一种具有疏水特性的固定化乳糖酶及其应用于制备乳果糖的方法与流程

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种具有疏水特性的固定化乳糖酶及其应用于制备乳果糖的方法。

背景技术：

乳果糖（c12h22o11，4-o-β-d-吡喃半乳糖基-d-果糖）是由半乳糖和果糖以β-1,4-糖苷键结合形成的一种功能性低聚糖。乳果糖不能被人体代谢分解，在人体小肠内无法被吸收，进入结肠后能被双歧杆菌产生的β-半乳糖苷酶分解而成为双歧杆菌增殖的碳源，从而促进人体肠道有益菌的增殖，抑制有害菌的生长，对便秘、腹泻、肠炎等肠道菌群失调患者均有着较好的疗效，因此又被称为“双歧杆菌增殖因子”。其作为功能因子除被用于健康食品（保健品、食品添加剂、动物饲料、以及婴幼儿奶粉等）领域外，乳果糖还可以用于医药领域，尤其是用于治疗便秘和肝性脑病等。目前世界上100多个国家将乳果糖纳入药典，并被列入“世界卫生组织基本药物标准清单”（worldhealthorganizationmodellistofessentialmedicines），是人体系统所必须的重要药物之一。

乳果糖的制备分为化学法和酶法，化学法是目前常用的工业乳果糖制备手段，但是存在副产物多、转化率低、安全性有待提高等问题。酶法制备乳果糖是目前研究热点，而在目前已经报道的乳果糖制备用酶中，只有乳糖酶已经实现商业化，其他包括高效的纤维二糖差向异构酶等，均处于实验室阶段，尚不具备大规模工业化应用。乳糖酶同时具有水解活性和转糖苷活性，在果糖存在的情况下，能够催化乳糖生成乳果糖。但是乳糖酶过高的水解活性不利于乳果糖的生成，一方面，过高的水解活力会使得乳糖在短时间内彻底水解成半乳糖和葡萄糖；另一方面，乳糖酶的水解活力同样会作用于生成的乳果糖，从而降低乳果糖的得率。目前有报道采用水相-有机相的双相体系来控制乳糖酶催化体系的水分活度，进而抑制乳糖酶的水解活力，促进其转糖苷活力，进而提高乳果糖得率。如2008年费颖等以磁性壳聚糖纳米微球固定化的乳糖酶和商业化的固定化葡萄糖异构酶为催化剂，在环己烷-水相（95%：5%，v/v）体系中催化乳糖制备乳果糖，最佳条件下乳果糖的得率达到18.9%，含量为151g/l，是单一水相体系中乳果糖得率的近3倍（见费颖.磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其在乳果糖制备中的应用[d]:[硕士学位论文].无锡，江南大学食品学院，2008）。但是有机相的使用存在一定的安全隐患，对反应器的需求较高，且实验中所使用的乳糖溶液接近饱和，容易结晶析出，不利于催化反应得进一步进行。

因此，提供一种无需借助有机相体系，即可实现对乳糖酶水解活性进行控制得策略，对工业化酶法制备乳果糖具有重要的应用价值。

技术实现要素：

为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种具有疏水特性的固定化乳糖酶及其应用于制备乳果糖的方法。

针对乳糖酶在催化乳糖制备乳果糖反应中，水解活性过高，不利于乳果糖生成的问题，本发明创新性地将乳糖酶固定到疏水性的载体上，并进一步对其进行表面的乳糖酶进行团聚，赋予制备的固定化乳糖酶一定的疏水特性，进而在反应体系中，为乳糖酶提供疏水微环境，进而在一定程度上抑制其水解活性，促进乳果糖的生成。

通过查阅文献，本发明通过固定化操作，赋予固定化乳糖酶一定的疏水特性，目前尚无文献报道，同时以制备的具有一定疏水特性的固定化乳糖酶为单一催化剂，高效催化乳糖制备乳果糖，这在国内外也尚属首次。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供一种具有疏水特性的固定化乳糖酶，所述固定化乳糖酶具有疏水性，其疏水性是通过疏水固定化操作而获得。

作为本发明的一种优选技术方案，所述疏水固定化操作包括以下步骤：

s1、乳糖酶和疏水性载体通过乳糖酶表面的羧基与载体表面的氨基反应，将乳糖酶结合到具有疏水性载体的表面；

s2、向上述体系中缓慢加入硫酸铵粉末引发酶蛋白的聚集，使得整个体系的硫酸铵达到60-90%的饱和度；

s3、加入戊二醛溶液，对聚集的酶蛋白以及酶蛋白与载体表面的氨基进一步交联；

s4、收集固定化乳糖酶，真空冷冻干燥后备用。

作为本发明的一种优选技术方案，乳糖酶，其cas编号为casnumber:9031-11-2，包括但不限于目前市售的乳糖酶溶液或者粉末产品，诸如：dsm公司的maxilact®系列乳糖酶、以及诺维信公司的lactozym®系列乳糖酶等。

