一种数字环介导等温扩增的方法与流程

[0001]
本发明涉及一种核酸扩增方法，尤其是一种数字环介导等温扩增的方法。


背景技术：

[0002]
核酸扩增技术是基因工程学上非常重要的方法，其中最成熟的方法为聚合酶链式反应(pcr)，最广泛的方法为荧光定量pcr(quantitative pcr，qpcr)，可应用于传染病(细菌与病毒)诊断、基因测序等方面，但是该方法在定量痕量核酸(<100个拷贝)时，因为其灵敏度不足导致重复性不好，因此难以准确定量，且核酸扩增技术需要温度循环升降，因此实验成本高，耗时长。
[0003]
20世纪末，vogelstein等提出数字pcr(digital pcr，dpcr)的概念，dpcr是新一代核酸分子定量技术，也被称为第三代pcr，其基本原理是通过将pcr反应溶液分散至数万至数十万个微小反应单元，pcr扩增后对每个反应单元进行pcr终点检测，根据泊松分布统计计算样本中靶标核酸分子的绝对数量。相比于目前临床应用的qpcr，dpcr的优势包括：一、灵敏度高，理论上可以实现单分子核酸检测；二、对样品绝对定量，不需要标准曲线；三、重复性好，扩增效率的变化不影响定量结果；四、对pcr抑制剂不敏感，可适应难以完全纯化的生物核酸样本。但目前dpcr的仪器价格昂贵(100万人民币以上)，自动化程度低，且操作复杂，仅在少数实验室普及，同时难以应用在即时诊断。
[0004]
近年来，核酸等温扩增技术由于不需要像聚合酶链式反应(pcr)一样进行温度循环，因此得到迅猛发展，显现出广阔的应用前景。核酸等温扩增技术主要包括重组酶聚合酶扩增(rpa)、滚环扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、依赖核酸序列的扩增技术(nasba)、杂交链反应技术(hcr)等。其中lamp由于其灵敏度高，特异性、重复性好，受到最广泛的关注。lamp是日本学者notomi在2000年发明的一种等温扩增技术，通过2-3对引物(fip/bip，f3/b3，lf/lb)在60-65摄氏度下对目标dna进行特异性扩增，但是lamp的灵敏度、稳定性较聚合酶链式反应(pcr)的灵敏度、稳定性低，因此在检测痕量核酸时仍然会存在灵敏度不足的问题，实验结果容易产生假阳性，定量不准确；有研究提出一种数字环介导等温扩增(dlamp)可有效解决lamp灵敏度不足的问题，但是dlamp也存在一定的弊端，例如lamp指数扩增的前提条件需要3对引物依次与模板及级次产物dna结合(结合顺序依次是1.fip/f3，2.bip/b3，3.lf/lb)，而各引物在反应体系中随机与模板结合，因此在进行dlamp反应时，每个反应单元的起始扩增时间具有很大随机性，很多单元在反应时间内无法成功扩增，所以dlamp最终定量结果往往比实际模板浓度低，具有严重的假阴性现象。
[0005]
因此，亟需优化出一种扩增效率高、提高检测真实阳性率、测定定量结果更准确的数字环介导等温扩增的方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种数字环介导等温扩增的方法，反应速度和扩增效率明显提高，将靶基因模板dna与三组引物组合预杂交，再进
行环介导等温扩增，其中第一组引物组合不仅可以提高lamp的扩增效率，还可以提高dlamp检测真实阳性率大约8倍；通过单独对正向外引物f3和反向外引物b3浓度进行优化后，可以提高dlamp的检测真实阳性率大约1.5倍。
[0007]
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0008]
一种数字环介导等温扩增的方法，包括以下步骤：以三组引物组合分别对靶基因模板dna进行预杂交，第一组引物组合为正向内引物fip和反向内引物bip，第二组引物组合为正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3和反向外引物b3，第三组引物组合为正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb，再进行环介导等温扩增。
[0009]
本发明人创造性地将靶基因模板dna与三组引物组合预杂交，发现可以提高环介导等温扩增(lamp)扩增效率，尤其以第一组引物组合提高扩增效率效果显著，同时提高了数字环介导等温扩增(dlamp)检测真实阳性率约8倍，测定定量结果更为准确。
[0010]
作为本发明所述数字环介导等温扩增的方法的优选实施方式，所述正向外引物f3和反向外引物b3的浓度为2～200nm。
[0011]
作为本发明所述数字环介导等温扩增的方法的优选实施方式，所述正向外引物f3和反向外引物b3的浓度为2～20nm。
[0012]
在实验过程中，本发明人意外的发现将正向外引物f3和反向外引物b3的浓度进行优化后，能够有效提高dlamp检测真实阳性率约1.5倍，将靶基因模板dna与三组引物组合预杂交配合优化正向外引物f3和反向外引物b3浓度，dlamp的检测真实阳性率能够提高大约10倍，大大提高了检测真实阳性率，该方法还可以应用dlamp定量双链dna浓度。
[0013]
作为本发明所述数字环介导等温扩增的方法的优选实施方式，所述正向环引物lf和反向环引物lb的浓度为400～800nm。
