一种热稳定性提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体及应用的制作方法

技术领域：

本发明属于饲料生物技术领域，具体涉及一种多聚半乳糖醛酸酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术：
：

聚半乳糖醛酸酶(pgs)水解连接半乳糖醛酸残基的α-1,4-糖苷键，在果胶的降解中起到关键作用。其中真菌来源的pg具有很高的活性，通常在弱酸性ph值和30至50℃的最佳温度下具有最佳活性。但是由于其较低的热稳定性限制了其在食品以及饲料工业中的应用。那么开发一种新的耐高温的多聚半乳糖醛酸酶已迫在眉睫。目前，研究最广泛的是通过蛋白质工程对酶分子进行改造，以提高酶的热稳定性。通过合理设计改善蛋白质热稳定性的策略一般包括以下几方面：蛋白质表面电荷的优化，二硫键的引入，脯氨酸效应，蛋白质展开的自由能设计，温度因子(b因子)等策略。

本发明主要是通过在多聚半乳糖醛酸酶的结构中引入二硫键来达到提高酶热稳定性的目的，通过计算机对酶蛋白的三维结构进行解析，在不同的位点加入二硫键，发现在关键位点引入二硫键后显著提高了酶的热稳定性。

技术实现要素：
：

本发明的一个目的是提供一种以来源于talaromycesleycettanusjcm12802的多聚半乳糖醛酸酶作为母本，经点突变获得的突变体e247c/s276c。

本发明的再一目的是提供编码上述突变体的基因，如seqidno.3所示。

本发明的再一目的是提供上述突变体的氨基酸序列，如seqidno.2所示。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。

根据本发明的具体实施方式，对氨基酸序列如seqidno.1所示的野生型多聚半乳糖醛酸酶进行定点突变。

seqidno.1

mhtiqplltyglavgavlssaaptavekrasctftdaasamasktacstitlnniavpagttldltgltsgtrvifegtttfgyqewsgplvsisgtditvqgasgsvldgdgarwwdgqgsnggktkpkffyahsldsssitgitiknspvqvfsiqsnnlsltditvddadgdtqgghntdafdigsstyititnanvhnqddciavnsgeniiftggtctgghglsigsvggrsdntvknvtiehstvtnsqngvriktvygatgsvsevtysniqmsgitnygivieqdyengsptgtptngvpitdltlntvtgsvssgateiyilcgsgscsswtwtgvsitggskstkcenvpsgvsc

本发明将氨基酸序列如seqidno.1所示的野生型多聚半乳糖醛酸酶进行247和276位点的突变，分别将谷氨酸和丝氨酸突变为半胱氨酸，从而获得多聚半乳糖醛酸酶突变体e247c/s276c。

根据本发明的具有高热稳定性的多聚半乳糖醛酸酶突变体具有如seqidno.2所示的氨基酸序列，由365个氨基酸组成。

seqidno.2：

mhtiqplltyglavgavlssaaptavekrasctftdaasamasktacstitlnniavpagttldltgltsgtrvifegtttfgyqewsgplvsisgtditvqgasgsvldgdgarwwdgqgsnggktkpkffyahsldsssitgitiknspvqvfsiqsnnlsltditvddadgdtqgghntdafdigsstyititnanvhnqddciavnsgeniiftggtctgghglsigsvggrsdntvknvtichstvtnsqngvriktvygatgsvsevtycniqmsgitnygivieqdyengsptgtptngvpitdltlntvtgsvssgateiyilcgsgscsswtwtgvsitggskstkcenvpsgvsc

本发明还提供编码上述具有高热稳定性的多聚半乳糖醛酸酶突变体的基因，核苷酸序列如seqidno.3所示，共为1098bp(包含终止子)。

seqidno.3：

atgcatacgatccaacctcttctaacctatgggctggccgtgggagctgtcctttcctcagcggccccaactgctgtcgagaagcgtgccagctgcacctttaccgatgctgcttctgccatggcaagcaagacagcctgctcgactatcacgctgaacaacattgccgttcctgctgggaccaccttggacctgacgggcttgacatccggcaccagggtcatcttcgaaggaacaaccacctttggataccaggaatggagcggtcccctggtttctatctccggcaccgatattaccgttcagggtgcttcgggctccgtgcttgacggtgacggtgcccgctggtgggatggacagggcagcaatggcggcaagaccaagcccaagttcttctacgcccatagcttggactcttcgtccatcactggcattactatcaagaactcccctgttcaagtcttcagcatccagtccaacaatttgagcctgacggatatcaccgtcgatgacgccgatggcgacacccaaggcggccacaataccgacgcctttgatatcggtagctccacttatatcacgatcacgaacgctaatgttcacaatcaggatgactgcattgcagtcaactcaggggagaacatcatcttcactggcggcacctgcaccggcggccacggtctctccatcggctctgtcggcggccgctcagacaacaccgtcaagaacgtcaccatctgtcactccaccgtgaccaactcccagaatggcgtgcgtatcaagaccgtgtacggcgcgaccggctccgtctccgaagtcacttactgtaacatccaaatgtctggaatcacgaactatggcatcgtgatcgagcaggactacgagaacggcagcccaactggtaccccgacaaacggtgtccctattacagatctcactctcaatactgtgactggtagcgtttcgagtggtgctacggagatttacattctctgcggatctggaagctgctctagttggacttggacgggtgtttcaattactggtggctcgaagagcactaaatgtgagaatgtgccttctggagtttcttgctag

