[0001]
本发明涉及检测领域，更具体的涉及核酸筛选结合抗体检测用于癌症检测中的用途及其制备的试剂盒。
背景技术：
[0002]
肺癌是世界上发病率最高的肿瘤之一，占男性肿瘤发病率和死亡率首位，全世界肺癌的死亡率高达85%，严重威胁着患者的生命安全。肺癌早期症状通常较轻微，甚至可无任何不适，而一旦发觉往往是晚期，已错过了最佳的治疗时机，预后多因此不良。虽然随着近年来临床诊断技术与治疗技术不断改进与提高，肺癌诊断和治疗现状有所改善，主要从以下方面进行检测。
[0003]
ctcs是由原发肿瘤细胞脱落到循环血液中形成，它具有原发性肿瘤的特征，是潜在的生物标志物。ctcs可以作为疗效评测指标。在一项研究中，非小细胞肺癌(nsclc)放疗前检测了ctcs数量，随着放疗后肿瘤缩小，ctcs数量也减少，表明ctcs可以作为放疗疗效评测指标。ctcs也可作为预后指标。有研究报道，v期的ctcs数量高于ⅲ期患者，且治疗前较少ctcs的患者治疗后的总生存期和无进展生存期更长，表明ctcs是潜在的预后指标。ctcs作为活的肿瘤细胞实体，可提供突变和药物敏感性分析变化。其细胞的完整性可进行细胞水平的研究，从dna、rna、表观遗传学等方面提供信息。
[0004]
人体的血液中存在血浆游离dna(cfdna)，其中携带肿瘤特有突变信息的成为ctdna。ctdna来源于坏死的或者凋亡的肿瘤细胞。研究表明，ctdna可以用来重建肿瘤基因。qiu等指出，ctdna是表皮生长因子受体(egfr)基因突变状态检测中具有高特异性和有效性的生物标志物，ctdna的分析将是非小细胞肺癌的个性化癌症治疗的一个关键部分。nie等指出，许多基因的改变，如基因突变、杂合性缺失、微卫星不稳定性和基因甲基化，均可在非小细胞肺癌患者ctdna中发现。因此这些结果表明ctdna可以作为一个可行的工具来监测nsclc。研究表明，ctdna检测肿瘤变异比ctcs有更高的敏感性。目前ctdna被cfda推荐用于晚期nsclc中血浆egfr的检测。最近研究表明ctdna涵盖肿瘤整体突变信息，比局部组织活检更具有恶性整体表现。其携带某种肿瘤特异性突变或其他基因组改变信息，可用于早期筛查，表现为假阳性低，特异性好，可携带肿瘤细胞的体细胞突变。
[0005]
mirna是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码rna，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的mirna形成rna诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mrna，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mrna或者阻遏靶mrna的翻译。不同的mirna在不同肺癌类型中起不同的作用。有研究报道，在nsclc中起到致癌作用的有mir-21、mir-17／92、mir-31、mir-224等，在nsclc中起到抑癌作用的有let-7、mir34b。mir-25在小细胞肺癌(sclc)中起致癌作用，在sclc中起抑癌作用的有mir-34、mir138、mir-126。方楚玲等综述了mirna对肺癌化疗耐药的调控，提出：mirna与药物转运相关，如mir-495与顺铂药物敏感性增加有关；mirna与细胞损伤后自我修复能力有关，如mir-138与erccl的mrna结
合导致顺铂敏感性增加；mir—na调控细胞凋亡相关基因，如mir-135a与apc的mrna结合，导致紫杉醇耐受
¨
1；mirna与上皮细胞间质化有关，如mir200家族。在不同组织、不同发育阶段中mirna的水平有显著差异，这种mirna表达模式具有分化的位相性和时序性，提示mirna有可能作为参与调控基因表达的分子，因而具有重要意义。
[0006]
外泌体是细胞主动向胞外分泌的大小均一的囊泡样小体，具有抗肿瘤免疫，促血管新生等生理功能。不同类型的细胞可以释放出外泌体。外泌体包含脂类、蛋白质、mrna、mirna等。外泌体可以用来做早期诊断、预后判断、耐药评估。肿瘤来源的外泌体促进肿瘤细胞生长、转移和耐药。xiao等认为抑制外泌体的形成和释放可能是潜在的新的治疗肺癌的策略。rodriguez等分析了外泌体中不同的mirna。frydrychowicz等也认为认识外泌体和外泌体中的mirna可能是认识肺癌的关键，为肺癌治疗提供了新思路。外泌体能有效地保护核酸物质且稳定性好，克服ctdna容易被降解的问题，可以用做ctdna和mirna的补充分析。
[0007]
