一种重组木聚糖酶及其应用

文档序号：24622616发布日期：2021-04-09 20:28阅读：419来源：国知局

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组木聚糖酶及其应用。

背景技术：

农业废弃物含有丰富的纤维素和半纤维素，木聚糖是植物半纤维素的主要组成部分，其含量仅次于纤维素，为第二大可再生资源，但未得到有效的开发及利用，造成我国农业发展面临着农业废弃物排放量大、环境污染严重等突出问题。充分利用农业废弃物中木聚糖有助于缓解环境、生态和能源问题，并增加农业废物的附加值。

木聚糖酶（endo-1,4-β-d-木聚糖酶，ec3.2.1.8）是一类水解酶，可水解木聚糖的β-1,4-连接的糖苷键以产生高附加值的产品，例如木寡糖（xos）和木糖（x1）。工业上利用木聚糖酶生产高附加值低聚木糖，要求酶具有耐热性、耐酸碱、高酶活、低聚木糖（以木二糖和木三糖为主）产率高等特性。目前对gh11木聚糖酶耐热性和耐酸碱性研究较多，但酶催化底物生成特异性水解产物-低聚木糖（主要是木二糖和木三糖）相关研究较少，且水解特异性机制不清楚，而gh11木聚糖酶利用低附加值的农业废弃物生产高附加值的低聚木糖，关键在于其水解特异性机制的研究。类似于n端改造可以引起g11木聚糖酶水解产物改变，c端对g11木聚糖酶水解特异性也存在一定的影响。li等报道了来自嗜热裸节菌f1208木聚糖酶（t-xyn）用序列fptgnttelekrqttp(1-16)替换aftvgngq并结合位于c末端193位丝氨酸替换苯丙氨酸的策略，产生杂合酶t-xynfm，其具有特殊水解特性：以木三糖（x3）、木四糖（x4）和木五糖（x5）为底物时，木糖均未被检出。t-xynfm水解木聚糖（桦木、榉木和燕麦木聚糖）时，产物中木糖生成量比t-xyn低，最大减少量约为90.22%（燕麦木聚糖）。t-xynfm水解木三糖的产物中出现木四糖，其生成量多于60%，表明t-xynfm具有较强的转糖苷酶活性，该活性对生产低聚木糖具有较强的吸引力。li等从酸性木聚糖酶pjxyn引入二硫键构建突变体pjxyns(27)s(186)，以桦木、榉木和燕麦木聚糖为底物，与野生型pjxyn比，水解产物含有更多木糖和木二糖，分别为87.62%（榉木木聚糖）和69.91%（燕麦木聚糖）。由此可知，通过对木聚糖酶进行点突变可能会改变酶水解特性。

技术实现要素：

针对木聚糖酶在工业应用中存在的问题，本发明提供一种高效水解木聚糖的工程菌，诱导表达的木聚糖酶水解效率高，ph稳定性好，在酸性条件下ph耐受性增强。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种木聚糖酶，其氨基酸序列为seqidno:1-3所示；其中seqidno:2为seqidno:1所示序列121位精氨酸突变为丙氨酸，seqidno:3为seqidno:1所示序列179位的酪氨酸突变为丙氨酸。

优选的，编码上述木聚糖酶氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno:4-6所示。

一种包含编码上述氨基酸的核苷酸序列的载体或工程菌。

一种上述工程菌在制备木聚糖酶中的应用。

一种上述木聚糖酶在制备低聚木糖中的应用。

本发明具有以下优点：

本发明提供了一种基因改造的木聚糖酶及生产该酶的工程菌。通过对特殊位点的改造，提高了木聚糖酶水解各种木聚糖的效率，且ph稳定性好，耐酸性增强，在工业上具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为xyna、xyna179和xyna121基因pcr产物1%琼脂糖电泳图；

图2为xyna、xyna179和xyna121粗酶液和纯化酶液的sds-page电泳图；

图3为xyna、xyna179和xyna121酶的最适ph和ph稳定性；

图4为xyna对不同木聚糖的水解特性；

图5为xyna121对不同木聚糖的水解特性；

图6为xyna179对不同木聚糖的水解特性。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1重组酶xyna功能域突变体的构建

1.木聚糖酶xyna基因的获得

将源于streptomycerocheil2001g11木聚糖酶xyna基因切除信号肽序列，获得如seqidno:1所示的目的基因，将其连接入载体pmd18-t，转染e.colidh-5α，获得的阳性菌进行-80℃保存。

提取e.colidh-5α中含有xyna目的片段的质粒，将其作为pcr反应中的模板，以加酶切位点的引物1s11f2/1s11r1（见表1）进行pcr扩增，获得含酶切位点目的基因片段xyna。

表1带酶切位点羧肽酶基因克隆引物序列（下划线部分为酶切位点）

。

2.xyna突变体目的基因的获得

对木聚糖酶xyna121位点和179位点分别进行突变，将121位、179位的碳长链精氨酸、较大侧链的酪氨酸均突变为丙氨酸，获得突变酶xyna121和xyna179。采用重叠延伸pcr技术进行目的基因扩增，带有酶切位点的引物见表2，下划线部分为突变位点。

