主要组织相容性复合体单核苷酸多态性的制作方法

主要组织相容性复合体单核苷酸多态性的制作方法
【专利摘要】本发明涉及主要组织相容性复合体(MHC)的中心区域的γ基因组区块中的单核苷酸多态性(SNP)的鉴定，其可用于匹配移植供体与受体及确定疾病易感性。
【专利说明】
主要组织相容性复合体单核苷酸多态性
技术领域
[0001] 本发明涉及主要组织相容性复合体(MHC)的中心区域的γ基因组区块中的单核苷 酸多态性(SNP)的鉴定，其可用于匹配移植供体与受体及确定疾病易感性。
【背景技术】
[0002] 主要组织相容性复合体(MHC)是在6号染色体的短臂上的大约4Mb的基因密集区 域。MHC包含很多免疫应答基因，包括编码人类白细胞抗原(HLA)的基因。MHC也包含很多参 与免疫应答和炎性反应的基因，并且与多种自身免疫和炎性疾病相关。
[0003 ] MHC通常作为完整区块得到遗传;然而，据显示在MHC的特定区域会以约1 /100次减 数分裂的频率发生重组。在这些重组热点之间，是长度至多几百kb的DNA基因组区块。因此， 在一个群体中，许多无关个体(unrelated individuals)具有保守单倍型(haplotype)，或 具有来自保守单倍型的重组区块。所述保守单倍型指"扩展单倍型"或"祖先单倍型"。
[0004] 在MHC中有4个主要的基因组区块。这些基因组区块的精确界限是未知的，并且在 主要基因组区块之间可能存在更小的基因组区块。主要区块为区块，其包括HLA_A;i3区 块，其包括HLA-B和HLA-C; γ区块，其包括Bf、C2和C4基因；及δ区块，其包括HLA-DRB及DQB1 基因。HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1及HLA-DPB1基因目前用于匹配移植供体和 受体。因在δ区块和HLA-DTOl的基因之间观察到高重组率，HLA-DPB1可能是在δ区块的着丝 粒侧的单独区块中。然而，HLA-DPB1经常针对移植匹配而分型。据显示，HLA匹配对于干细胞 移植后的结果改善至关重要。此外，Petersdorf等（2007)的研究显示，如果HLA匹配的供体 和受体是单倍型匹配的，那么移植无关干细胞后的结果与HLA匹配但单倍型不匹配的供体/ 受体对相比会有所改善。在该研究中，来自供体和受体的基因组DNA被提取并且杂交到微阵 列上，该微阵列包含被配置成检测HLA等位基因间的物理连锁的寡核苷酸探针。所述方法不 适于常规HLA分型，且迄今为止未有用于评估或改善单倍型匹配可能性的常规测试的描述。
[0005] 在分子生物学的某些方面，单倍型被描述为存在于2个核苷酸多态性之间的物理 连锁。当提及HLA和MHC时，术语单倍型用于描述整个MHC，其跨度至少在HLA-A到HLA-DQB1的 范围内。所述区域跨度为大约4Mb并且通常完整遗传。
[0006] 某些单倍型在历时最多数千代后仍保持完整，并且除了在无关个体间的少量SNP 外，其在序列上保持同一。不同的祖先单倍型包含HLA等位基因的独特组合，并且在整个MHC 的许多区域具有独特的序列内容。与HLA匹配但单倍型不匹配的个体相比，单倍型/HLA匹配 的个体具有减少的移植物抗宿主病(GVHD)，这可能是因为单倍型匹配个体共享完整的或部 分祖先单倍型并且因此也共享许多独特序列。
[0007] 最佳的干细胞供体是同卵双胞胎，其次是HLA单倍同一性兄弟姐妹。鉴定HLA单倍 同一性兄弟姐妹的相对低的可能性经常导致需要鉴定适合的无关的HLA匹配的供体，其可 以通过供体登记来获得。然而，就算是HLA匹配的，成功结果的可能性通常仍低于单倍同一 性兄弟姐妹。认为结果差距的一个原因可能是单倍同一性兄弟姐妹在MHC内的其它基因或 序列上匹配，这可能有助于移植结果。
[0008] GVHD是同种异基因组织移植后常见的并发症。其通常与干细胞或骨髓移植有关， 但该术语也适用于其它形式的组织移植。组织（移植物）中的免疫细胞（白细胞）识别受体 (宿主)为"外来的"。该疾病的急性或暴发性形式(aGVHD)通常在移植后100天内观察到，并 且由于关联的发病率和死亡率，其是移植的主要挑战。急性移植物抗宿主病以选择性破坏 肝、皮肤(皮疹）、粘膜和胃肠道为特征。较新的研究表明移植物抗宿主病的其它靶器官包括 免疫系统(造血系统，例如，骨髓和胸腺）自身和特发性肺炎形式的肺。
[0009] 急性GVHD凭借受累器官的数量和程度来分期和分级(Ο-IVhIV级GVHD患者通常具 有不良预后。如果GVHD是严重的并且要求包含类固醇和其它试剂的强烈免疫抑制来控制， 则患者可能由于免疫抑制而发展严重的感染并且可能死于感染。
[0010] 因此，仍然需要鉴定受体的移植供体的测试方法，以使受体发展aGVHD、特别是IV 期(威胁生命)aGVHD的风险减少。

【发明内容】

[0011] 本发明的发明人描述了在MHC的γ区块编码或非编码部分中鉴定独特的DNA序列 核苷酸或单核苷酸多态性(SNP)，其位于MHC的HLA-B/C区块(δ区块)和HLA-DRB/DQB区块(δ 区块)之间。多种鉴定出的SNP对多种祖先单倍型是通用的，而其他鉴定出的SNP对祖先单倍 型是特异性的。当一起使用时，这些SNP提供了 γ区块SNP谱(GBSP)。发明人示出：大部分无 关、随机个体并且因此不可能为HLA匹配的个体，具有独特的或不匹配的GBSP，而具有相同 GBSP的个体可能是HLA匹配的。因此，所述SNP或GBSP可用于为需要移植的受体鉴定移植供 体。通过同时在潜在的移植供体和受体中匹配MHC γ区块的SNP或GBSP，移植受体因 HLA不匹 配供体而发展GVHD的风险降低。另外，当在无关的潜在移植供体和受体中匹配MHC SNP或 GBSP且存在单个HLA型不匹配时，5年后生存的机会大大提高。
[0012] 因此，本发明的第一方面提供一种为需要移植的受体鉴定移植供体的方法，所述 方法包括：
[0013] a)确定在需要移植的所述受体的MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基 因的存在；
[0014] b)确定在一个或多个潜在移植供体的MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等 位基因的存在;及
[0015] c)基于同时在所述移植供体和需要移植的所述受体的MHCy区块中一个或多个单 核苷酸多态性等位基因的存在，鉴定移植供体。
[0016] 在一个实施方式中，所述方法包括:基于同时在移植供体和需要移植的受体的MHC γ区块中至少24个单核苷酸多态性等位基因的存在，鉴定移植供体。
[0017] 在一个实施方式中，所述单核苷酸多态性在C4基因中。
[0018] 在一个特定实施方式中，所述单核苷酸多态性等位基因选自C2321、T9763、C9796、 T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、 G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、 C16954、T17316、T19588和A20170。
[0019]第二方面，本发明提供一种降低移植受体发展移植物抗宿主病的可能性的方法， 所述方法包括：
[0020] a)确定在需要移植的受体的MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的 存在；
[0021] b)确定在一个或多个潜在移植供体的MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等 位基因的存在；
[0022] 其中，同时在移植受体和一个或多个潜在移植供体的MHC γ区块中所述一个或多 个单核苷酸多态性等位基因的存在或不存在表明所述移植受体在从所述移植供体移植了 移植物后发展移植物抗宿主病的可能性降低。
[0023] 在一个实施方式中，移植物抗宿主病是严重的移植物抗宿主病。
[0024] 第三方面，本发明提供一种延长移植受体存活时间的方法，所述方法包括：
[0025] a)确定在需要移植的受体的MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的 存在；
[0026] b)确定在一个或多个潜在移植供体的MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等 位基因的存在；
[0027] 其中，同时在移植受体和一个或多个潜在移植供体的MHC γ区块中所述一个或多 个单核苷酸多态性等位基因的存在或不存在表明所述移植受体在从所述移植供体移植了 组织或器官后将经历延长的存活时间。