[0014]
作为本发明所述数字环介导等温扩增的方法的优选实施方式，所述正向环引物lf和反向环引物lb的浓度为800nm。
[0015]
在本发明的技术方案中，在不同浓度正向环引物lf和反向环引物lb存在下，第一组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交(preheat)后的扩增效率显然比对照组(预杂交前)的扩增效率高，且当正向环引物lf和反向环引物lb的浓度为800nm时，环介导等温扩增的扩增效果最好。
[0016]
作为本发明所述数字环介导等温扩增的方法的优选实施方式，所述第一组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交的步骤包括：将正向内引物fip和反向内引物bip与靶基因模板dna在环介导等温扩增体系中混合，正向内引物fip和反向内引物bip同时与靶基因模板dna结合，加热至90～95℃，反应2～5min，靶基因模板dna充分变性，然后冷却至室温，反应2～5min。
[0017]
作为本发明所述数字环介导等温扩增的方法的优选实施方式，所述第二组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交的步骤包括：将正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3和反向外引物b3与靶基因模板dna在环介导等温扩增体系中混合，正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3和反向外引物b3同时与靶基因模板dna结合，加热至90～95℃，反应2～5min，靶基因模板dna充分变性，然后冷却至室温，反应2～5min。
[0018]
作为本发明所述数字环介导等温扩增的方法的优选实施方式，所述第三组引物组
合对靶基因模板dna进行预杂交的步骤包括：将正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb与靶基因模板dna在环介导等温扩增体系中混合，正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb同时与靶基因模板dna结合，加热至90～95℃，反应2～5min，靶基因模板dna充分变性，然后冷却至室温，反应2～5min。
[0019]
在以上发明技术方案中，本发明采用的预杂交的目的是使靶基因模板与特定的引物提前结合，该过程不发生扩增反应，不存在引物结合顺序，所有预杂交使用的引物同时与靶基因模板结合。
[0020]
作为本发明所述数字环介导等温扩增的方法的优选实施方式，上述加热温度为92℃。
[0021]
作为本发明所述数字环介导等温扩增的方法的优选实施方式，所述三组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交后，环介导等温扩增的步骤为：在链置换dna聚合酶的作用下，加入环介导等温扩增所需的正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb，将预杂交得到的序列在温度为60-65℃恒温扩增，反应30～60min。
[0022]
与现有技术相比，本发明提供的数字环介导等温扩增效率的方法，显著地提高了环介导等温扩增(lamp)扩增效率，同时提高了数字环介导等温扩增(dlamp)检测真实阳性率，为应用于dlamp定量检测双链dna浓度发挥重要作用。
附图说明
[0023]
图1为环介导等温扩增(lamp)扩增反应步骤示意图；
[0024]
图2a为不同浓度正向环引物lf和反向环引物lb存在下，第一组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交(preheat)前后扩增效率对比图；
[0025]
图2b为三组引物组合分别与靶基因模板dna杂交后的扩增效率结果对比图；
[0026]
图2c为第一组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交前提下，正向外引物f3和反向外引物b3浓度优化后对扩增效率的影响示意图；
[0027]
图2d为第一组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交，以及正向外引物f3和反向外引物b3浓度优化前后进行环介导等温扩增产物实时荧光对比示意图；
[0028]
图3为800nm浓度的正向环引物lf和反向环引物lb存在下，第一组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交(preheat)前后扩增结果对比图。
具体实施方式
[0029]
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
[0030]
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。
[0031]
在以下实施例中，本发明采用的靶基因模板dna可以为hpv-16或hpv-18。
[0032]