表2重叠延伸pcr引物序列

获得的pcr产物进行1%琼脂糖电泳，如图1所示，1-4泳道为xyna179，5-8泳道为xyna121，9-12泳道为xyna，将测序正确的pcr产物保存，备用。

3.重组质粒的构建

将目的基因xyna、xyna121、xyna179及表达载体pet-28a分别以ncoi和xhoi进行双酶切，之后用t4dna连接酶分别进行连接，获得带有目的片段的重组质粒pet-28a-xyna、pet-28a-xyna121、pet-28a-xyna179。

4.重组工程菌的获得

将构建好的重组质粒pet-28a-xyna、pet-28a-xyna121、pet-28a-xyna179分别转染感受态细胞e.colide3，随机挑取lb抗性筛选平板中的克隆子进行菌落pcr验证，产物测序验证，将验证正确的pet-28a-xyna/e.colide3及突变体重组菌甘油管保藏。

实施例2xyna、xyna121、xyna179的诱导表达、纯化

1.xyna、突变酶xyna121、xyna179粗酶液的获得

将实施例1中获得的重组菌液分别接种于含有40μg/mlkan⁺的5mllb液体培养基，37℃200r/min培养12h。然后以1%的接种量将活化后菌液转接至含40μg/mlkan⁺的100mllb液体培养基中，37℃2000r/min培养至od600值达0.6-0.8，再加入iptg至终浓度为0.5mmol/l，20℃200r/min振荡培养14-16h进行诱导表达。将发酵液于10000rpm、4℃离心5min，收集菌体。采用10ml0.05mol/lph6.0的柠檬酸钠缓冲液重悬菌体，超声破壁15min后10000r/min、4℃离心5min，所得上清液即为粗酶液。

2.xyna、xyna121、xyna179的纯化

重组木聚糖酶带有组氨酸标签能与金属离子ni²⁺特异性结合，咪唑也对ni²⁺具有结合作用，二者形成竞争性关系。因此，采用ni柱（nisepharosehpcolumn，1×10cm）及äktafplc蛋白纯化系统对重组木聚糖酶进行纯化。

（1）柱平衡：选用平衡缓冲液（bindingbuffer）冲柱，直至基线平稳；

（2）上样：将已过0.22μm水系膜样品先注入收集管中暂时储存样品，待柱平衡自动上样；

（3）除杂与洗脱：用平衡缓冲液冲洗层析柱，去除非特异性结合的蛋白，采用含不同咪唑浓度的洗脱缓冲液对重组蛋白进行梯度洗脱，同时检测a280值，收集洗脱峰处的液体，即纯化酶液，置于4℃保藏。

取10μg粗酶液和纯化的酶液进行sds-page聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，分离胶浓度为12.5%（w/v），浓缩胶浓度为4.5%（w/v）。

经过sds-page电泳检测，如图2所示，其中，1、2泳道为xyna粗酶液和纯化酶液，3、4泳道为xyna179粗酶液和纯化酶液，5、6泳道为xyna121粗酶液和纯化酶液。由图可知，粗酶液在20kda左右有较粗的蛋白条带，与预测蛋白量20.8kda接近，表明xyna和xyna179、xyna121成功表达；且纯化的酶液蛋白目的条带单一，成功获得了电泳纯的酶液，适于用于酶学性质的研究。

实施例3xyna、xyna121和xyna179的最适ph和ph稳定性

测定ph对酶活力的影响，选择ph3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9.0的（50mm）缓冲液：柠檬酸盐缓冲液ph3.0-6.5、巴比妥钠缓冲液ph7.0-9.0，在37℃条件下测定酶活。最高的木聚糖酶活性定义为100％，计算在不同ph下的相对酶活力，绘制相对酶活力随ph值的变化曲线，如图3a（xyna121）和图3b（xyna179）所示。

测定酶的ph稳定性，将酶置于上述测定的不同ph缓冲液中保温，即37℃保温30min，冰水浴30min后，于37℃、最适ph条件下测定残余酶活。以未经保温处理的酶测定的酶活定义为100%，计算残余酶活力，绘制残余酶活力随ph值的变化曲线，如图3c（xyna121）和图3d（xyna179）所示。

由图3可知，突变酶xyna121与xyna最适反应ph相同为6.0，而突变酶xyna179的最适ph值相比原酶降低，更偏酸性，为4.5。突变酶xyna121和xyna179在ph3.0-5.0条件下，残余酶活均达到80%以上，是原酶的4-6倍，较原酶有大幅提高；在ph5.0-9.0的条件下，突变酶xyna121和xyna179与原酶残余酶活力变化趋势基本一致，均能保持80%以上。较原酶，xyna121的ph稳定性范围变广，而xyna121和xyna179在酸性条件下ph耐受性均增强。