[0028] 在一个实施方式中，在9/10HLA等位基因处匹配并且对于每个MHCy区块单核苷酸 多态性等位基因都匹配的供体和受体表明所述移植受体在从所述移植供体移植了组织或 器官后将经历延长的存活时间。
[0029]技术人员会理解，确定一个或多个单核苷酸多态性的存在或缺失可包括分析来自 所述供体和/或受体的一个或多个核酸样品，或可包括从例如病理实验室或基因检测实验 室等另一个实体获得预定信息(例如核酸序列信息或来自核酸分析的读出结果）。
[0030] 因此，在一个实施方式中，确定在需要移植的受体和/或潜在供体的MHCy区块中 一个或多个单个多核苷酸多态性等位基因的存在的步骤包括:获得预定的MHCy区块单核 苷酸多态性等位基因信息和/或MHCγ区块单倍型信息。
[0031] 在另一个实施方式中，确定在潜在移植供体的受体的MHCy区块中一个或多个单 核苷酸多态性等位基因的存在的步骤包括:分析来自所述受体和/或来自潜在供体的核酸 样品以确定所述一个或多个单核苷酸多态性等位基因的存在。
[0032]可以使用本领域任何已知适合的方法来确定一个或多个单核苷酸多态性等位基 因的存在或不存在。例如，在一个实施方式中，分析核酸样品包括进行选自PCR-SSP测定、等 位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、核酸测序、5'核 酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析、单链构象多态性分析、变性梯度凝 胶电泳和直接核苷酸测序的一种或多种技术。
[0033]在一个实施方式中，所述方法包括从潜在移植供体和/或受体中获得生物样品并 且从所述生物样品中分离出核酸。在另一个实施方式中，所述核酸样品从获自潜在移植供 体和/或受体的生物样品中分离。所述生物样品可以是任意适合的细胞或组织，基因组DNA 可从其中提取，例如，所述生物样品可能是淋巴细胞、全血、颊粘膜拭子、活检或冷冻组织。 [0034]本发明的发明人发现，针对MHCy区块中的多重单核苷酸多态性匹配潜在移植供 体和受体进一步降低了供体发展急性移植物抗宿主病的风险。因此，在一个实施方式中，所 述方法包括:确定同时在潜在移植供体和受体的MHC γ区块中2个以上单核苷酸多态性等位 基因的存在。在优选实施方式中，本发明的方法包括:确定同时在潜在移植供体和受体的 MHCy区块中至少25个单核苷酸多态性等位基因的存在。
[0035] 在一个实施方式中，MHCy区块中的一个或多个单核苷酸多态性等位基因存在于 C4基因中，其中所述C4基因是C4A基因或C4B基因。或者，一个或多个单核苷酸多态性等位基 因在C4A基因和C4B基因中均存在。
[0036] 在一个特定的实施方式中，一个或多个单核苷酸多态性等位基因选自C2321、 T9763、C9796、T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、 A12568、A12837、G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、 1'14952、615108、(：16954、1'17316、1'19588和/或厶20170中的一个或多个。
[0037] 在另一个实施方式中，所述方法包括确定C2321、T9763、C9796、T9819、T9881、 T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、A12877、 A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、 T19588和A20170中至少24个的存在。
[0038] 技术人员会理解本发明的方法可与在非MHCy区块的基因或区域中检测一个或多 个等位基因结合使用，和/或与检测HLA单倍型结合使用。因此，在一个实施方式中，本发明 的方法进一步包括:在受体和潜在移植供体中检测一个或多个其它等位基因的存在或确定 一个或多个其它单倍型。
[0039] 在一个实施方式中，所述方法包括确定一个或多个其它HLA等位基因和/或HLA单 倍型。在一个特定的实施方式中，所述方法包括确定HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB、HLA-DQB 和/或HLA-DPB基因的一个或多个等位基因或单倍型。
[0040] 因此，本发明的方法可包括基于以下i)或i i)来选择移植供体：
[0041 ] i)在潜在移植供体和受体的MHC γ区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的 存在，或
[0042] ii)在潜在移植供体的MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的存在 和一个或多个其它HLA等位基因和/或HLA单倍型的存在。
[0043] 第四方面，本发明提供一种将同种异基因移植物移植到受体中的方法，所述方法 包括：
[0044] i)根据本发明的方法选择移植供体，
[0045] i i)从所述移植供体中移出供体移植物，及
[0046] iii)将所述移植物移植到受体中。
[0047] 在一个实施方式中，所述移植物是同种异基因干细胞移植。
[0048]在一个特定的实施方式中，所述干细胞移植是造血干细胞移植。
[0049] 第五方面，本发明提供一种用于匹配移植供体和受体的试剂盒，所述试剂盒包含：
[0050] a)用于检测MHCy区块中的一个或多个单核苷酸多态性等位基因的核酸试剂;和
[0051] b)用于检测所述一个或多个单个多核苷酸多态性等位基因的说明书。
[0052] 在一个实施方式中，用于检测一个或多个单核苷酸多态性等位基因的核酸试剂可 以是一个或多个寡核苷酸探针，例如对MHCy区块中的一个或多个单核苷酸多态性等位基 因有特异性的寡核苷酸探针。在一个特定实施方式中，所述寡核苷酸探针对C4基因中一个 或多个单核苷酸多态性等位基因具有特异性。
[0053]在另一个实施方式中，所述寡核苷酸探针带有可检测标记。
[0054] 在一个实施方式中，所述寡核苷酸探针对选自C2321、T9763、C9796、T9819、T9881、 T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、A12877、 A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、 T19588和/或A20170的一个或多个单个多核苷酸等位基因具有特异性。
[0055] 在另一个实施方式中，所述试剂盒包含对C2321、T9763、C9796、T9819、T9881、 T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、A12877、 A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、T17316、 T19588和A20170中的每个都具有特异性的寡核苷酸探针。
[0056]在另一个实施方式中，所述试剂盒包含用于扩增MHCy区块中的一个或多个单核 苷酸多态性等位基因的寡核苷酸引物。所述寡核苷酸引物可以是例如等位基因特异性PCR 扩增引物。
[0057]在一个实施方式中，所述寡核苷酸引物用于扩增C4基因中的一个或多个单核苷酸 多态性等位基因。
[0058]在一个实施方式中，包含寡核苷酸引物的试剂盒进一步包含DNA聚合酶。
[0059] 在一个实施方式中，所述试剂盒适合用于进行一个或多个PCR-SSP测定。
[0060] 在另一个实施方式中，所述试剂盒包含多孔板。
[0061 ]在另一个实施方式中，所述试剂盒包含阴性扩增对照。
[0062] 在一个实施方式中，所述试剂盒包含用于扩增选自C2321、T9763、C9796、T9819、 T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、 A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、 T17316、T19588和/或A20170的一个或多个单核苷酸多态性等位基因的寡核苷酸引物。 [0063] 在另一个实施方式中，所述试剂盒包含用于扩增C2321、T9763、C9796、T9819、 T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、 A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、 T17316、T19588和A20170中的每个的寡核苷酸引物。