本发明还提供包含上述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组载体；

优选地，所述重组载体的表达载体具体为ppic9质粒。

本发明还提供包含上述多聚半乳糖醛酸酶突变体基因的重组菌株；

优选地，所述重组菌株采用的宿主为gs115。

本发明还提供制备具有高比活的多聚半乳糖醛酸酶的方法，以所述重组菌株为发酵菌株，发酵方法如下：

种子培养基：酵母粉1％-1.5％；蛋白胨1.8％-2％，葡萄糖1.7％-2％，ph5.0-5.5；

种子培养条件：培养温度：29℃-30℃，转速：200rpm-250rpm，培养时间：30h-34h；

发酵培养基：甘油3％-5％，磷酸一铵2％-3％，磷酸二氢钾0.1％-0.2％，硫酸镁2％-3％，硫酸钾0.8％-1.2％，硫酸钙0.1％-0.2％，氢氧化钾0.2％-0.4％，其余为水；

发酵培养条件：接种量：0.5-1％，培养温度：29℃-30℃，转速：200rpm-350rpm，培养时间：48h-50h。

本发明的多聚半乳糖醛酸酶突变体与野生型多聚半乳糖醛酸酶相比，多聚半乳糖醛酸酶热稳定性增强，70℃处理30min仍保留21.78％左右的活性，而野生酶活性已经消失。此外，野生型比活为50483u/mg，突变体的比活为46270u/mg。

本发明还提供上述具有高热稳定性的多聚半乳糖醛酸酶突变体的应用，具体可以应用于能源、食品和饲料领域中。

有益效果：

本发明克服了现有技术的不足，提供了一种高热稳定性的适合于在能源、食品和饲料等领域中应用的多聚半乳糖醛酸酶突变体。因此，本发明提供的多聚半乳糖醛酸酶突变体能很好的满足能源、食品和饲料等领域中的应用，有着非常广阔的应用前景。

附图说明：

图1是最适温度曲线图；

图2是温度稳定性曲线图。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明的表达宿主pichiapastorisgs115，表达质粒载体ppic9。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自invitrog公司。其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

大肠杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl，ph自然)；

毕赤酵母培养基ypd(yeastextract1％,trytone2％，glucose2％ph自然)；

bmgy(yeastextract1％,trytone2％,ynb10％,生物素0.1％,ph自然)；

bmmy(yeastextract1％，trytone2％，甲醇0.5％，ynb10％，生物素0.1％，ph自然)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1、重组菌株gs115(ppic9-pg3427)的制备

1.扩增多聚半乳糖醛酸酶野生型pg3427的核酸序列pg3427

采用pcr的方法扩增pg3427基因及载体ppic9核酸片段，通过重组试剂盒将两者连接，获得重组质粒ppic9-pg3427，并转化毕赤酵母gs115，获得重组毕赤酵母菌株gs115(ppic9-pg3427)。

pg3427野生型的基因序列如下(seqidno.4)：

atgcatacgatccaacctcttctaacctatgggctggccgtgggagctgtcctttcctcagcggccccaactgctgtcgagaagcgtgccagctgcacctttaccgatgctgcttctgccatggcaagcaagacagcctgctcgactatcacgctgaacaacattgccgttcctgctgggaccaccttggacctgacgggcttgacatccggcaccagggtcatcttcgaaggaacaaccacctttggataccaggaatggagcggtcccctggtttctatctccggcaccgatattaccgttcagggtgcttcgggctccgtgcttgacggtgacggtgcccgctggtgggatggacagggcagcaatggcggcaagaccaagcccaagttcttctacgcccatagcttggactcttcgtccatcactggcattactatcaagaactcccctgttcaagtcttcagcatccagtccaacaatttgagcctgacggatatcaccgtcgatgacgccgatggcgacacccaaggcggccacaataccgacgcctttgatatcggtagctccacttatatcacgatcacgaacgctaatgttcacaatcaggatgactgcattgcagtcaactcaggggagaacatcatcttcactggcggcacctgcaccggcggccacggtctctccatcggctctgtcggcggccgctcagacaacaccgtcaagaacgtcaccatcgagcactccaccgtgaccaactcccagaatggcgtgcgtatcaagaccgtgtacggcgcgaccggctccgtctccgaagtcacttactcaaacatccaaatgtctggaatcacgaactatggcatcgtgatcgagcaggactacgagaacggcagcccaactggtaccccgacaaacggtgtccctattacagatctcactctcaatactgtgactggtagcgtttcgagtggtgctacggagatttacattctctgcggatctggaagctgctctagttggacttggacgggtgtttcaattactggtggctcgaagagcactaaatgtgagaatgtgccttctggagtttcttgctag

pcr所用引物如下：

表1.野生型多聚半乳糖醛酸酶特异性引物

其中，pg3427-ppic9-f及pg3427-ppic9-r用于扩增多聚半乳糖醛酸酶野生型pg3427的基因编码序列；载体ppic9通过将保存的菌种接瓶培养后，提取得到。