此前，虽然有研究表明stathmin基因是一种普遍存在于脊椎动物细胞中的胞质磷蛋白，具有高度保守、可溶性特性，并且通过免疫组化技术检测基因在非小细胞肺癌组织及正常肺组织的表达情况，发现stathmin基因在非小细胞肺癌组织中的表达显著上调，但是并没有针对其进行特异性检测方法的优化。
[0008]
虽然目前检测的手段较多，但是早期肺癌的诊断率依然仅有25%左右。探求有效的参考指标，因而寻求有效的检测方法为肺癌诊断变得极其必要。
技术实现要素：
[0009]
本发明克服现有技术的缺陷，提供一种能够协同增效的检测非小细胞肺癌的方法，所述方法包括通过核酸检测和抗体联合检测，二者组合使用能够高效的筛选非小细胞肺癌，具有时间短，成本低的效果。
[0010]
本发明一方面，提供一种针对stathmin基因设计的特异性适用于肺癌检测的引物对。
[0011]
具体的，所述引物对的上下游引物序列分别为seq id no：1所示和seq id no：2所示。
[0012]
本发明具体的提供一种快速检测非小细胞肺癌的试剂盒，所述试剂盒中含有seq id no：1所示和seq id no：2所述的检测引物对。
[0013]
本发明研究发现，在非小细胞肺癌组患者的血清中stathmin基因的相对表达量均大于2.0，而正常组的均没有超过1，因此，通过pcr快速筛选待测患者血液中stathmin基因的相对表达量可以达到初步筛查的目的。
[0014]
此外，本发明还针对非小细胞肺癌构建了特异性的检测用的单克隆抗体，所述抗体能够特异性的结合非小细胞肺癌细胞，适用于该细胞的特异性检测。
[0015]
本发明通过多组非小细胞肺癌细胞进行免疫，通过组合免疫，提高免疫抗体针对非小细胞肺癌的普适性，再通过阴性细胞反筛，获得能够特异性结合非小细胞肺癌的单克隆抗体。
[0016]
所述单克隆抗体具体的轻链可变区序列如seq id no：3所示，重链可变区如seq id no：4所示。或者是其90%同源性的可变区序列。
[0017]
在本发明的描述中，至少90％序列相似性应理解为包括至少95％，更优选至少
99％序列相似性。在这种情况下，“序列相似性”是基于同一性的程度与保守变化的程度的组合。“序列相似性”百分比是相同或保守改变的氨基酸或核苷酸的百分比，即“序列相似性”＝序列同一性百分比+保守变化百分比。因此，出于本发明的目的，“保守改变”和“同一性”被认为是广义的“相似性”的种类。因此，每当使用术语序列“相似性”时，它都包含序列“同一性”和“保守变化”。根据某些实施方案，保守变化不考虑在内，序列相似性百分比是指序列同一性百分比。在某些实施方案中，提到的序列同一性百分比所允许的序列内的变化都是或几乎都是保守性变化。也就是说，当一个序列90％相同时，其余10％都是或几乎都是保守变化。在本文中，术语“几乎都是”是指至少75％的允许序列改变是保守改变，更优选至少85％，还更优选至少90％，最优选至少95％。
[0018]
为了方便起见，本发明的抗非小细胞肺癌抗体或其抗原结合片段可以在试剂盒中提供，即，以预定量的试剂的包装组合与进行诊断或检测测定的说明一起提供。如果抗体或片段被酶标记，则试剂盒将包含酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，可以包括其他添加剂，例如稳定剂，缓冲液(例如封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛地变化以提供实质上优化测定的灵敏度的试剂溶液浓度。特别地，试剂可以无水粉末的形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。
[0019]
有益效果本发明提供一种能够协同增效的检测肺癌的方法，所述方法包括通过核酸检测和抗体联合检测，二者组合使用能够高效的筛选肺癌，具有时间短，成本低，见效快的效果，适用于医学上的快速筛选。
[0020]
附图说明
[0021]
图1 stathmin基因表达量图
具体实施方式
[0022]
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0023]
实施例1 stathmin基因的检测分别取非小细胞肺癌患者血清和正常人血液1ml，加入裂解液裂解后使用rna提取试剂盒(天根公司)抽提组织 rna，并用分光光度法测定其纯度与浓度。应用天根公司逆转录试剂盒逆转录成cdna。采用实时荧光定量prr法检测stathmin mrna。stathmin基因引物委托takara公司合成：具体的，扩增引物序列为：f1：5'-gagaaacgagagcacgagaa-3’,r1：5'-aaaatatttgtcaggaggga-3’；内参基因β-actin特异性pcr引物对：正向引物：5