作为本发明的一种优选技术方案，所述疏水性载体的表面含有氨基基团，具有一定的疏水特性，包括但不限于目前市面上已有的氨基类树脂，诸如duolitea568、d380等。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤s2在2-10℃条件下加入硫酸铵粉末。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤s3在室温条件下进一步交联，交联时间为0.5-5h。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤s3中戊二醛的浓度为0.05-0.5%（v/v）。

作为本发明的一种优选技术方案，本发明还提供一种具有疏水特性的固定化乳糖酶应用于制备乳果糖的方法，包括以下步骤：

q1、乳糖酶的疏水固定化，制备成具有疏水性的固定化乳糖酶；

q2、以具有疏水性的固定化乳糖酶为生物催化剂，在果糖存在的条件下，催化乳糖制备乳果糖。

作为本发明的一种优选技术方案，乳糖包括但不限于目前市售的乳糖粉、一水合乳糖、以及乳清粉等，乳糖含量为100-400g/l，果糖的含量为100-800g/l。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤q2中催化反应为分批催化反应或连续柱色谱催化反应。

本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：

（1）本发明采用酶法制备乳果糖，与目前工业化的化学催化法相比，具有反应条件温和[反应温度30-45℃，ph为中性至微酸性环境（ph3.5-7.0）]，不会产生高碱性废水，无需酸化中和操作，不会对环境造成污染，同时对设备耗损小。此外，副反应小，产品色泽澄清透明，几乎不产生色素等有害副产物，无需后续脱色脱盐等复杂操作，安全性更高。

（2）与游离酶相比，固定化乳糖酶热稳定性更高，操作稳定性更强，更易于回收利用，使得生产过程中乳糖酶的成本显著下降。并且，固定化乳糖酶更好分离，有效简化了反应产物的提纯。

（3）通过固定化操作赋予固定化乳糖酶一定的疏水特性，通过物理手段，达到控制乳糖酶水解活性的目的，从而促进反应体系中，乳糖酶的转糖苷活力，显著增强乳果糖的生成率。且无需使用有机相，安全高效。

（4）相比较于游离乳糖酶，固定化乳糖酶显著提高了转糖苷活力，不仅提高了乳果糖的得率，同样也有利于将水解乳糖形成的半乳糖转化为对人体有益的低聚半乳糖gos。

附图说明

图1是本发明制备具有疏水特性的固定化乳糖酶操作示意图；

图2是本发明制备得到的固定化乳糖酶电镜图。

图3是本发明使用游离乳糖酶催化乳糖制备乳果糖最终反应产物的hplc谱图。

图4是本发明使用固定化乳糖酶催化乳糖制备乳果糖最终反应产物的hplc图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：固定化乳糖酶

以市售的帝斯曼公司的maxilact^®乳糖酶为例，将其加入到ph6.8的磷酸盐缓冲液中，酶蛋白浓度为2.5mg/ml，同时加入市售的氨基树脂（以dow公司的duolitea568氨基树脂为例），树脂加入量为0.5mg/ml，在4℃下反应12h，然后缓慢加入研磨的硫酸铵粉末至其饱和度达到70%，4℃下继续搅拌30min，然后加入戊二醛溶液（市售产品，25%，v/v）至整个体系中戊二醛浓度为0.5%（v/v），4℃下缓慢搅拌4h，然后过滤收集固定化乳糖酶颗粒，并使用ph6.8的磷酸盐缓冲液对收集的固定化乳糖酶颗粒洗涤3遍，然后进行冷冻干燥。固定化乳糖酶的操作示意图如图1所示，经冷冻干燥后获得的固定化乳糖酶颗粒的电镜图如图2所示。乳糖酶的活力测定按照国标gb/t33409-2016进行，其中测定的游离酶酶活约为5000u/g，制备得到的固定化乳糖酶的酶活按照同样的测定方法，酶活约为800u/g。

实施例2：固定化乳糖酶催化乳糖制备乳果糖

向ph6.8的磷酸盐缓冲液中加入250g乳糖和250g的果糖，搅拌溶解（可采用加热辅助溶解），配制2份（a和b）各1l的最终乳糖和果糖含量均为250g/l的反应底物溶液，向a中加入2ml的游离乳糖酶为催化剂，向b中加入5g固定化乳糖酶为催化剂，在37℃下，搅拌反应6h，各取1ml反应液，在沸水浴中灭酶5min，稀释至适当的倍数，然后使用高效液相检测反应液体系中各类糖的组成和含量。所得到的hplc图谱如下图３和图４所示，经分析可知，使用游离酶的ａ组，其最终乳果糖含量为46.18g/l，其中包括38.65g/l的1-乳果糖和7.53g/l的4-乳果糖，总转化率为18.5%，而采用具有疏水特性的固定化乳糖酶的b组，其乳果糖的含量达到83.9g/l，其中包括66.81g/l的1-乳果糖和17.09g/l的4-乳果糖，乳果糖总转化率达到33.6%，转化率是游离酶的近2倍，且固定化乳糖酶后续可以连续循环使用，具有显著的应用前景。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。