乙流病毒感染造成的，给予临床诊断双重的依据。3、本发明采用qRT-PCR的方法对新型冠状病毒以及甲型、乙型流感病毒进行检测，单次可以在40分钟左右完成最多94个检测，且灵敏度达500copies/mL，具有方便快捷、高灵敏的优势。附图说明图1为指数扩增图。图中a为扩增曲线，b为阈值线。图2为线性扩增图。具体实施方式下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述。本发明所述试剂盒主要是用于定性检测新型冠状病毒和甲型流感病毒、乙型流感病毒，并通过快速RT-qPCR技术来实现。1、阳性质控品和阴性质控品本发明的阳性质控品中含有新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和人源基因片段的装甲RNA，阴性质控品中含有作为内标的人源基因片段的质粒。所述阳性质控品中，新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和人源基因的基因片段的序列如SEQIDNO：13～16所示；阴性质控品中，人源基因片段的序列如SEQIDNO：17所示。含有阳性质控品和阴性质控品的装甲RNA和质粒由申请人设计，然后分别委托杭州浙大紫金生物科技有限公司和上海捷瑞生物工程有限公司制备合成。采用人源基因作为内标，能够提示采样及核酸提取过程是否正常，避免因采样不合格或者核酸提取操作失误而引入的假阴性结果。2、引物探针的设计冠状病毒的分类主要以ORF1ab基因的序列为依据，因此选取该基因保守性和特异性较高的区段设计引物探针，同时选取甲型流感病毒M1基因与乙型流感病毒NS1基因保守性和特异性高的区段设计引物探针。各引物探针序列如下所示：序列编号引物、探针名称引物、探针的序列SEQIDNO：1ORF-F5’-GCCGCTATAACAATACTAGATGG-3’SEQIDNO：2ORF-R5’-AGTGCCAAAGATGTTAGTTAGC-3’SEQIDNO：3ORF-P-FAMFAM-5’-CTGCGAAGTCAACTGAACAAC-3’-BHQ1SEQIDNO：4IFB-F5’-TTCTATTTATGAATCCGTCTGC-3’SEQIDNO：5IFB-R5’-TATGTCATCAAGGCACCTCC-3’SEQIDNO：6IFB-P-VICVIC-5’-TCCTCAGAGAGCAACTGTCCGA-3’-BHQ1SEQIDNO：7IFA-F5’-CCCCTCAAAGCCGAGAT-3’SEQIDNO：8IFA-R5’-CGTCTACGCTGCAGTCC-3’SEQIDNO：9IFA-P-ROXROX-5’-ACGCTCACCGTGCCCAGTG-3’-BHQ2SEQIDNO：10IC-F5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’SEQIDNO：11IC-R5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’SEQIDNO：12IC-P-CY5CY5-5’-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3’-BHQ2上述SEQIDNO：1～12所示引物、探针的作用分别是：1～3用于扩增新型冠状病毒ORF1ab基因靶序列；4～6用于扩增乙型流感病毒NS1基因靶序列；7～9用于扩增甲型流感病毒M1基因靶序列；10～12用于扩增人源GAPDH基因靶序列；3、试剂盒的组成4、试剂盒的应用示例4.1扩增试剂准备(PCR前准备期)采用核酸提取试剂或纯化试剂(备案号：苏泰械备20180181号)提取核酸，备用。需要处理的样本种类包括：①临床样本：待检测的临床样本；②阳性质控品：试剂盒内阳性质控品(nCBA)；③阴性质控品：试剂盒内阴性质控品(nCBA)。4.2反应体系准备(PCRⅠ室)从试剂盒中取出检测缓冲液(nCBA)、引物探针(nCBA)和混合酶液(nCBA)，在冰上或4℃融化后，将所有组分轻微摇晃混匀并低速简短离心。每一反应均按照以下比例配制反应体系：试剂检测缓冲液(nCBA)引物探针(nCBA)混合酶液(nCBA)用量12.5μL6.3μL1.2μL计算好各试剂使用量，加入适当体积离心管中，充分混匀，简短离心。PCR反应液的总量应满足的人份数包括：临床样本的个数、1个阳性质控品和1个阴性质控品。PCR反应液配置完毕，进行PCR反应液的分装，在每一个PCR反应孔加入20.0μLPCR反应液，分装完毕，转移至PCRⅡ室。4.3加样(PCRⅡ室)在装有PCR反应液的PCR反应孔中加入已制备好的核酸，每一份核酸的添加量是5.0μL/孔。4.4PCR反应(检测区)将反应管放入荧光PCR检测仪中，循环参数设定如下：荧光信号的收集定为FAM(2019-nCoV)、VIC(乙型流感病毒)、ROX(甲型流感病毒)和CY5(内标)，数据的采集定在58℃。以采用ABI7500仪器为例，将“Quencher”一栏设置为“none”，“passivereference”一栏选为“none”，将每孔反应体积设置为25μL。4.5检验结果的描述及判定反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值和Threshold值(可自行调节，Start值可以在3-15之间，End值位于5-20之间)。阴性质控品内标的CY5通道的Ct值≤35.00，FAM、VIC和ROX通道的Ct值应为阴性；阳性质控品FAM、VIC、ROX和CY5通道的Ct值均≤35.00。以上条件需要在同一次试验中同时满足，否则认为PCR反应无效，需要重新进行检测。具体结果判定如下表所示：样本中内标阴性而靶基因阳性，可直接报告为靶基因阳性，也可重新取样进行检测；样本内标阴性而靶基因阴性，需重新取样检测。4.6试剂盒检测的扩增图及分析示例。图1为本发明实施例临床待检测样本检测结果的指数扩增曲线示意图；其中，a为扩增曲线，分别为4个通道的扩增曲线，分别标记为新型冠状病毒ORF1ab、甲型流感病毒M1、乙型流感病毒NS1和内标；b为阈值线，即图中的水平线；a线与相应b线的交点分别为4条扩增曲线的Ct值。图2为本发明实施例临床待检测样本检测结果的线性扩增曲线示意图，分别标记为新型冠状病毒ORF1ab、甲型流感病毒M1、乙型流感病毒NS1和内标。从上述示例可以看到，应用本发明提供的试剂盒，实现单管检测新型冠状病毒的ORF1ab基因、甲型流感病毒的M1基因和乙型流感病毒的NS1基因和人源基因，能够在分辨是否为新冠感染的情况下进一步确定是否是由于相似症状的甲、乙流病毒感染造成的。同时，在经过优化后的反应缓冲液和酶的作用下，检测时间缩短至40min左右，在保证不降低通量的情况下快速得到检测结果。