其中当靶基因模板dna为hpv-16 dna(序列如seqidno.1所示)时，针对该靶基因模板dna采用primerexplorer v3.0设计出四种引物(包括正向内引物fip、反向内引物bip、正
向外引物f3、反向外引物b3)以及两种环引物(正向环引物lf和反向环引物lb)(序列分别如如seqidno.3-seqidno.8所示)，其序列如下：
[0033][0034]
其中当靶基因模板dna为hpv-18dna(序列如seqidno.2所示)时，设计出的正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3以及正向环引物lf和反向环引物lb(序列分别如seqidno.9-seqidno.14所示)，其序列如下：
[0035][0036]
实施例1
[0037]
一种数字环介导等温扩增的方法，以三组引物组合分别对hpv-16 dna进行预杂交，第一组引物组合为正向内引物fip和反向内引物bip，第二组引物组合为正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3和反向外引物b3，第三组引物组合为正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb，再进行环介导等温扩增；
[0038]
所述第一组引物组合对hpv-16 dna进行预杂交的具体步骤为：
[0039]
将正向内引物fip和反向内引物bip与靶基因模板dna在环介导等温扩增体系中混合，正向内引物fip和反向内引物bip同时与hpv-16 dna结合，加热至92℃，反应2min，hpv-16 dna充分变性，然后冷却至室温，反应2min，正向内引物fip和反向内引物bip此时与hpv-16 dna完成预杂交。
[0040]
其中环介导等温扩增步骤为：
[0041]
1)反应体系的体积为25μl，其中的成分为：1μl hpv-16 dna，20mm tris-hcl(ph8.8),10mm(nh4)2so4，0.1％triton x-100，0.8m甜菜碱，8mm mgso4，1.4mm dntps，8u链置换dna聚合酶(bst 2.0warmstart dna polymerase)，40pmol fip，40pmol bip，20nmf3，20nmb3，20pmol lf和20pmol lb，最后用双蒸水定容。
[0042]
2)反应程序：将步骤1)制备的混合物置于温度为65℃恒温反应60min。
[0043]
实施例2
[0044]
一种数字环介导等温扩增的方法，以三组引物组合分别对hpv-16 dna进行预杂交，再进行环介导等温扩增；
[0045]
所述第二组引物组合对hpv-16 dna进行预杂交的具体步骤为：
[0046]
将正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3和反向外引物b3与靶基因模板dna在环介导等温扩增体系中混合，正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3和反向外引物b3同时与hpv-16 dna结合，加热至92℃，反应5min，hpv-16 dna充分变性，然后冷却至室温，反应2min，正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3和反向外引物b3此时与hpv-16 dna完成预杂交。
[0047]
其中环介导等温扩增步骤为：
[0048]
1)反应体系的体积为25μl，其中的成分为：1μl hpv-16 dna，20mm tris-hcl(ph8.8)，10mm(nh4)2so4，0.1％triton x-100，0.8m甜菜碱，8mm mgso4，1.4mm dntps，8u链置换dna聚合酶(bst 2.0warmstart dna polymerase)，40pmol fip，40pmol bip，20nmf3，20nmb3，20pmol lf和20pmol lb最后用双蒸水定容。
[0049]
2)反应程序：将步骤1)制备的混合物置于温度为65℃恒温反应60min。
[0050]
实施例3
[0051]
与实施例1的区别在于，反应体系成分中f3浓度为200nm和b3浓度为200nm。
[0052]
实施例4
[0053]
与实施例1的区别在于，反应体系成分中f3浓度为2nm和b3浓度为2nm。
[0054]
实施例5
[0055]
一种数字环介导等温扩增的方法，以三组引物组合分别对hpv-16 dna进行预杂交，再进行环介导等温扩增；
[0056]
所述第三组引物组合对hpv-16 dna进行预杂交的具体步骤为：
[0057]
将正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb与hpv-16 dna在环介导等温扩增体系中混合，正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb同时与hpv-16 dna结合，加热至92℃，反应2min，靶基因模板dna充分变性，然后冷却至室温，反应2min，正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3、正向环引物lf和反向环引物lb此时与hpv-16 dna完成预杂交。