’-
caccattggcaatgagcggttc-3’；反向引物：5
’-
aggtctttgcggatgtccacgt-3’；反应条件：95℃30s，95℃10s，62℃ 35s，72℃20s，
共4o个循环。每例标本均重复3次，取平均ct值，每次实验均设阴性对照，以超纯水代替cdna。非小细胞肺癌癌组织
△
ct值与正常组织的
△
ct值相比得出
△△
ct，计算目的基因的相对表达量，结果如图1所示。
[0024]
从图1可以看出，stathmin在肺癌患者血液中有明显增高，与正常对照组比较差异有统计学意义(p<0.05)。
[0025]
为了验证pcr检测的引物检测下限，将dna分别稀释100ng、10ng、1ng、0.1ng，0.01ng，0.001ng。结果发现，在0.01ng仍能够正常检测到该基因的表达。说明该引物的检测下限为0.01ng。
[0026]
实施例2 非小细胞肺癌特异性单克隆抗体的制备1、抗非小细胞肺癌单克隆抗体的制备用nci-h838人非小细胞肺癌细胞以5
×
106个/ml的浓度1ml与等量的弗氏完全佐剂颈部皮下多点注射免疫6～8周龄balb／c小鼠，10d后再用nci-h1650人非小细胞肺癌细胞以5
×
106个/ml的浓度1ml与等量的弗氏不完全佐剂颈部皮下多点注射加强免疫，10d后再以5
×
106个/ml的浓度的a549人非小细胞肺癌细胞1ml与等量的弗氏不完全佐剂混合注射免疫加强免疫。第3次免疫后1周断尾采血，取脾细胞与备用骨髓瘤细胞sp2/0融合。
[0027]
融合前l天，选取昆白系小鼠腹腔巨噬细胞做饲养层细胞，铺满96孔细胞培养板，待用。融合当天，取对数生长期的骨髓瘤细胞sp2/o，1000r/min离心5min，弃上清，用不完全培养液混悬细胞计数后，再用不完全培养液洗涤2次。用玻片刮取法制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。融合时，将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：8的数量比混合，将细胞悬液放置于50mi塑料离心管中，用不完全培养液洗1次，1200r／min离心8min，弃上清，用滴管吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略微松动。在室温下将骨髓瘤细胞与脾细胞进行融合：30s内加入预热的peg(分子质量4000)，边加边摇动，作用90s；添加预热的不完全培养液，终止peg作用，每隔2min依次加入1，2，3，4，5，10ml不完全培养液，8oor／min离心6min，弃上清，用约10ml含体积分数20小牛血清的rpmi1640轻轻混悬，将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板，100ul／孔，放置于37℃、体积分数5%co2孵箱中培养。
[0028]
阳性克隆的筛选与单抗杂交瘤细胞株的建立:融合后第3天半量更换培养液，每隔3d更换培养液1次，第10天前后更换为含ht的培养液培养。在骨髓瘤细胞与脾细胞融合后第5天出现小的克隆，第1o天杂交瘤细胞铺满孔底80%。第12天前后吸取少量上清液，用间接eiisa检测抗体效价，检测呈阳性的生长孔，再用hlf-a细胞和hepg2人肝癌细胞进行反筛，得到仅能够与非小细胞肺癌特异性结合的单克隆抗体细胞系。采用有限稀释法进行亚克隆，7～8d后，吸取少量杂交瘤细胞生长孔的上清液，对检测呈阳性的生长孔再次采用有限稀释法进行亚克隆，直至亚克隆杂交瘤细胞生长孔的上清液阳性率达到100%。获得了二株阳性反应最强的单克隆抗体分别命名为fa15和fa36。
[0029]
2、扩大培养与纯化腹腔分别单独注射抗人小细胞肺癌杂交瘤细胞fa15和fa36 1*106个/只，接种细胞10-12d后出现腹水，12号针头插入腹腔引流收集小鼠腹水持续数日。收集到的腹水采用辛酸硫酸钱法纯化。纯化方法如下:2500r/min离心腹水弃杂质，加入等体积的0.06mol/l ph4.0 naac-hac缓冲液，调ph至4.8；加入1/33体积的辛酸，室温搅拌35min，4℃搅拌60min，逐滴加完，4℃澄清2h，4℃ 15000r/min离心30min，去除白蛋白和其他非igg蛋白，上清加入1/10体