[0064] 在一个特定的实施方式中，所述试剂盒包含一个或多个寡核苷酸引物，其包含选 自SEQ ID No:3至50的任一个或多个的序列。
[0065] 本发明进一步提供一种用于匹配移植供体和受体的核苷酸阵列，所述核苷酸阵列 包含对MHCy区块中的一个或多个单核苷酸多态性等位基因有特异性的探针。
[0066] 在一个实施方式中，所述探针对C4基因中的一个或多个单核苷酸多态性等位基因 有特异性。
[0067]在另一个实施方式中，所述试剂盒包含对至少24个单核苷酸多态性等位基因有特 异性的探针。
[0068]在一个特定的实施方式中，所述试剂盒包含对C4基因中的至少24个单核苷酸多态 性等位基因有特异性的探针。在一个实施方式中，所述试剂盒包含对C2321、T9763、C9796、 T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、 G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、 C16954、T17316、T19588和A20170中的每一个有特异性的探针。
[0069] 第六方面，本发明提供一种进行一个或多个PCR-SSP测定以检测MHC γ区块中的单 核苷酸多态性的方法，所述方法包括：
[0070] i)将基因组DNA与DNA聚合酶混合以形成DNA-聚合酶混合物，
[0071] ii)将该DNA-聚合酶混合物与用于扩增来自MHCy区块的单核苷酸多态性等位基 因的寡核苷酸引物合并，以形成反应混合物，
[0072] iii)使所述反应混合物经历热循环以产生扩增产物，及
[0073] iv)分析扩增产物以检测单核苷酸多态性。
[0074] 在一个特定的实施方式中，所述扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳来分析。
[0075] 在一个实施方式中，所述基因组DNA是高分子量人类基因组DNA。
[0076] 在另一个实施方式中，所述基因组DNA的浓度为约20ngAU至约lOOng/μΙ。
[0077]在一个实施方式中，所述方法包括从生物样品提取基因组DNA。
[0078]在一个特定实施方式中，所述方法包括从酸-柠檬酸盐-葡萄糖溶液(A⑶)或EDTA 抗凝全血中提取基因组DNA。
[0079] 在另一个实施方式中，所述基因组DNA的光密度(0D)比的测量值为0D26Q/28()> 1.8。
[0080]单核苷酸多态性等位基因可以位于MHCy区块的任意位置。在一个实施方式中，所 述单核苷酸多态性等位基因在C4基因中。
[0081] 在一个实施方式中，所述单个核苷酸等位基因多态性选自C2321、T9763、C9796、 T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、 G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、 C16954、T17316、T19588和/或A20170。
[0082] 在另一个实施方式中，所述方法包括检测至少24个单核苷酸多态性等位基因。
[0083] 第七方面，本发明提供一种为需要移植的受体鉴定移植供体的方法，所述方法包 括:执行本发明的进行一个或多个PCR-SSP测定的方法以鉴定移植受体和/或潜在移植供体 的MHC γ区块中的单核苷酸多态性。
[0084] 在本发明的第一、第三、第四或第七方面的一个实施方式中，所述供体和受体在9/ 10HLA等位基因处匹配且针对每个MHC γ区块单核苷酸多态性等位基因都匹配。
[0085] 第八方面，本发明提供一种降低移植受体发展移植物抗宿主病的可能性的方法， 所述方法包括:执行本发明的进行一个或多个PCR-SSP测定的方法以鉴定移植受体和/或潜 在移植供体的MHC γ区块中的单核苷酸多态性。
[0086] 第九方面，本发明提供本发明的试剂盒或本发明的核苷酸阵列在鉴定移植受体 和/或潜在移植供体的MHC γ区块的单核苷酸多态性中的应用。
[0087] 在第一到第五及第七到第九方面的一个实施方式中，需要移植的受体或移植受体 需要造血干细胞移植或接受造血干细胞移植。
[0088] 可明显看出本发明一个方面的优选特征或特点可应用于本发明的许多其它方面。 [0089]整个说明书中的词语"包括"或其变化形式应被理解为意味着包含所描述的要素、 整体或步骤或要素、整体或步骤的组，但不排除任何其它要素、整体或步骤或要素、整体或 步骤的组。
[0090]下文通过下面的非限制性实施例并参考附图对本发明进行描述。
【附图说明】
[0091] 图1.该图显示6号染色体上MHCy区块区域的位置。
[0092] 图2 . PCR-SSP测试的凝胶图像，该测试用于检测补体C4基因中的8.1祖先单倍型 (AH)特异性SNP对。样品1具有8.1AH的α、β和δ区块标志物，并且对于γ区块SNP标志物测试 为阳性。样品2、3和4不具有任何8.1ΑΗ标志物并且对于γ区块SNP标志物的SSP测试为阴性。 样品的HLA分型：
[0093] 1:HLA-A*01:01;24:02; B*08:01; DRB1*03:01， DQB1*02:01
[0094] 2:HLA-A*02:01， B*46:01， DRB1*08:01 DQB1*06
[0095] 3:HLA-A*30:02;68:01， B*42:01， DRB1*03:02 DQB1*04
[0096] 4:HLA-A*24:02， B*52:01, DRB1*15:01， DQB1*06:02
[0097] 图3.与参照序列相比，在不同测试样品中鉴定的SNP的表。黑块中的序列是通过γ 型测定检测到的SNP。白块中的以黑字表示的序列差异是与参照相比的序列差异，但并非γ 型测定的唯一靶标。#7 γ型测定要求2XSNP的存在，其需要彼此连锁存在。具有白色短线 (-)的黑块表明相对于参照的缺失。所述样品根据它们的祖先单倍型来标记，且显示出了样 品的C4同种异型。
[0098] 图4· γ型不匹配导致严重aGVHD的风险增加。γ型匹配(Μ)和不匹配(ΜΜ)的患者 (X)及患者是否被诊断为具有急性GVHD和急性GVHD等级。
[0099] 图5. γ型匹配导致长时间生存的机会增加。
[0100] 图6.针对无关的供体和患者中的γ型匹配(Α)和不匹配(Β)个体的γ型PCR SSP分 析。箭头指示不匹配的SNP等位基因。
[0101] 图7.回顾性研究的结果，其显示出在GT匹配和GT不匹配的无关患者供体对中在存 活、III/IV级aGvHD及cGvHD方面的差异。
[0102] 序列表注释
[0103] SEQ ID N0:1-C4A同型特异性氨基酸残基。
[0104] SEQ ID N0:2-C4B同型特异性氨基酸残基。
[0105] SEQ ID N0:3至50-寡核苷酸引物。
【具体实施方式】
[0106] 一般技术与定义
[0107] 除非另外特别限定，本文使用的所有技术与科学术语应该与本领域普通技术人员 通常理解的具有相同含义(例如，在分子遗传学、生物化学和免疫学）。
[0108] 除非另外指出，本发明使用的分子遗传学、生物化学和免疫学技术为本领域技术 人员熟知的标准程序。这些技术在以下来源的文献中有所描述和解释：例如J，Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley和Sons(1984)，J·Sambrook和 Russell. ,Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbour Laboratory Press(2001),R.Scopes,Protein Purification-Principals and Practice, 第三版，Springer(1994)，T.A.Brown(编），Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1和2卷，IRL Press(1991)，D ·Μ·Glover和B ·D · Hames(编），DNA Cloning: A Practical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)，及F.M.Ausubel等（编），Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and ffiley-Interscience ( 1988,包括直至目前的所有更新），Ed Harlow和David Lane(编）Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory，（1988)，及J.E.Coligan等（编） Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(包括直至目前的所有更新）。
