用于环介导的等温扩增的具有与内部胞嘧啶结合的单个荧光团标记物的核酸探针的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于LAMP检测方法中的新型探针。所述探针包含与探针的内部胞嘧啶残基结合的单个荧光团标记物。所述探针在患者衣原体和淋病感染的检测中特别有用。
【专利说明】用于环介导的等温扩増的具有与内部胞嘧啶结合的单个荧光 团标记物的核酸探针
[0001] 本发明涉及用于检测核酸的探针，使用所述探针的方法和试剂盒。优选地，本发明 的探针用于检测源自沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis)和/或淋病奈瑟氏菌 (Neisseria gonorrhoeae)的核酸的方法中，并且可以用于衣原体和/或淋病感染的诊断 中。
[0002] 核酸扩增是生命科学领域，包括诸如临床医学的应用型领域中最有价值的工具之 一，其中传染病、遗传病症和遗传性状的诊断尤其受益。除了广泛使用的基于PCR的检测之 外（Saiki R.K.,Scharf,S.,Faloona,F.,Mullis,K.B.,Horn,G.T.,Erlich,H.A.and Arnheim，N.(1985)Science，230,1350-1354)，已经发明了数种扩增方法。实例包括核酸序 列依赖性扩增(NASBA)、自我持续序列复制（3SR)和环介导等温扩增(LAMPhPCR利用双链 DNA产物的热变性来促进下一轮DNA合成。3SR和NASBA通过使用一组转录和逆转录反应排除 了热变性来扩增靶序列。
[0003] 这些方法能够将靶核酸扩增至相似的量级，所有的方法都具有10个拷贝以下和大 约一小时之内的检测限。由于靶序列选择的特异性较差，它们需要用于扩增的精密仪器和 用于检测扩增产物的精细方法。尽管扩增的简易性和可获得的量级，但是在PCR中需要高精 度热循环仪阻止了这种强大方法的广泛应用，例如在私人诊所中作为常规的诊断工具。相 比之下，LAMP是能够在等温条件下以更高的特异性在一小时以内将少量的DNA拷贝扩增至 100个拷贝以上的方法。
[0004] 与上文提及的其它基于分子探针的技术一样，环介导等温扩增(LAMP)测定可用于 检测样品中特定微生物的存在。然而，检测方法是基于直接的目视检测、浊度或通过非特异 性DNA嵌入染料。直接的目测是终点测量，且不能提供实时分析。浊度和非特异性嵌入染料 确实提供了所发生的扩增的实时分析，但是其是非特异性的，即所有扩增都被检测到，无论 其是真正的阳性扩增，还是由于错误引发、交叉特异性的错误扩增。
[0005] 根据本发明的第一方面，提供了用于等温核酸扩增的探针，其包含与靶核酸序列 的区域互补的寡核苷酸探针序列，其中所述寡核苷酸探针序列仅具有一个荧光团配体，并 且所述配体与内部胞嘧啶碱基结合，以及其中所述寡核苷酸探针序列不具有3 '端终止子。
[0006] 在优选的实施方案中，寡核苷酸探针序列是DNA序列，并且靶核酸序列是DNA序列。
[0007] 优选地，荧光增加表明样品中靶核酸的存在。
[0008] 优选地，胞嘧啶碱基基本位于寡核苷酸长度的中心。存在与胞嘧啶碱基内部标记 探针相关的特别益处。在等温反应中扩增的DNA产物的特异性可以使用熔解曲线分析来验 证。然而，由于在该反应中生成大量的产物变体和熔解曲线分析的低分辨率，使用嵌入染料 如V13很难分辨等温条件下生成的特异性DNA产物和非特异性DNA产物。由于BST聚合酶的链 置换活性，常用的探针如TaqMan?探针与LAMP技术不兼容。本发明的探针是延长的，并且 在等温扩增过程中并入DNA产物，其允许对生成的产物进行熔解曲线分析。在本发明的探针 中，将荧光团缀合到与反义链中鸟嘌呤互补的内部胞嘧啶。鸟嘌呤影响许多荧光团的激发 态，导致形成独特的熔解曲线标签，并允许分辨等温条件下生成的特异性产物和非特异性 产物。