扩增结束后，将pcr产物以及提取质粒进行核酸电泳检测，pg3427与载体ppic9条带大小分别为1098bp、8088bp，将载体用ecori和noti进行酶切后，将pcr产物与酶切产物分别回收纯化。

2.构建重组菌株gs115(ppic9-pg3427)

将回收的pg3427与ppic9基因片段通过试剂盒重组酶进行重组连接，然后将重组产物转化大肠杆菌transⅰ感受态，并涂布于lb(含100μg/mlampicillin)进行筛选。

待测序正确后，利用bglⅱ限制性内切酶将重组质粒ppic9-pg3427进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞gs115进行诱导表达，得到重组表达菌株gs115(ppic9-pg3427)。

实施例2、重组菌株gs115(ppic9-pg3427-e247c/s276c)的制备

1.重组质粒ppic9-pg3427-e247c/s276c的构建

经优化突变位点设计为分别将247和276位的谷氨酸和丝氨酸突变为半胱氨酸，通过点突变试剂盒的方法在质粒ppic9-pg3427上引入突变位点，并对其进行测序验证，获得多聚半乳糖醛酸酶突变质粒ppic9-pg3427-e247c/s276c。所用引物如表2所示：

表2.突变体多聚半乳糖醛酸酶特异性引物

其中，首先使用引物e247c-f和e247c-r构建突变质粒ppic9-pg3427-e247c，待测序正确后以此为模板，利用引物s276c-f和s276c-r构建突变质粒ppic9-pg3427-e247c/s276c。

2.构建重组菌株gs115(ppic9-pg3427-e247c/s276c)

利用bglⅱ将重组质粒ppic9-pg3427-e247c/s276c进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞gs115进行诱导表达，得到重组表达菌株gs115(ppic9-pg3427-e247c/s276c)。

实施例3、多聚半乳糖醛酸酶野生型pg3427及突变体e247c/s276c的获得

1.蛋白pg3427及e247c/s276c的诱导表达

将得到的重组表达菌株gs115(ppic9-pg3427)及gs115(ppic9-pg3427-e247c/s276c)接种至ypd培养基中进行种子培养，200rpm，30℃培养48h后，以1％接种量转接至bmgy培养基中，200rpm，30℃培养48h，富集足够的菌体后收集菌体并加入到含有1％甲醇的bmmy培养基中进行诱导表达。野生型比活为50483u/mg，突变体的比活为46270u/mg。

测定酶活的方法使用dns法，具体方法如下：在给定的ph、温度条件下，1ml的反应体系包括100μl适当的稀释酶液，900μl底物，反应10min，加入1.5mldns终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定od值。

1个酶活单位(u)定义为在给定的条件下，每分钟分解多聚半乳糖醛酸生成1μmold-(+)-半乳糖醛酸所需的酶量。

2.蛋白pg3427及e247c/s276c的纯化

将诱导表达后的菌液12000rpm,10min离心，收集上清进行浓缩，再用10mm磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调ph至6.5)进行透析，然后将透析后的酶液进行离子交换层析，a液为10mm磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调ph至6.5)，b液为a液加1mnacl，纯化蛋白，收集洗脱液，进行sds-page分析，在约40kda处有单一蛋白条带出现，高于酶蛋白理论分子量大小35.2kda。而在n糖基化预测分析时，发现e247c/s276c存在2个潜在糖基化位点。通过endoh脱糖基处理后，酶的分子量大小明显变小，与理论分子量一致。这表明酶蛋白的纯化效果达到了电泳纯，且经过毕赤酵母的高效表达后均有程度较高的糖基化修饰。

3.所述突变体和野生型的热稳定性的变化

对纯化后的突变体和野生型进行热稳定性测定，方法如下：所述突变体和野生型的热稳定性测定为在0.1mol/l柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ph3.5)缓冲液体系在60℃和70℃下处理不同时间(分别处理2、5、10、20和30min)，再在70℃下进行剩余酶活性测定。如图1所示，突变体和野生型的最适温度均为70℃，无明显差异。如图2所示，野生型在70℃下处理30min之后，剩余酶活仅剩余处理前的6.77％；而突变体在70℃下处理30min之后，剩余酶活相当于处理前的21.78％，较野生型提高幅度明显。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

sequencelisting

<110>山东隆科特酶制剂有限公司

<120>一种热稳定性提高的多聚半乳糖醛酸酶突变体及应用

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