[0109]术语"核酸"或"核酸序列"或"核酸分子"指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或 核糖核苷酸及它们的聚合物。术语核酸与基因、互补DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、寡核苷酸 及多核苷酸可互换使用。
[0110] "分离的核酸分子"指总体已从其在天然状态下（如果其以任何形式存在于自然 中）所结合或连接的核苷酸序列中分离出的核酸分子。优选地，所述分离的核酸至少60%脱 离、更优选至少75%脱离、更优选至少90%脱离其通常所结合的其他组分。所述核酸可以使 用任何适合的已知技术从生物样品中分离。例如，总基因组DNA可以使用本领域已知的方法 和/或商业可得的试剂盒来从细胞中提取，例如，通过使用QIAGEN提供的QIAamp DNA血液 Mini试剂盒或DNeasy Blood&Tissue试剂盒，或通过使用诸如酸/氯仿提取和乙醇沉淀等方 法。
[0111] 本发明的术语"探针"指单链寡核苷酸，其被设计为与包含C4基因单核苷酸多态性 的核酸特异性地杂交。本发明的探针可为约5-150个核苷酸长。在一个实施方式中，探针可 以用于使用靶标捕获技术的高通量(下一代)测序中。因此，在一个实施方式中，探针可适合 于靶标捕获并且长度为约60-120个核苷酸。
[0112] 作为另一选择，探针可以为约10-25个核苷酸。在某些实施方式中，探针长度为10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。用于本发明的核苷酸可以 是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸及修饰的核苷酸(例如肌苷)或包含基本不改变其杂交特性 的经修饰的基团的核苷酸。
[0113] "生物样品"可以是例如淋巴细胞、全血、颊粘膜拭子、活检样本或冷冻组织或包含 基因组DNA的任何其它样品。尽管对于分子基因分型而言可以使用几乎任何组织来源，但最 常使用的是例如来自外周血的淋巴细胞。也可以使用通过非侵入性方法获得的样品，例如 通过基于脸颊拭子或唾液的DNA收集。从这些来源提取DNA的多种适合的方法是本领域已知 的。这些方法的范围从有机溶剂提取到二氧化硅包覆的珠及阳离子交换柱的吸附。DNA自动 提取系统也是商业可得的且可提供高质量、高纯度的DNA。
[0114] 如本文使用的，术语"移植"（transplant)指将获自一个个体(供体)的组织或细胞 移植或引入到另一个个体(受体)的身体中或身体上。从供体移除并移植到受体的细胞或组 织指"移植物(graft)"。通常移植的组织的实例为骨髓、造血干细胞、器官(例如肝脏、心脏、 皮肤、膀胱、肺、肾、角膜、胰腺、胰岛、脑组织、骨和肠）。在一个实施方式中，移植是造血干细 胞移植。
[0115] 本领域技术人员将会理解，术语"单倍型"指在染色体上位置靠近或位于相邻基因 座的一起遗传的等位基因组合，或是在染色体对的单个染色体上的统计学相关联的一组单 核苷酸多态性。
[0116] MHCy 区块
[0117] 本文使用的术语"MHCy区块"指位于6号染色体的短臂上的主要组织相容性复合 体(MHC)的HLA-B/C区块(δ区块)和HLA-DRB/DQB区块(δ区块)之间的基因组区域（图1)。位于 MHCy 区块中的基因包括但不限于TNXB(OMM 600985)、CYP21A2(0M頂 613815)、C4A(0MIM 120810)、STK19(OMIM 604977)、C4B(0MM 120820)、DOM3Z(OMIM 605996)、SKIVL2(OMIM 600478)、RDBP(0MIM 154040)、CFB(0MIM 138470)、C2(0MIM 613927)及EHMT2(OMIM 604599)〇
[0118] 人类补体C4基因座在MHC的III类区域中并显示出基因复杂性。补体C4基因显示出 作为单模块、双模块、三模块或四模块RCCX盒的一部分的区段性复制(Fernando等，2010)。 因此，理论上，两到八个拷贝的C4基因可能出现在二倍体人类基因组中；每个6号染色体包 含一到四个拷贝的单个C4基因。C4基因以两种形式之一存在：C4A(酸性）（0ΜΙΜ索引： 120810)或C4B(碱性）（0M頂索引：120820)，其各自本身是多态性的。如本文使用的，术语"C4 基因"指可能是C4A或C4B基因形式的多核苷酸序列。
[0119] 在核苷酸水平，C4A和C4B在41个外显子上享有99 %的序列同源性。每个同种型由 外显子26中的5个核苷酸变化来定义，其导致从1120至1125的4个同种型特异性氨基酸残 基：C4A的PCPVLD(SEQ ID N0:1)和C4B的LSPVIH(SEQ ID Ν0:2)<Χ4Α和C4B蛋白在化学反应 性上不同。C4A优先结合氨基，与蛋白（例如免疫复合物)形成酰胺键。与C4A相比，C4B在某些 免疫测定中显示出更大的溶血活性并且对羟基具有更高的亲和力。C4基因也可在大小上变 化，以长(C4L)和短(C4S)形式存在。长(21kb)或短（14.6kb)形式的C4基因由插入到内含子9 中的6.4kb的人类内源逆转录病毒(HERV-K(C4))插入序列的存在或不存在来确定。
[0120] 本文描述的本发明的方法涉及通过匹配一个或多个潜在移植供体的MHCy区块中 的单核苷酸多态性等位基因与需要移植的受体的MHCy区块中的一个或多个单核苷酸多态 性等位基因来确定患者发展aGVHD的可能性和/或移植患者的存活时间。因此，本发明的方 法可在多种应用中使用。例如，本发明的方法可用于为移植受体鉴定候选供体，其中，与具 有更少的与受体匹配的核苷酸多态性等位基因的移植供体相比，来自供体的移植物在受体 中将不太可能导致aGVHD，特别是严重的aGHVD。
[0121] 本发明的发明人发现，在移植供体和受体的MHCy区块中匹配一个单核苷酸多态 性等位基因降低了受体发展严重的急性移植物抗宿主病的风险。因此，在一个实施方式中， 所述方法包括确定同时在潜在移植供体和受体中一种单核苷酸多态性等位基因的存在。本 发明的发明人还发现，在潜在移植供体和受体的MHCy区块中匹配额外的单核苷酸多态性 等位基因进一步降低了供体发展急性移植物抗宿主病的风险，特别是严重的急性移植物抗 宿主病的风险，因此，在一个实施方式中，所述方法包括:确定同时在潜在移植供体和受体 的MHCy 区块中2个以上（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多）单核苷酸多态性等位基因的存在。在一个特定实 施方式中，所述方法包括确定同时在潜在移植供体和受体中24或25个单核苷酸多态性等位 基因的存在。
[0122] 在一个实施方式中，本发明的方法包括:在选自TNXB、CYP21A2、C4A、STK19、C4B、 D0M3Z(0MIM 605996)、SKIVL2、RDBP、CFB、C2和EHMT2的至少一个MHCy 区炔基因的编码或非 编码区中确定一个或多个SNP等位基因的存在。
[0123] 在一个实施方式中，本发明的方法包括：在选自C2321、T9763、C9796、T9819、 T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、G12749、 A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、C16954、 T17316、T19588和A20170的C4基因中确定一个或多个SNP等位基因的存在。本领域技术人员 将会理解这些SNP等位基因的位置是相对于C4基因起始密码子的第一个碱基。
[0124] 在一个特定的实施方式中，本发明的方法包括：确定选自C2321、T9763、C9796、 T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、A12837、 G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、G15108、 C16954、T17316、T19588和A20170SNP等位基因的至少24个SNP等位基因中每一个的存在。在 另一个实施方式中，本发明的方法包括:在C4基因中检测一个或多个其他SNP。