[0009]寡核苷酸在其能够将标记的寡核苷酸并入扩增子的3'端不含ddNTP。因此，探针的 3'端未被"封闭"。
[0010] 荧光团可以包括选自以下的任意一种或多种：FAM、J0E、TET、HEX、TAMRA、R0X、 ALEXA和ΑΤΤ0。
[0011] 探针可以包含以下序列：
[0012] 5'Xn C*Xm 3'（SEQ ID N0.1)
[0013] 其中n>l，m>3，X是核苷酸碱基;*是荧光团。优选地，核苷酸碱基选自A、T、C和G。优 选地，η大于1至20或20以下，更优选大于1至10或10以下。优选地，m大于3至20或20以下，更 优选大于3至10或10以下。预期公开了由前述范围所采用的η或m构成的可能的核苷酸数目 所覆盖的探针长度的所有组合。
[0014] 优选地，探针可以包含选自以下任一序列的序列：
[0018] 当寡核苷酸被并入靶核酸序列，导致扩增子-探针复合物的构象改变，从而引起荧 光团激发态的改变时，荧光优选增加。
[0019] 与荧光团配体结合的胞嘧啶不位于5'或3'端或者5'或3'端附近。更优选地，其不 位于5'或3'端的前3个碱基内。优选地，与荧光团结合的胞嘧啶位于探针的中间碱基处。
[0020] 根据本发明的另一方面，提供了上文所述的等温核酸扩增探针。
[0021] 根据本发明的另一方面，提供了上文所述的环介导等温扩增探针。
[0022] 确定核酸混合物中至少一种靶核酸的方法和组合物通常采用探针、杂交试剂和与 形成核酸链的任何所需的核苷酸三磷酸相关的一种或多种磷酸键形成酶。
[0023] 这些方法通常包括扩增，例如包括使用与RNA聚合酶结合的启动子、其中仅一条链 被切割接着通过用DNA聚合酶延伸被置换的限制性位点、或循环的杂交试剂，其中产生串联 重复。扩增的核酸的检测可以采用多种形式，但是优选通过荧光团。
[0024] 根据本发明的另一方面，提供了检测样品中靶核酸的方法，其包括：
[0025] a.扩增样品中的靶核酸以提供扩增的核酸；
[0026] b.用上文所述的探针探测所述扩增的核酸；以及 [0027] c.检测一种或多种靶核酸的存在。
[0028]靶核酸可以是来自微生物、真菌、酵母、病毒、人、动物、植物等的核酸。已知用于 LAMP的靶核酸使得LAMP引物和合适的特异性探针能够被合成。因此，可以确定样品中是否 存在所述微生物、真菌、酵母、病毒、人、动物或植物。优选地，靶核酸来自沙眼衣原体或淋病 奈瑟氏菌。
[0029]优选地，荧光增加表明样品中靶核酸的存在。
[0030] 过程是等温的，并且允许在一个容器中以单个阶段或连续阶段扩增，其中所有的 试剂都是兼容的。
[0031] 在另一方面，本发明提供了诊断患者中衣原体和/或淋病的方法，其包括：
[0032]提供来源于患者的样品；
[0033] 向所述样品添加一种或多种本发明的探针；以及
[0034] 检测来源于沙眼衣原体和/或淋病奈瑟氏菌的核酸的存在，其中探针荧光的增加 表明沙眼衣原体和/或淋病奈瑟氏菌感染的存在。
[0035] 样品可以通过常规方法处理，使得探针能够与样品中存在的任何靶核苷酸结合。 这样的处理可以包括离心并裂解样品，从而从感染微生物释放任何靶核酸。
[0036] 在一实施方案中，在所述方法中使用对来源于沙眼衣原体或淋病奈瑟氏菌的核酸 特异的单一类型的探针，使得样品中只有沙眼衣原体或只有淋病奈瑟氏菌被检测到。
[0037] 在优选的实施方案中，将至少两种不同的探针添加至样品，其中第一探针用第一 荧光标记物标记，并且其对探测沙眼衣原体核酸是特异的，以及第二探针用不同于第一探 针的荧光标记物标记，并且其对探测淋病奈瑟氏菌核酸是特异的。在该实施方案中，同时检 测来源于患者的单一样品中的衣原体和淋病感染是可能的。
[0038] 在本发明方法的一方面中，来自患者的样品可以是血液样品、尿液样品、血清样品 或唾液样品。
[0039] 根据本发明的另一方面，提供了试剂盒，其包含上文所述的探针、含有聚合酶的 LAMP反应缓冲液、dNTPS和用于靶标的LAMP引物。