积的10*pbs（0.01mol/l，ph7.4），调ph至7.2；上清滴加等量饱和硫酸铵（ph7.2-7.4）溶液，使硫酸铵的饱和度为50%，继续搅拌10-30min，静置30min ；4℃，10000r/min离心30min，弃上清，将沉淀溶于1.2 ml，0.01mol/l，ph7.4 pbs中;4℃，0.01mol/l，ph7.4pbs透析过夜，其间换液3次，收集透析袋内液体，即为纯化后的腹水单抗，一20℃冻存备用并取少量通过sds-page检测其纯度发现，二个抗体的纯度都达到了95%以上，其中fa15的浓度达到了5.9mg/ml，fa36的浓度达到了6.6mg/ml。
[0030]
实施例3 fa36单抗免疫球蛋白的类别和亚类的鉴定采用sigma公司鼠单克隆抗体分类试剂盒鉴定单抗ig类和亚类，对比不同二抗作用下的显色结果，以是否显色判定单抗所属类别和亚类。结果如表1所示。
[0031]
表1 杂交瘤细胞亚型鉴定从表1的亚型鉴定显示，fa36 这个单抗杂交瘤细胞株分泌的抗非小细胞肺癌的单克隆抗体，属于igg2b亚型。
[0032]
实施例4 fa36单抗特异性鉴定流式细胞仪检测：用胰酶消化nci-h838人非小细胞肺癌细胞、nci-h1650人非小细胞肺癌细胞、a549人非小细胞肺癌细胞、hlf-a细胞和hepg2人肝癌细胞并调整细胞浓度至3
×
104个／ml；每管100ul细胞悬液，加入纯化后的单抗20ul，室温反应0.5 h后加入fitc标记的羊抗鼠二抗，洗涤3遍后，用流式细胞仪检测，免疫鼠血清为阳性对照，pbs为空白对照。结果如表2所示。
[0033]
表2 细胞结合率（%）从表2的流式细胞仪检测结果可以看出，fa36单抗与三种非小细胞肺癌细胞呈阳性反应，结合率在95％以上，而不与其他的非肺癌细胞结合，具有较好的特异性。
[0034]
实施例5 fa36单抗亲和力的测定采用非竞争elisa法测定亲和常数(ka)，包被时用碳酸盐缓冲液稀释包被原非小细胞
肺癌细胞至浓度为1.0、0.1、0.05、0.01mg/ml，将fa36单抗以100ug/ml开始倍比稀释，分别加入4个包被原浓度，其他步骤同单抗效价的测定。测定波长为450nm处的吸光度值。按下列公式计算ka，ka=(n-1)／2(n ab
’-
ab)式中：ab为抗原浓度为ag时，产生半数吸光度值的抗体浓度；ab’为抗原浓度为ag’时，产生半数吸光度值的抗体浓度；rl为ag和ag’之间的稀释倍。结果显示，亲和常数ka为2.9
×
109l／mol。
[0035]
实施例6 fa36单抗的序列鉴定以杂交瘤cdna为模板，分别以单抗的标准引物进行抗体重链和轻链的可变区基因的克隆。得到抗体的轻链可变区序列为（seq id no：3）：divitqspalaaaspgeketitcsvmqlisyyylawyqqksgispkpwiyytsnliggvparfsgsgsgtsysltitsmeaedaatyycarwsgtplafgagtklelk重链可变区序列为（seq id no：4）：evqleesgtelarrgasvklsckasgyifsaswaywikqrpgqglewiggaypgdgdtryglkfqgkatltadkssstaymqlsslasedsavyycaganleedswglgttlavss实施例7 fa36单抗的免疫组化反应检测及pcr组合检测免疫组织化学检测：将30例非小细胞肺癌标本，其中男20例，女10例。年龄32-74岁，平均(48
±
3.6)岁。所有标本均经临床及病理检查确诊，符合国际uicc肿瘤分期标准。另10例为正常肺组织标本(正常组)，其中男5例，女5例。年龄37-67岁，平均(51
±
3.1)岁。两组间性别、年龄构成无明显差异(p>0.05)，具有可比性。将组织标本用石蜡包埋存档，切片厚度为5μm，使用fa36单抗进行免疫组化操作操作。细胞显色部位呈深棕色为强阳性(+++)，棕色为中度阳性(++)，浅棕色为弱阳性(+)，不着色或呈浅黄色为阴性(-)。pbs为空白对照，正常小鼠血清为阴性对照。具体的fa36单抗与非小细胞肺癌组织和正常组织的免疫组化反应结果见表1。
[0036]
表3 fa36单抗与非小细胞肺癌组织和正常组织的免疫组化反应结果由表1可见，fa36单抗在非小细胞肺癌组织和良性组织中的表达有显著差异(p<0.o1)。fa36单抗的反应部位也主要位于癌细胞胞膜。
[0037]
将上述20例非小细胞肺癌组患者的血液和正常组的血液，分别采用实施例1的pcr检测方法进行检测，结果发现，20例非小细胞肺癌组患者的血清中stathmin基因的相对表达量均大于2.0，而正常组的均没有超过1，因此，通过pcr快速筛选待测患者血液中stathmin基因的相对表达量可以达到初步筛查的目的。
[0038]
综上分析，本发明的试剂盒，能够准确检测非小细胞肺癌，为使用者提供了简便的判断是否需要就医的标准。方便了用户使用。