[0125] 另外，确定移植候选者发展aGVHD的可能性可影响确定移植是否确实是治疗他们 的病情最适合的形式。在某些情况下，可能有替代形式的治疗，其提供给患者更好的预后。 同时，aGVHD可能性的预测将指示治疗方案的必要性，或者指示可能比推荐方案更具侵袭性 (aggressive)的治疗方案。这种侵袭性疗法通常具有不期望的副作用，因此优选不使用，除 非预后表明需要。例如，用中和性抗TNF-α单克隆抗体治疗患者可导致aGVHD的改善，但是可 增加感染风险。也可使用多种侵袭性抗炎疗法。
[0126] 单核苷酸多态性(SNP)
[0127] 所有生物体的基因组在其持续进化过程中都经历自发突变，产生祖先遗传序列的 变异形式。多种形式的遗传序列的并存导致了遗传多态性，这包括单核苷酸多态性，也被称 为"SNP" ANP也可出现在没有明显功能的基因组区域中，但SNP可以在基因组中与变异序列 遗传连锁。因此，SNP可以与基因组的变异序列密切相关，这取决于遗传连锁的接近程度。
[0128] SNP是DNA中的单碱基位置，在此位置不同的等位基因或替代性核苷酸在群体中出 现。例如，来自不同个体的两个经测序的DNA片段，AAGCgTA与AAGCJTA，具有单核苷酸差异。 在这种情况下，称之为存在两个等位基因。最常见的SNP仅具有两个等位基因。
[0129] 单核苷酸多态性可以落入基因的编码序列、基因的非编码区或基因间区域(基因 之间的区域）。由于遗传密码的简并性，编码序列中的SNP不一定会改变所产生的蛋白的氨 基酸序列。
[0130] 编码区的SNP有两种类型：同义SNP和非同义SNP。同义SNP不影响蛋白序列，而非同 义SNP改变蛋白的氨基酸序列。不在蛋白编码区的SNP仍可以影响基因剪接、转录因子结合、 信使RNA降解或非编码RNA序列。受这种类型的SNP影响的基因表达的称为eSNP(表达SNP)， 且可以在基因的上游或下游。
[0131]在定义SNP的位置、SNP等位基因或核苷酸序列时，提及核酸分子一条链上特定位 点处的腺嘌呤、胸腺嘧啶(尿嘧啶）、胞嘧啶或鸟嘌呤也限定了所述核酸分子的互补链上的 相应位置处的胸腺嘧啶（尿嘧啶）、腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶（分别对应）。因此，可以参考任 一条链来指定特定的SNP位置、SNP等位基因或核苷酸序列。SNP的位置也可通过参考基因的 起始密码子(也称"开始"密码子)的第一个碱基来确定。
[0132] 单核苷酸多态性的检测
[0133] 可以使用本领域中已知的允许定性和/或定量评价样品中的单核苷酸多态性等位 基因的任何适合技术。另外，可通过参考标准对照或对照样品来进行比较。
[0134] 可用于检测单核苷酸多态性的方法包括PCR、LCR(配体链反应)和杂交技术。"聚合 酶链反应"（PCR)是一种反应，其中复制的拷贝从靶多核苷酸产生，其中使用由"正向"和"反 向"引物组成的"引物对"或"引物组"以及聚合催化剂，例如DNA聚合酶和常见的热稳定聚合 酶。用于PCR的方法是本领域已知的，且在例如"PCR"（编者MJ.McPherson和S.G Moller (2000)BI0S Scientific Publishers Ltd，0xford)中有所教导。可以对从生物样品中分离 出的mRNA反转录得到的cDNA进行PCR。
[0135] 引物通常是寡核苷酸，通常为约20个核苷酸长，最小约15个核苷酸长，其能够以序 列特异性形式与靶序列杂交，并且在PCR过程中延伸。较长的核酸分子，例如至少50或100或 更多核苷酸长度的核酸分子，也可以用作引物。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物为 包含所述引物和新合成的靶序列拷贝的延伸产物。多重PCR体系包含多个引物组，其引起多 于一个扩增子的同时产生。引物也可以包含附加的序列和/或经修饰或标记的核苷酸，以便 于捕获或检测扩增子。DNA热变性、引物与其互补序列的复性(anneal)、以及复性引物在聚 合酶下延伸的重复循环产生了靶序列的指数扩增。术语靶或靶序列或模板指被扩增的核酸 序列。
[0136] 另一种核酸扩增技术是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。首先，使用逆转录酶从 RNA模板产生互补DNA(cDNA)，然后对得到的cDNA进行PCR。
[0137] 另一种扩增方法为EP 0 320 308中公开的连接酶链式反应(LCR)。在LCR中，准备 两个互补探针对，在靶序列的存在下，每对将结合到靶的相对互补链上以使它们紧邻。在连 接酶的存在下，这两个探针对将连接形成单个单元。通过温度循环(如在PCR中），结合的连 接单元从靶上脱离，然后充当"靶序列"来连接过量的探针对。美国专利4,883,750描述了一 种类似于LCR的使探针对结合至靶序列的方法。
[0138] 用于扩增核酸分子的其它方法是本领域技术人员已知的，并且包括等温扩增方法 和基于转录的扩增系统。本发明的方法中可使用任何适合的扩增核酸构建体或其片段或者 分离的或外源核酸分子或其片段的方法。
[0139] 等位基因特异性PCR(例如ASA、ARMS、SSP)在基因分型中是有用的技术，因为其允 许以顺式定位(cis-located)方法检测多态性。所述方法作为快速和相对容易的基因分型 方法已广泛用于多种应用中，特别是在HLA基因分型领域和其他复杂的基因分型应用(例如 ΑΒ0基因分型）中。
[0140] 本发明的基因分型方法、试剂盒和组合物可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种引物或正向/反 向引物对。特别而言，这样的引物用于扩增C4基因中的一个或多个单核苷酸多态性等位基 因基因座。
[0141] 杂交技术涉及检测两个或多个核酸分子的杂交，其中检测是以多种方式实现的， 包括标记核酸分子和观察由这种标记生成的信号。杂交技术可以包括任何下列技术： Northern和Southern印记、循环探针反应、分枝DNA、Invader测定和杂交捕获。杂交技术也 可以用来鉴定存在于样品中的特定核酸序列，其通过使用已知的核酸序列的阵列来探测样 品。阵列技术可以使用已知的单链核酸，其中每个独特的短链被连接在特定的已知位置，然 后添加样品核酸，使存在于样品中的序列杂交于固定的链。然后通过在杂交前对所要检测 的样品的片段加标记(例如末端加标记)来检测这种杂交。另外，可以使用荧光原位杂交技 术来确定杂交。
[0142] 本发明的方法中可以使用的常见的基因分型方法包括但不限于:TaqMan测定、分 子信标测定、核酸阵列、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性PCR、阵列引物延伸、均 相引物延伸测定、带质谱法检测的引物延伸、焦磷酸测序、基因阵列上分列的多重引物延 伸、滚环扩增连接、均相连接、寡核苷酸连接测定(OLA)、基因阵列上分列的多重连接反应、 限制性片段长度多态性、单碱基延伸标签测定及Invader测定。这些方法可以结合检测机制 使用，例如发光或化学发光检测、荧光检测、时间分辨荧光检测、荧光共振能量转移、荧光偏 振、质谱法及电检测。
[0143] 检测多态性的其它方法包括但不限于：使用防裂解剂的保护来检测RNA/RNA或 RNA/DNA中的错配碱基的方法，比较核酸分子的电泳迀移率，和使用变性梯度凝胶电泳在包 含梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中测定多态性片段的移动。特定位置的序列变化也可以通 过核酸酶保护测定来评价，例如RNase和SI保护或化学裂解方法。
[0144] 在一个实施方式中，检测一个或多个SNP或单倍体分型使用TaqMan测定来进行，其 也被称为5 '核酸酶测定。TaqMan测定检测PCR过程中特定扩增产物的积累。TaqMan测定使用 带荧光报告染料和猝灭染料标记的寡核苷酸探针。报告染料被合适波长的照射所激发，其 通过称为荧光共振能量转移(FRET)的过程将能量转移到同一探针内的猝灭染料。当连接到 探针时，激发的报告染料不发射信号。在完整探针中猝灭染料与报告染料的接近使报告剂 保持降低的荧光。报告染料和猝灭染料可分别在5'末端和3'末端，或者反之。或者，报告染 料可在5 '末端或3 '末端，而猝灭染料连接到内部核苷酸，或反之。