[0040] 在一实施方案中，试剂盒中可以包含阳性对照和阴性对照。试剂可以作为湿(wet) 试剂或以冻干形式存在。
[00411本发明方法或试剂盒中所用的缓冲液包含浓度为Ι-lOmM的dNTP、浓度为2-20mM的 一种或多种盐、浓度为l0-l00mM的Tris pH8.8、浓度为10-100mM的海藻糖、量为1U-12U的 BST聚合酶以及0·01%-1%1，2-丙二醇。
[0042] 缩写 [0043] CT-沙眼衣原体
[0044] GC-淋病奈瑟氏菌
[0045] GlnA7-谷氨酰胺合成酶
[0046] P〇rA7_ 孔蛋白 A7
[0047] LAMP-环介导等温扩增
[0048] PCR-聚合酶链式反应
[0049] 现在结合以下实施例和附图，仅通过示例的方式来描述本发明。
[0050] LAMP 反应
[0051 ] 利用本
【申请人】开发的LAMP V6.21反应缓冲液，通过LAMP对靶CT和GT DNA进行基于 V13的检测。靶DNA的基于探针的检测在V6.21p(无 V13)中进行。LAMP引物浓度如下:CT roi-0·8μΜ FIP&BIP引物、0·2μΜ F3&B3和0·4μΜ环引物、GC porA7和GC glnA7-2yM FIP&BIP引 物、0.25μΜ F3&B3和0.5μΜ环引物。所有探针均以0.625μΜ的终浓度使用。使用ABI7500实时 PCR仪，在63 °C的恒定温度下运行LAMP反应60min。视情况，在SybrGreen/FAM、Joe或Cy3通道 中获得荧光信号的读数。
[0052] 探针序列
[0059] 靶序列
[0060] 实施例中所用的靶DNA序列是
[0061 ] SEQ ID Νο·8:沙眼衣原体G/SotonGl质粒pSotonGl全序列（GenBank:HE603235.1)
[0065] SEQ ID Νο·9:淋病奈瑟氏菌1类外膜蛋白的部分porA基因，隔离物GC3(GenBank: HE681886.1)
[0068] SEQ ID如.10:淋病奈瑟氏菌谷氨酰胺合成酶^1以)基因 411^-14等位基因，部 分cds(GenBank:AF520262·1)
[0070] LAMP反应中所用的引物序列如下：
[0071] CT 质粒
[0091] 缓冲液
[0092] 本
【申请人】已经开发了与本发明探针一起使用的缓冲体系，并且在以下实施例中被 命名为V6.21(或不存在V13染料的V6.21p)。缓冲液成分的浓度为缓冲液复原之后：
[0093] V6.21
[0094] 4-10mM dNTP、10mM盐、30mM Tris pH8.8、30mM海藻糖、1-8U Bst聚合酶、染料和 0.05% 丙二醇。
[0095] V6.21p
[0096] 4-10mM dNTP、10mM盐、30mM Tris pH8.8、30mM海藻糖、1-8U Bst聚合酶和0.05% 丙二醇。
[0097] PCR
[0098] 根据厂商的说明书，利用ΑΡ??ΜΑ CT/GC多重试剂(multiplex)(Gen-Probe)通过实 时PCR进行临床样品中的CT/GC检测。
[0099]琼脂糖凝胶电泳
[0100] 在100V下，于1 %琼脂糖凝胶ΙχΤΑΕ缓冲液中进行DNA电泳。LAMP DNA产物通过透照 器用 GelRed(Invitrogen)激发。
[0101] V6.21和V6.21p缓冲液由本
【申请人】开发。LAMP引物获自Eurofins。焚光团标记的寡 核苷酸购自集成DNA科技(Integrated DNA technologies) Jris缓冲液、琼脂糖凝胶和PCR 级水购自S i gma。CT和GC DNA标准品获自ATCC。
[0102] 附图
[0103] 图1是本发明DNA探针的示意图。所述探针由具有与确定的荧光团缀合的内部胞嘧 啶的寡核苷酸组成。所述探针可以与侧翼为Fip和Bip引物的扩增子的内部区域互补，或者 其可以是用荧光团在内部标记的修饰的环F或环B引物。