[0058]
其中环介导等温扩增步骤为：
[0059]
1)反应体系的体积为25μl，其中的成分为：1μl hpv-16 dna，20mm tris-hcl(ph8.8)，10mm(nh4)2so4，0.1％triton x-100，0.8m甜菜碱，8mm mgso4，1.4mm dntps，8u链置换dna聚合酶(bst 2.0warmstart dna polymerase)，40pmol fip，40pmol bip，20nm f3，20nm b3，20pmol lf和20pmol lb，最后用双蒸水定容。
[0060]
2)反应程序：将步骤1)制备的混合物置于温度为65℃恒温反应60min。
[0061]
试验例一、对比扩增效率和真实阳性率
[0062]
1.将正向环引物lf和反向环引物lb的浓度分别设置成400nm、800nm，在不同浓度正向环引物lf和反向环引物lb的存在下，按照实施例1的方法将第一组引物组合对hpv-16 dna进行预杂交作为实验组，将第一组引物组合直接按照实施例1中的环介导等温扩增步骤进行处理(不进行预杂交步骤)，作为对照组，通过定量dlamp中含有荧光信号的反应单元数
量来测定dlamp的扩增效率。
[0063]
参考图2a，在不同浓度正向环引物lf和反向环引物lb存在下，第一组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交(preheat)后的扩增效率显然比对照组(预杂交前)的扩增效率高(图3)，且当正向环引物lf和反向环引物lb的浓度为800nm时，环介导等温扩增的扩增效果最好。
[0064]
2.将实施例1、实施例2及实施例5分别采用三组引物组合对hpv-16 dna进行预杂交，再进行环介导等温扩增反应，通过定量dlamp中含有荧光信号的反应单元数量来测定dlamp的扩增效率。
[0065]
参考图2b，结果发现，提前让三组引物组合分别和靶基因模板dna进行预杂交，可以大幅提高环介导等温扩增的扩增效率和提高dlamp的阳性率，其中以第一组引物和靶基因模板dna进行预杂交提高dlamp的阳性率效果最佳。
[0066]
3.采用实施例1中的方法将第一组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交后，比较实施例1、实施例3及实施例4改变正向外引物f3和反向外引物b3浓度后对扩增效率的影响。
[0067]
参考图2c，结果发现，当正向外引物f3和反向外引物b3浓度为20nm时，环介导等温扩增的扩增效率最大，而实施例3中采用正向外引物f3和反向外引物b3浓度为200nm时环介导等温扩增的扩增效率最小，说明正向外引物f3和反向外引物b3浓度不是任意可以选择的，是经过大量实验测试而得。
[0068]
本发明人意外发现在相同的反应条件下，正向外引物f3和反向外引物b3的浓度为2-20nm能够有效提高dlamp检测真实阳性率约1.5倍，配合hpv-16dna与正向内引物fip、反向内引物bip预杂交可以大幅提高dlamp中含有荧光信号的反应单元数量，使得dlamp的检测真实阳性率能够提高大约10倍(通过对比dlamp最后的定量结果，定量结果越大阳性率越高)。
[0069]
4.采用实施例1中的方法将第一组引物组合对靶基因模板dna进行预杂交后，采用正向外引物f3和反向外引物b3的浓度为200nm时为优化前对照组，正向外引物f3和反向外引物b3的浓度为2-20nm为优化后实验组，观察优化前后正向外引物f3和反向外引物b3的浓度对扩增效率的影响。
[0070]
参考图2d，结果显示，优化前和优化后的相对荧光单位(rfu)在同一时间下，优化后的相对荧光单位(rfu)更高，扩增效率更快，说明当正向外引物f3和反向外引物b3的浓度为2-20nm时，可以有效提高环介导等温扩增的扩增效率。
[0071]
当靶基因模板dna采用hpv-18dna时，也采用上述实施例1-5的数字环介导等温扩增的方法，其扩增效率和检验真实阳性率与靶基因模板dna采用hpv-16 dna效果类似。
[0072]
其中lamp扩增反应的原理如下步骤所示：
[0073]
s1.在温度为65℃条件下，靶基因模板双链dna解链，fip引物中的f2基因序列与靶基因模板dna 3’端的f2c基因序列结合，在dna聚合酶的作用下往靶基因模板dna的5’端合成新链i；
[0074]
s2.f3引物与靶基因模板dna 3’端的f3c基因序列结合合成新链ii，同时新链ii替换步骤s1合成的新链i；
[0075]
s3.bip引物中的b2基因序列与新链i 3’端中的b2c结合，合成新链iii；
[0076]
s4.b3引物与新链i 3’端中的b3c结合，合成新链vi，新链vi置换出新链ⅲ，将置换
出来的新链ⅲ进行环介导等温扩增，新链ⅲ3’、5’端分别为3
’-
f1-f2c-f1c，b1-b2-b1c-5’。新链ⅲ可与fip/bip引物或lf/lb引物结合进行扩增，参考图1。
[0077]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。