[0145] PCR中，DNA聚合酶的5'核酸酶活性切割探针，因此分离报告染料和猝灭染料，引起 报告剂荧光的增加。PCR产物的累积通过监测报告染料的荧光增加来直接检测。仅当探针杂 交到在PCR中扩增的包含靶SNP的模板上时，DNA聚合酶才会在报告染料和猝灭染料之间切 割探针，且探针被设计成仅当特定SNP等位基因存在时才会杂交至靶SNP位点。
[0146] 优选的TaqMan引物和探针序列可使用本文描述的SNP和相关核酸序列信息容易地 确定。可以使用多个计算机程序，例如Primer Express (Appl ied Biosystems，Foster City，Calif.)，以快速得到最优的引物/探针组。对于本领域技术人员显而易见的是，这些 用于检测SNP等位基因的引物和探针在本发明的方法中是有用的，且可容易地纳入试剂盒 形式中。
[0147] 在寡核苷酸连接测定(0LA)中，一个探针杂交至革E核酸的区段，其3'最末端与所述 核酸位点对齐。第二探针杂交到靶核酸分子的邻接区段，直接位于第一探针的3'侧。这两个 并置的探针与靶核酸分子杂交，并且如果第一探针的3'末端核苷酸与所述核酸位点之间存 在完美互补，则这两个探针在连接剂(例如连接酶)的存在下连接。如果存在错配，则不会出 现有效连接。反应后，连接的探针与靶核酸分子分离，并作为核酸序列存在的指标被检测 到。0LA还可用于使用通用阵列的核酸检测，其中可将地址编码(zipcode)序列引入一个杂 交探针中，获得的产物或扩增产物杂交至通用地址编码阵列。或者，可以在将地址编码并入 0LA探针的情况下使用0LA，扩增的PCR产物通过电泳或通用地址编码阵列读出来确定。
[0148] 作为另一选择，对于多重SNP检测可以使用SNPlex方法和软件，其在0LA后使用 PCR，其中将地址编码并入了0LA探针中，且扩增的PCR产物与ZipChute试剂杂交，并且由该 ZipChute的电泳读出结果来确定SNP的身份。在某些实施方式中，0LA在PCR(或其他核酸扩 增方法)前进行。在另一些实施方式中，PCR(或其他核酸扩增方法)在0LA前进行。
[0149] 确定SNP和SNP单倍型的另一种方法是基于质谱法。质谱法利用了 DNA的四种核苷 酸各自的独特质量。通过测量具有可选择的核苷酸等位基因的核酸的质量差，可以通过质 谱法对核酸进行明确的基因分型。MALDI-TOF(基质辅助型激光解吸电离-飞行时间）质谱技 术优选用于分子量的高度精确确定，例如用于SNP。基于质谱法已经开发了许多基因型分析 方法。优选的基于质谱法的核酸基因分型方法包括引物延伸测定，它也可与其它方法结合 使用，例如传统的基于凝胶的形式和微阵列。
[0150]通常，引物延伸测定包括设计引物并使引物从靶核酸位置上游(5'）与模板PCR扩 增产物复性。将三磷酸双脱氧核苷酸(ddNTP)和/或三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)的混合物添加 到包含模板的反应混合物中。例如，在某些实施方式中，其为包含SNP的核酸分子，通常其已 通过例如PCR被扩增。可进一步添加引物和DNA聚合酶。引物的延伸终止于模板中与混合物 中的一种ddNTP互补的核苷酸出现的第一个位置。引物可以与该核酸位置紧邻（即，引物的 3'末端的核苷酸与相邻于靶SNP位点的核苷酸杂交），或者与该核酸位置相差两个以上核苷 酸。如果引物与靶核苷酸位置相差几个核苷酸，唯一限制是引物的3'末端和该核酸位置之 间的模板序列不能包含与所要检测的核苷酸相同类型的核苷酸，否则这将导致延伸引物的 过早终止。
[0151] 作为另一选择，如果仅将全部四种ddNTP(没有dNTP)加入到反应混合物中，引物将 总是延伸仅一个核苷酸，以对应于靶SNP位置。在这种情况下，将引物设计为结合所述SNP位 置上游的一个核苷酸（即，引物的3 '末端核苷酸与在靶SNP位点5 '侧上紧邻靶SNP位点的核 苷酸杂交）。仅延伸一个核苷酸是优选的，因为它最大程度地减小了延伸的引物的总质量， 因而增加了可选择的SNP核苷酸之间的质量差的分辨率。此外，带质量标记的ddNTP可用于 弓丨物延伸反应中，以代替未修饰的ddNTP。这增加了用ddNTP延伸的引物之间的质量差，从而 提供增加的灵敏度和准确度，并且对分型杂合碱基位置特别有用。质量标记也缓解了对密 集样品制备过程的需要并降低了质谱分析仪的必需分辨力。
[0152] 然后，可以将延伸的引物纯化，并通过MALDI-T0F质谱法来分析，以确定存在于靶 SNP位置的核苷酸的身份。在一种分析方法中，将来自引物延伸反应的产物与形成基质的光 吸收晶体结合。然后用能源(例如激光)冲击所述基质以将核酸分子电离并解吸为气相。然 后将离子化的分子喷射到飞行管中并沿着该管朝向检测器加速。电离事件(例如激光脉冲） 和分子-检测器碰撞之间的时间为所述分子的飞行时间。飞行时间与离子化分子的质荷比 (m/z)精确相关。具有更小的m/z的离子比具有更大的m/z的离子沿管行进得更快，因此较轻 的离子先于较重的离子到达检测器。然后将飞行时间转换为相应的高度精确的m/z。以此方 式，可以基于细微的质量差和相应的飞行时间差(在单个碱基位置具有不同核苷酸的核酸 分子的固有属性)来鉴定SNP。
[0153] 核酸也可以通过直接DNA测序来评分。可以使用多种自动测序程序，包括质谱法测 序。根据本文的教导，本领域普通技术人员可以容易地设计出用于这种自动测序程序的测 序引物。商业设备，比如Applied Biosystems 377,3100,3700,3730和373(^10嫩分析仪 (Foster City，Calif.)，在本领域中常用于自动测序。核酸序列的确定也可以采用高通量 突变筛选系统，例如Spectru Medixsystem。
[0154] 在一个实施方式中，一个或多个单核苷酸多态性等位基因的存在使用下一代测序 (NGC)技术来确定。下一代测序(NGS)技术包括能够在每次仪器运行中对超过10 14个碱基对 (kbp)的DNA进行测序的仪器。通常，测序产生大量的独立读出序列，每个代表核酸的10至 1000个碱基之间的任何位置。通常为了置信度而对核酸进行冗余测序，将每单位区域的复 制称为覆盖度（即，"10 X覆盖度"或"100 X覆盖度"）。下一代测序方法是本领域已知的，并 且描述于例如Metzker(2010)中。
[0155] 因此，本文使用的术语"下一代测序"或"NGS"或"NG测序"指确定个体核酸分子(例 如，在单个分子测序中）或以高通量模式克隆扩增的个体核酸分子的代替物(例如，同时测 序多于10 3、104、105或更多分子)的核苷酸序列的任何测序方法。
[0156] 用于下一代测序的平台包括但不限于Roche/454基因组测序仪（GS)FLX系统、 Illumina/Solexa基因组分析仪(GA)、Life/APG的支持寡核苷酸连接检测（SOLiD)系统、 Polonator 的G · 007系统、He licos BioScience s 的He 1 i Scope基因测序系统及 Pacific Biosciences的PacBio RS系统。
[0157] 在一个实施方式中，确定一个或多个SNP的存在涉及靶向型下一代测序（也称为 "靶标捕获"或"序列捕获"下一代测序）。这种靶标富集技术在测序前利用单链寡核苷酸探 针来捕获来自DNA样品的候选基因组区域(参见例如Shen等，2013)。现在有若干种靶标富集 策略，其共同目标是以高准确性和完全性捕获候选基因组区域，同时降低成本。最广泛使用 的方法利用多重PCR扩增、杂交捕获、选择性靶标环化和寡核苷酸选择性测序。
[0158] HLA等位基因及HLA分型
[0159] 本领域技术人员将会理解本发明的方法可以与HLA分型结合使用。当与HLA等位基 因关联使用时，术语"分型"指等位基因的鉴定，即检测等位基因并将该等位基因与相同基 因座的其它等位基因区分开。因此，本发明的方法可以进一步包括:确定非C4基因中一个或 多个HLA SNP的存在，或确定在潜在移植供体和/或受体中一个或多个非C4基因的HLA单倍 型的存在。如本文使用的，术语"单倍型"指通常一起遗传的遗传变异或标志物（"等位基 因"）的任意组合。
[0160] 分子HLA分型方法依赖于通过聚合酶链式反应(PCR)或其它适合的技术扩增足够 拷贝数的HLA序列。用于HLA分型的PCR扩增可以是基因座特异性、等位基因组特异性或等位 基因特异性的，视所使用的技术而定。进一步测试扩增子以检测特定多态性序列，例如定义 编码特定HLA抗原的特定HLA等位基因或相关等位基因的组的那些多态性序列。
[0161] HLA分子中的多态性主要发生在包含肽结合区域的蛋白结构域中。对于I类HLA分 子，DNA分型方法主要集中在第二和第三个外显子上，其编码HLA-A、HLA-B和Cw重链的第1和 第2结构域。对于II类分子，肽结合位点由α和β链的第一结构域组成，其由它们各自基因的 第二个外显子编码。