[0104] 实施例1
[0105] 图2A至图2F显示了在含有V13的V6.21缓冲液（图2A、图2B和图2C)或无 V13染料的 V6.21p缓冲液（图2D、图2E和图2F)中，用CT PB1 (图2A和图2D)、GC glnA7(图2B和图2E)和GC porA7(图2C和图2F)引物生成的扩增图谱。SEQ ID N0s.8至10所示的靶序列分别具有与FAM 缀合的CT PB1内部探针、与Joe缀合的GC glnA7环探针以及与Alexa546缀合的GC porA7环 探针。所有反应都使用ABI7500仪在63°C的恒定温度下进行60min。
[0106] 实施例2
[0107]图3A和图3B是在存在与FAM缀合的CT PB1内部探针的情况下，用CT PB1引物生成 的LAMP产物的熔解曲线分析。每个反应100pg ATTC CT DNA标准品用作阳性对照。A-标准化 的报告图谱，B-衍生的报告图谱。基于使用ABI7500仪在FAM通道中的读数，生成熔解曲线图 谱。
[0108] 实施例3
[0109]图4A和图4B在存在与J0E缀合的GC glnA7环探针的情况下，用GC glnA7引物生成 的LAMP产物的熔解曲线分析。每个反应100pg ATTC GC DNA标准品用作阳性对照。图4A显示 了标准化的报告图谱，图4B显示了衍生的报告图谱。基于使用ABI7500仪在J0E通道中的读 数，生成熔解曲线图谱。
[0110] 实施例4
[0111] 图5A和图5B在存在与ALEXA546缀合的GC porA7环探针的情况下，用GC porA7引物 生成的LAMP产物的熔解曲线分析。每个反应100pg ATTC GC DNA标准品用作阳性对照。图5A 显示了标准化的报告图谱，图4B显示了衍生的报告图谱。基于使用ABI7500仪在Cy3通道中 的读数，生成熔解曲线图谱。
[0112] 实施例5
[0113] 图6A至图6D显示了在环介导等温扩增中，使用本发明的探针验证DNA产物特异性 的测试结果。假阳性的迟扩增时间（在LAMP反应中可检测的最低靶DNA浓度（100fg GC DNA) 之后超过30min)表明，非特异性的扩增可能是引物二聚化形成的结果。标准熔解曲线分析 无法区分该LAMP反应中的特异性产物和非特异性产物，但是非特异性产物可以用本发明的 探针识别。GC DNA用GC porA7引物扩增，并视情况用V13染料或GC porA7-ALEXA546探针显 现。
[0114] 实施例6
[0115] 图7显示了在含有V13的V6.21缓冲液或无 V13染料的V6.21p缓冲液中，但是在存在 具有与FAM缀合的内部C和3'终止子(3'ddC)的CT PB1末端探针（与环区域互补）的情况下， 用CT PB1引物生成的扩增图谱。尽管通过激发对照反应中的V13染料验证了靶DNA的成功扩 增，但是具有3'终止子的CT PB1探针并未生成阳性信号。
[0116] 实施例7
[0117] 图8A和图8B显示了在含有R0X的V6.21p缓冲液中，在存在CT PB1引物和具有与FAM 缀合的内部胞嘧啶的CT PB1末端探针（图8A)，以及通用引物和具有与FAM缀合的3 '末端胞 嘧啶的3'UP探针（图8B)的情况下，生成的扩增图谱。第一条线代表由R0X生成的信号，第二 条线对应于FAM通道中生成的信号。具有内部标记的C的探针与靶DNA的结合导致FAM激发。 具有3 '端C标记的探针与靶标的结合不改变FAM激发态。
[0118] 实施例8
[0119] 图9A至图9C显示了在无 V13的V6.21p缓冲液中，在存在具有与FAM缀合的内部C的 CT PB1内部探针和参照染料(R0X)的情况下，用CT roi引物生成的扩增图谱。图9A显示了原 始数据，来自FAM通道的读数在第一条线中，和来自R0X通道的读数在第二条线中。图9B显示 了相对于ROX标准化的（FAM通道中生成的）扩增图谱。图9C显示了衍生的报告熔解曲线图 谱。