序列表<110>江苏默乐生物科技股份有限公司<120>新型冠状病毒和甲型、乙型流感病毒核酸快速检测试剂盒<160>17<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>1gccgctataacaatactagatgg23<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>2agtgccaaagatgttagttagc22<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>3ctgcgaagtcaactgaacaac21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>4ttctatttatgaatccgtctgc22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>5tatgtcatcaaggcacctcc20<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>6tcctcagagagcaactgtccga22<210>7<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>7cccctcaaagccgagat17<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>8cgtctacgctgcagtcc17<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>9acgctcaccgtgcccagtg19<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>10gaaggtgaaggtcggagt18<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>11gaagatggtgatgggatttc20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>12caagcttcccgttctcagcc20<210>13<211>240<212>RNA<213>新型冠状病毒(Novelcoronaviruspneumonia)<400>13ucaaaauucugugcguguuuuacagaaggccgcuauaacaauacuagauggaauuucaca60guauucacugagacucauugaugcuaugauguucacaucugauuugucuacuaacaaucu120aguuguaauggccuacauuacaggugguguuguucaguugacuucgcaguggcuaacuaa180caucuuuggcacuguuuaugaaaaacucaaacccguccuugauuggcuugaagagaaguu240<210>14<211>240<212>RNA<213>甲型流感病毒(InfluenzaAvirus)<400>14uauguucucucuaucguuccaucaggcccccucaaagccgagaucgcacagagacuugaa60gaugucuuugcugggaaaaacacagaucuugaggcucucauggaauggcuaaagacaaga120ccaauucugucaccuuugacuaaggggauuuuaggguuuguuuucacgcucaccgugccc180agugagcgaggacugcagcguagacgcuuuguccaaaaugcccucaaugggaauggagac240<210>15<211>240<212>RNA<213>乙型流感病毒(InfluenzaBvirus)<400>15augaccacaacacaaauugagguggguccgggagcaaccaaugccaccauaaacuucgaa60gcaggaauucuggagugcuaugaaagacuuucauggcaaagggcccuugacuacccuggu120caagaccgucuaaacagacuaaagaggaaauuagagucaagaauaaagacccacaacaaa180agugagccugaaaguaaaagaaugucucuugaagagagaaaagcaauuggaguaaaaaug240<210>16<211>360<212>RNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>16gcucucugcuccuccuguucgacagucagccgcaucuucuuuugcgucgccagccgagcc60acaucgcucagacaccauggggaaggugaaggucggagucaacggauuuggucguauugg120gcgccuggucaccagggcugcuuuuaacucugguaaaguggauauuguugccaucaauga180ccccuucauugaccucaacuacaugguuuacauguuccaauaugauuccacccauggcaa240auuccauggcaccgucaaggcugagaacgggaagcuugucaucaauggaaaucccaucac300caucuuccaggagcgagaucccuccaaaaucaaguggggcgaugcuggcgcugaguacgu360<210>17<211>360<212>DNA<213>人工序列(Artificialsequence)<400>17gctctctgctcctcctgttcgacagtcagccgcatcttcttttgcgtcgccagccgagcc60acatcgctcagacaccatggggaaggtgaaggtcggagtcaacggatttggtcgtattgg120gcgcctggtcaccagggctgcttttaactctggtaaagtggatattgttgccatcaatga180ccccttcattgacctcaactacatggtttacatgttccaatatgattccacccatggcaa240attccatggcaccgtcaaggctgagaacgggaagcttgtcatcaatggaaatcccatcac300catcttccaggagcgagatccctccaaaatcaagtggggcgatgctggcgctgagtacgt360当前第1页1 2 3