[0162] 对于HLA-DR，仅β链是多态性的。因此，DR分型策略一般集中在DRB1、DRB3、DRB4和 DRB5基因的第二个外显子上。应该指明，DRB1基因座的等位基因编码血清学确定的DR抗原 1-18,而DRB3-5基因座分别编码DR52、DR53和DR51抗原。所有的个体都携带DRB1基因，但是 DRB3-5基因的存在因特定单倍型携带不同的DRB1基因而变化。因此，个体可以具有少至一 种DR抗原（如果它们对DR1、DR8或DR10是纯合子的）或者多至四个DR抗原(例如，DR15、DR17、 DR51、DR52)。由于对α和β链均具有特异性的HLA抗体的报道，近年来另外的注意力集中在 HLA-DQ和DP抗原上。因此，HLA-DQ和DP的完全分型也必须考虑多态性α链的第二个外显子。
[0163] 试剂盒
[0164] 本发明提供用于为受体鉴定移植供体的试剂盒。所述试剂盒可适用于核酸物种的 检测，或者可用于多肽基因产物的检测。
[0165] 对于核酸的检测，所述试剂盒可包含第一容器，例如小瓶或塑料管或微孔板，其包 含一种或多种寡核苷酸探针。可选地，试剂盒可包含装有引物的第二容器。探针可以是可与 包含单核苷酸多态性基因座的DNA杂交的探针，或包含能够与多个单核苷酸多态性基因座 杂交的多个探针。也可以开发包含固定在固体支持物上的寡核苷酸探针的试剂盒，例如，使 用阵列。
[0166] 对于核酸的PCR扩增，试剂盒中可以包括核酸引物，其与包含单核苷酸多态性基因 座的核酸的至少一部分互补。引物组通常包含至少两种能够特异性扩增DNA的寡核苷酸。可 包含允许进行定量PCT确定的带荧光标记的寡核苷酸（例如，TaqMan化学、分子信标）。还可 以包括用于DNA扩增的适合的酶。
[0167] 在试剂盒中可以包含对照核酸，目的是进行对比或验证。
[0168] 实施例
[0169] 实施例1. C4基因中SNP的祖先单倍型特异性。
[0170] 使用序列特异性引物(SSP)来检测补体C4基因中的8.1祖先单倍型(AH)特异性SNP 对（图2)。样品1具有8.1AH的α、β和δ区块标志物，并且对γ区块SNP标志物测试呈阳性。样品 2、3和4不具有8.1ΑΗ的任何标志物，并且对γ区块SNP标志物的SSP测试是阴性的。
[0171]图3的表显示出，许多具有相同的C4同种异型的样品具有不同的SNP谱。某些SNP在 多种样品中发现，而某些看上去对于样品是独特的（祖先单倍型）。该数据表明SNP谱是MHC 祖先单倍型的γ区块的标志物，且不是样品的同种异型。#8和#15 γ型测定是针对C4A和C4B 的对照SSP测定，且未列出。
[0172] 实施例2.示例性PCR分型试剂盒
[0173] 本发明的发明人开发了一种PCT测定试剂盒，用于匹配患者和供体以减少严重急 性移植体抗宿主病的风险。该PCR试剂盒包含含有PCR缓冲液、dNTP、MgCl 2和序列特异性引 物及单瓶DNA聚合酶的26种混合物。用于扩增C4基因单核苷酸多态性的每种混合物以单瓶 880μ1提供。在测定中所要扩增的单核苷酸多态性是六13189、1!4952、612749)13950-A14483、G12071、A11483、T9763、A12152、A14831、T14757、C16954、T9881、C9796、A12568-八12837、1'19588、1'10289、厶11437、1'14563、厶20170、1'17316、(：10676、615108、1'10309和/或 C13193中的一个或多个。所述测定试剂盒进一步包含用于扩增C4A和C4B基因内部片段的对 照混合物。
[0174]优选地，在该测定试剂盒中所要测试的DNA样品是高分子量人类基因组DNA，其在 Tris/EDTA缓冲液中的浓度范围为20-100ngAU，且0D26Q/28()>1.8,其提取自ACD或EDTA抗凝 全血样本中。
[0175] PCR测定步骤
[0176] 1.为每个待测试样品设定所有的PCR测定混合物。
[0177] 2.使所述测定混合物在室温快速解冻。一旦解冻，对混合物进行短暂涡旋。
[0178] 3.将7.85μ1的每种混合物加入到反应孔中。将7.85μ1加入到每个待测试样品的不 扩增对照孔中。
[0179] 4.为在测定中所要分型的每个样品制备DNA(64μ1)和DNA聚合酶（4.8μ1)的混合 物。
[0180] 5.将2.15μ1的DNA/聚合酶混合物分配到每个反应孔中。
[0181 ] 6.将反应孔密封并且通过涡旋和短暂离心而轻轻混合。
[0182] 7.将反应孔放置到热循环仪中并且施加以下扩增条件：
[0184] 8.在完成PCR时，将扩增板从热循环仪中移出，对其直接进行凝胶电泳，或储存在4 °(：直至需要使用。
[0185] 琼脂糖凝胶电泳及说明
[0186] 1.内参对照和靶扩增子的扩增通过琼脂糖凝胶电泳来确认，其中使用2μ1的每种 PCR产物与5μ1的上样缓冲液(可使用其它体积)的组合。推荐使用1%的琼脂糖凝胶。
[0187] 2.在每个测试样品的不扩增对照中必须没有PCR产物。如果条带明显，可能发生了 某些水平的污染，并且必须重新运行。
[0188] 3.所有的阴性反应应当扩增内参对照扩增子。
[0189] 4.所有的阳性序列特异性PCR(SSP)将导致靶扩增子的扩增。扩增子的预期大小列 在表1中。
[0190] 表1.扩增产物的预期大小。

[0192] 实施例3.针对γ型（SNP)匹配患者。
[0193] 针对SNP组，使用PCR-SSP测定对患者和供体进行了分型。如果供体或患者对于来 自26个SNP的组的至少一个SNP是阳性而对应的供体/患者不是，则将患者/供体对定义为不 匹配（图4和图5)。图4显示出γ型不匹配导致严重aGVHD的风险增加。针对γ型匹配(M)和不 匹配(ΜΜ)的患者(X)，及该患者是否被诊断为有急性GVHD和急性GVHD等级。图5显示出γ型 匹配导致长时间生存的机会增加。
[0194] 实施例4. γ型PCR分型试剂盒的另一个实施例。
[0195] 本发明的发明人开发了另一种用于匹配患者和供体以降低严重急性GVHD风险的 PCT测定试剂盒。所述PCR试剂盒包含25种混合物，其包含:PCR缓冲液、dNTP、MgCl2和序列特 异性引物、不扩增对照混合物、和单瓶DNA聚合酶。将每个用于扩增C4基因单核苷酸多态性 的混合物提供到32孔板的单个孔中。在测定中所要扩增的单核苷酸多态性为A13189、 T14952、G12749、G12071、A11483、T9763、A12152、A14831、T14757、C16954、T9881、C9796、 A12568-A12837、T19588、T10289、A11437、T14563、A20170、T17316、C10676、G15108、T10309 和/或C13193中的一个或多个。该测定试剂盒进一步包含用于扩增C4A和C4B基因内部片段 的对照混合物。
[0196] 优选地，在该测定试剂盒中所要测试的DNA样品为高分子量人类基因组DNA，其在 Tris/EDTA缓冲液中的浓度范围为20-100ngAU，且0D26Q/28()>1.8,且其提取自ACD或EDTA抗 凝全血样本。
[0197]
[0198] 1.PCR 设置
[0199] 1.1对于单个样品，每个32孔反应板都包含足够的γ型混合物。在室温下快速解冻 所述γ型混合物/反应板。一旦解冻，短暂涡旋并且离心所述32孔板以确保所有的混合物下 落到孔的底部。
[0200] 1.2根据下表2,为每个待分型的样品制备基因组DNA和DNA聚合酶(DNA P0L-γ型） 的混合物。对于每个新的PCR，其应当新鲜配制。脉冲涡旋所述溶液3-4次以混合。
[0201] 表2.每个样品所要求的DNA/聚合酶混合物的组成
[0203] 1.3将2yL DNA/聚合酶混合物分配到每个反应孔中。密封所述反应孔，并且轻轻混 合。短暂离心所述反应孔。
[0204] 1.4将反应孔放置到热循环仪中，并且根据下列热循环条件进行扩增：
[0206] 1.5扩增需要约2.5小时完成。当PCR完成时，将所述板从热循环仪中移出，产物通 过凝胶电泳直接分析，或储存在4°C直至需要使用。
[0207] 2.琼脂糖凝胶电泳及说明
[0208] 2.1内参对照和靶扩增子的扩增通过琼脂糖凝胶电泳来确认，其中使用2μ1每种 PCR产物与5μ1上样缓冲液(其它的上样缓冲液体积应当在使用前进行验证)的组合。推荐使 用2 %的琼脂糖凝胶。
[0209] 2.2在每个测试样品的阴性对照孔中（混合物26)必须没有PCR产物。如果条带明 显，可能发生了某些水平的污染，并且必须重新运行。