[0120] 实施例9
[0121] 图10A至图10C显示了CT roi-FAM探针特异性的验证。图10A显示了在存在CT DNA 和CT引物的情况下，用CT PB1-FAM探针生成的扩增图谱。作为对照，进行了两组反应，其中 非特异性基因 --GC glnA7和GC porA7在存在CT PB1-FAM探针的情况下用相应的LAMP引 物扩增。在V6.2lp缓冲液中，在存在CT PB1探针的情况下，在FAM通道中，仅当反应中存在CT DNA时才生成扩增图谱，并且当非特异性基因 （GC glnA7和GC porA7)被扩增时，没有信号生 成。当在其中用CT引物扩增CT DNA的反应中使用非特异性探针时，也没有信号生成。图10C 显示了在类似的实验但是在含有嵌入染料V31的V6.21缓冲液中进行所获得的数据。图10C 显示了在图10A所述的实验中生成的DNA产物。
[0122] 实施例10
[0123] 图11A和图11B显示了CT roi-FAM探针针对ΑΡ??ΜΑ CT测定的验证。证实为CT阳性 (n = 29)(图11A)或阴性(n = 21)(图11B)的50份临床样品在具有CT PB1-FAM探针的V6.21p 缓冲液中测试。用CT roi-FAM探针，50份样品中有24份测试为CT阴性（图11A)，有26份测试 为CT阳性（图11B)。Apt imA和CT PB-FAM测试之间具有86 %的一致性。
[0124] 实施例11
[0125] 图 12A和图 12B显示了在具有CT PB1-FAM+GC porA7-Alexa546探针的CT/GC多重试 剂中生成的扩增图谱。在V6.21p缓冲液中，在存在CT PB1-FAM和GC porA7-Alexa546探针的 情况下，在单独的反应中或以组合来扩增CT和GC DNA。在Cy3(图12A)和FAM(图12B)通道中 读取读数。该实验显示，用FAM和Alexa546标记的探针可以在同时发生的反应中扩增和检测 两种DNA靶标，并且CT PB1和GC porA7引物和探针之间没有交叉反应性。
[0126] 实施例12
[0127] 表 1 显示了CT和GC的V13LAMP，CT/GC Aptima以及CT/GC多重试剂（CT PB1-FAM+GC porA7-Alexa546)之间的比较。从136份临床样品提取的DNA，用CT/GC Aptima多重试剂，用 在含有V13的V6.21缓冲液中的CT PB1和GC porA7引物，或在存在CT PB1和GC porA7引物以 及CT PB1-FAM和GC porA7-Alexa546探针的v6.21p缓冲液的多重反应中进行测试。在对照 实验中，用GC glnA7-joe探针以单一反应对样品进行测试。该表显示测试之间的一致性得 分。
【主权项】
1. 用于等温核酸扩增的探针，其包含与靶核酸序列的区域互补的寡核苷酸探针序列， 其中所述寡核苷酸探针序列仅具有一个荧光团标记物，并且该标记物与内部胞嘧啶碱基结 合，以及其中所述寡核苷酸探针序列没有3'端终止子。2. 如权利要求1所述的探针，其中除了3'端的第1-3位和5'端的第1位之外，所述胞嘧啶 碱基基本上位于寡核苷酸长度的中心。3. 如权利要求1或2所述的探针，其中所述寡核苷酸探针序列是DNA序列，并且所述靶核 酸序列是DNA序列。4. 如前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述荧光团包括选自以下的任意一种或 多种：FAM、JOE、TET、HEX、TAMRA、ROX、ALEXA 和 ATTO。4. 如权利要求4所述的探针，其中所述荧光团是FAM、Joe或Alexa546。5. 