实施例4xyna、xyna121、xyna179水解特性

1.xyna、xyna121、xyna179各酶的比活力

将采用bca蛋白浓度试剂盒，测定纯化前后未突变及突变的重组木聚糖酶的蛋白浓度。重组木聚糖酶的酶活力测定参照dns法。木聚糖酶酶活测定反应体系包括0.9ml相应缓冲液配制的1%（w/v）榉木木聚糖底物保温5min，加入0.1ml适当稀释的酶液，55℃反应10min。加入1mldns溶液终止反应，沸水浴15min，冷却并离心，加入1ml40%（w/v）四水合酒石酸钾钠溶液，540nm条件下测定吸光度值，采用木糖绘制标准曲线计算还原糖（以木糖计）的量。1个木聚糖酶活力单位（u）定义为：在上述实验条件下，每分钟水解木聚糖生成1μmol木糖所需要的酶量。

表3xyna、xyna121、xyna179纯酶液的比酶活

如表3所示，较原酶，突变酶xyna179、xyna121的比酶活降低。

2.xyna、xyna121、xyna179各酶的水解特性

分别以榉木木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖为底物进行水解反应，由于各酶在30℃下残余酶活可达到90%以上，故选择30℃作为水解温度。

为了表征木聚糖酶的水解，将含有500μl反应混合物，包括50mmph6.0的柠檬酸缓冲液配置的10mg/ml木聚糖底物和5u/ml木聚糖酶，30℃下150rpm孵育0、15min、30min、1h、2h、4h、8h，然后煮沸10min并在冰水浴中冷却并离心。离心液测定不同低聚木糖和木糖的含量：将离心液用0.22μm膜滤器过滤，采用watershplc对样品进行分析，色谱柱为ks-802，配有waters2695示差检测器(ri)。色谱条件为：柱温65℃，流动相为高纯水，流速为0.6ml/min，进样20min，进样量10μl。木糖（x1）、木二糖（x2）、木三糖（x3）、木四糖（x4）和木五糖（x5）溶液作为标准溶液。所有实验一式三份进行。以水解时间为横坐标，以水解产物浓度为纵坐标做图4（xyna）、图5（xyna121）和图6（xyna179），其中a为不同酶水解桦木木聚糖，b为不同酶水解榉木木聚糖，c为不同酶水解燕麦木聚糖。

通过比较图5和图4，木聚糖酶xyna121水解桦木和榉木木聚糖，主要产生了x2、x3、x4，水解8h时，其占比分别为38.1%、51.4%、10.5%和40.2%、52.2%、7.6%，较原酶其产物组成比例发生变化。以桦木木聚糖为底物，x2比例减少，x3和x4比例增加。水解8h，低聚木糖（x2+x3+x4+x5）总量达到2.20mg/ml，xyna121水解30min时，低聚木糖（x2+x3+x4+x5）产量达到2.07mg/ml，相当于原酶水解8h(2.10mg/ml)，因此，xyna121水解效率提高。以榉木木聚糖为底物，x2和x4占比降低，x3占比升高。水解8h，低聚木糖（x2+x3+x4+x5）总量达到2.81mg/ml，xyna121水解30min，其产量（2.36mg/ml）相当于原酶水解1h（2.38mg/ml）。由此可知，xyna121水解效率提高。以燕麦木聚糖为底物，主要产生了x2、x3、x4、x5。水解8h时，低聚木糖（x2+x3+x4+x5）总量（4.36mg/ml）较原酶（3.81mg/ml）增加了14%，xyna121水解2h，其产量（3.38mg/ml）相当于原酶水解4h（3.21mg/ml），由此可知，其水解效率较原酶明显提高，不仅体现在时间缩短，还有产量提高。

通过比较图6和图4，木聚糖酶xyna179水解桦木和榉木木聚糖，主要产生了x2、x3、x4。水解8h时，其占比为20.6%、61.1%、18.3%和19.7%、60.1%、20.2%，产生少量x1和x5，与原酶相比，水解产物的比例不同，x2比例明显下降，x3和x4比例明显上升，xyna179水解两种木聚糖水解产物及规律相似。以桦木木聚糖为底物，水解8h，低聚木糖（x2+x3+x4+x5）总量为1.33mg/ml，比原酶减少了37%，水解效率降低。以榉木木聚糖为底物，水解8h，x3达到1.04mg/ml，x4（0.35mg/ml）较原酶（0.23mg/ml）增加了50%，低聚木糖（x2+x3+x4+x5）总量（1.76mg/ml）比原酶（2.72mg/ml）减少了35%，水解效率降低。以燕麦木聚糖为底物，主要产生了x2、x3、x4、x5，产生少量x1。低聚木糖（x2+x3+x4+x5）总量（1.67mg/ml）比原酶（3.81mg/ml）减少了56%，水解更缓慢，水解效率显著降低。

这说明，通过对121位点和179位点的突变能够改变木聚糖降解产物的比例，相比于原酶，能够提高低聚木糖的比例，降低木糖比例，表现为突变酶的比酶活下降。对木聚糖酶xyna虽然都是进行了侧链较长或较大氨基酸替换成较小氨基酸的突变，但是突变位点对木聚糖酶的水解效率的影响却不同，相比于原酶，xyna179的水解效率降低，而xyna121的水解效率提高。

序列表

<110>北京工商大学

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