如前述权利要求中任一项所述的探针，其包含以下序列： 5'Xn OXm 3'（SEQ ID N0.1) 其中n>l，m>3，X是核苷酸碱基，以及*是荧光团。6. 如权利要求5所述的探针，其中所述核苷酸碱基选自A、T、C和G，n大于1至20或20以 下，更优选大于1至10或10以下，以及m大于3至20或20以下，优选大于3至10或10以下。7. 如前述权利要求中任一项所述的探针，其包含以下序列的一个或多个： SEQ ID NO.3: TAAGATAAC [ C-FAM ] CCGCACGTG (CT PB I-FAM 内部） SEQ ID NO.5: GCGAACATA[C-ALEXA546]CAGCTATGATCAA(GC porA7-joe环F)或 SEQ ID NO.6: ATGTTCA[C-JOE]CATGGCGGAG(GC glnA7-ALEXA546环B)。8. 如前述权利要求中任一项所述的探针，其中所述靶核酸来自微生物、真菌、酵母或病 毒。9. 环介导的等温扩增探针，其如前述权利要求中任一项所述。10. 检测样品中靶核酸序列的方法，其包括： 扩增样品中的靶核酸以提供扩增的核酸； 用权利要求1至9中任一项所述的探针探测所述扩增的核酸；以及 检测靶核酸的存在，其中探针荧光的增加指示所述样品中靶核酸的存在。11. 如权利要求10所述的方法，其中所述靶核酸来自微生物、真菌、酵母或病毒。12. 如权利要求10或11所述的方法，其中所述祀核酸来自沙眼衣原体（ChIamydia trachomatis)或淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae) 〇13. 诊断患者中衣原体和/或淋病感染的方法，其包括： 提供来源于所述患者的样品； 将一种或多种权利要求1至9所述的探针添加至所述样品；以及 检测来源于沙眼衣原体和/或淋病奈瑟氏菌的核酸的存在，其中探针荧光的增加指示 沙眼衣原体和/或淋球菌感染的存在。14. 如权利要求13所述的方法，其中将对来自沙眼衣原体或淋病奈瑟氏菌的核酸特异 的单一类型的探针添加至所述样品。15. 如权利要求13所述的方法，其中将至少两种不同的探针添加至所述样品，其中第一 探针用第一荧光标记物标记，并且其对探测沙眼衣原体核酸是特异的，以及第二探针用不 同于所述第一探针的荧光标记物标记，并且其对探测淋病奈瑟氏菌核酸是特异的。16. 如权利要求10至15中任一项所述的方法，其中在缓冲液体系中提供所述探针，所述 缓冲液体系包含浓度为I-IOmM的dNTP、每一种盐的浓度为2-20mM的一种或多种盐、浓度为 IO-IOOmM的Tris pH8.8、浓度为IO-IOOmM的海藻糖、量为1U-12U的BST聚合酶以及0.01%-1 %的1,2-丙二醇。17. 如权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种盐选自KCl、（NH4)2S〇4和MgS〇4。18. 用于检测靶核酸的试剂盒，其包含权利要求1至9中任一项所述的探针、环介导等温 扩增试剂缓冲液、酶、dNTP以及一种或多种环介导等温扩增引物。19. 如权利要求18所述的试剂盒，其还包含阳性对照和阴性对照。20. 如权利要求19所述的试剂盒，其中所述试剂缓冲液包含浓度为I -I OmM的dNTP、浓度 为2-20mM的一种或多种盐、浓度为IO-IOOmM的Tris pH8.8、浓度为IO-IOOmM的海藻糖、量为 1U-12U的BST聚合酶以及0.01 %-1 %的1，2-丙二醇。21. 如权利要求20所述的试剂盒，其中所述一种或多种盐选自KCl、（NH4)2S〇4和MgS〇4。
【文档编号】C12R1/36GK105899674SQ201480057385
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月30日
【发明人】莫尼卡·伊沃娜·苏瓦拉, 赛义德·贾韦德, 伊利莎白·安·吉利斯
【申请人】马斯特集团有限公司