[0210] 2.3所有的阴性γ型反应应当扩增内参对照扩增子。如果靶扩增子和内参对照扩 增子都不明显，则反应不能被解释，并且应当在相关的γ型工作表上记录"失败"（〇)。
[0211] 2.4在扩增靶扩增子时，观察和记录阳性γ型反应。当对反应进行评分时，对照表1 来检查每个靶扩增子的预期大小。阳性反应可呈现强的靶扩增子和非常弱的或消失的内参 对照。这是可接受的阳性反应。当对反应评分时，记录结果中使用数字'1'记录阴性反应并 且使用数字'2'记录阳性反应。任何失败的反应(如2.3中描述的)应当记录为'0'。
[0212] 2.5患者γ型谱可与供体γ型谱比较，以辅助对γ区块匹配的预测。为此，应该在 工作表中记录每个测试的患者和潜在供体的相关样品信息，这包括姓名、样品ID和DNA浓 度。γ型凝胶图像的拷贝可输入工作表。然后可以通过用"2"给呈现靶条带的阳性反应打分 和用"Γ给仅呈现内参对照条带的阴性反应打分来解读凝胶图像。失败或"不扩增"的反应， 其中靶标和内参对照均缺失，用"0"评分。这些结果应当输入到患者和供体的工作表中。
[0213] 2.6-旦所有的结果被输入和评分，对结果进行比较以查明是否任何分型/输入的 供体与患者为γ型匹配。如果检测到污染或任何反应失败，可能需要重复进行测试。
[0214] 图6显示了 γ型匹配(Α)和不匹配(Β)的个体的γ型PCR SSP分析。
[0215] 实施例5. γ型回顾性研究。
[0216] 对225个无关造血干细胞移植(HSCT)供体-受体对进行回顾性研究，这些供体-受 体对来自从1996至2005年在3个巴西中心进行的移植。移植对中的每个个体使用Luminex技 术进行HLA分型（A、B、C、DRB1、DQB1)。通过PCR-SSP分析用23个SNP及C4A和C4B同型特异性 SNP进行γ型测定，在移植/受体对中γ型SNP谱完全匹配时记录γ型匹配。在SNP谱中有至 少一个SNP差异时记录γ型不匹配。
[0217] 分析HLA型和γ型谱证明了HLA不匹配的对更可能是γ型不匹配的（表3)。
[0218] 表3.HLA不匹配的对更可能是γ型不匹配的
[0220] 卡方检验ρ〈0·001
[0221] 另外，本发明的发明人发现，10/10HLA匹配的对中γ型匹配降低了cGvHD和III/IV 级aGvHD的风险（图7)。据显示，9/10HLA匹配的对中γ型匹配显著提高了存活，这可能是平 衡疾病复发和GvHD的结果。在此方面，本发明人发现γ型匹配、HLA 9/10匹配的患者的存活 率超过γ型匹配且HLA 10/10匹配的患者。
[0222]总的来说，本发明的发明人确定了非HLA基因组序列影响无关造血干细胞移植的 结果。这表明γ型匹配和高分辨率HLA分型导致了对造血干细胞移植结果至关重要的非HLA 基因座匹配。因此，本发明的γ型测定可以用于鉴定最佳供体，以用于在无关HSCT后改进结 果。
[0223] 本领域技术人员会知晓，在不脱离广泛描述的本发明的范围的情况下，可以对具 体实施方式中所显示的发明进行多种修改和/或变化。因此，本发明的实施方式仅是说明性 的且非限制的。
[0224] 本文讨论和/或参考的所有出版物都以其整体并入本文。
[0225] 本申请要求AU 2013903971的优先权，将其全部内容作为参考并入本文。
[0226] 对本说明书中所包括的任意文件、发案、材料、设备、物品等的讨论仅以为本发明 提供语境为目的。不应认为这是承认它们中的任何一个或全部因存在于本申请每个权利要 求的优先权日之前而构成部分现有技术基础或本发明相关领域的公知常识。
[0227] 参考文献
[0228] Fernando等（2010)Hum Mutat，31(7):866-874
[0229] Metzker(2010)Nat Rev Genet,11(1):31-46
[0230] Petersdorf等（2007)PL〇S Med，4(l):e8
[0231] Shen等（2013)Genome Medicine，5:50〇
【主权项】
1. 一种为需要移植的受体鉴定移植供体的方法，所述方法包括： a) 确定在需要移植的受体的MHC γ区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的存 在； b) 确定在一个或多个潜在移植供体的MHC γ区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基 因的存在;和 c) 基于同时在所述移植供体和需要移植的所述受体的MHC γ区块中一个或多个单核苷 酸多态性等位基因的存在，鉴定移植供体。2. -种降低移植受体发展移植物抗宿主病的可能性的方法，所述方法包括： a) 确定在需要移植的受体的MHC γ区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的存 在； b) 确定在一个或多个潜在移植供体的MHC γ区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基 因的存在； 其中，同时在所述移植受体和一个或多个潜在移植供体的MHC γ区块中一个或多个单 核苷酸多态性等位基因的存在表明所述移植受体在从所述移植供体移植了移植物后发展 移植物抗宿主病的可能性降低。3. 如权利要求1或2所述的方法，其中，确定在需要移植的受体和/或潜在供体的MHC γ 区块中一个或多个单个多核苷酸多态性等位基因的存在的步骤包括:获得预定的MHC γ区 块单核苷酸多态性等位基因信息和/或MHCγ区块单倍型信息。4. 如权利要求1~3中任一项所述的方法，其中，确定在潜在移植供体的受体的MHC γ区 块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的存在的步骤包括:分析来自所述受体和/或来 自潜在供体的核酸样品以确定所述一个或多个单核苷酸多态性等位基因的存在。5. 如权利要求4所述的方法，其中，分析核酸样品的步骤包括:进行选自PCR-SSP测定、 等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、核酸测序、5' 核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析、单链构象多态性分析、变性梯度 凝胶电泳和直接核苷酸测序中的一种或多种的技术。6. 如权利要求4或5所述的方法，其中，所述方法包括从潜在移植供体和/或受体获得生 物样品并且从所述生物样品中分离出核酸。7. 如权利要求4或5所述的方法，其中，所述核酸样品从获自潜在移植供体和/或受体的 生物样品中分离出。8. 如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述方法包括确定至少24个单核苷酸多 态性等位基因的存在。9. 如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述方法还包括:在受体和潜在移植供体 中检测一个或多个其它等位基因的存在或确定一个或多个其它单倍型的存在。10. 如权利要求9所述的方法，其中，所述方法还包括确定一个或多个其它HLA等位基因 和/或HLA单倍型。11. 如前述任一项权利要求所述的方法，其中，所述方法还包括基于以下i)或ii)来选 择移植供体： i) 在潜在移植供体的MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的存在，或 ii) 在潜在移植供体中MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的存在以及 一个或多个其它HLA等位基因和/或HLA单倍型的存在。12. -种将同种异基因移植物移植到受体中的方法，所述方法包括： i)根据权利要求11所述的方法选择移植供体， i i)从所述移植供体中移出供体移植物，和 i i i)将所述移植物移植到受体中。13. -种用于为受体鉴定移植供体的试剂盒，所述试剂盒包含： a) 用于检测MHCy区块中一个或多个单核苷酸多态性等位基因的核酸试剂;和 b) 用于检测所述一个或多个单个多核苷酸多态性等位基因的说明书。14. 如权利要求13所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含对MHC γ区块中的一个或多个 单核苷酸多态性等位基因具有特异性的寡核苷酸探针。15. 如权利要求14所述的试剂盒，其中，所述寡核苷酸探针带有可检测标记。16. 如权利要求13~15中任一项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包含用于扩增MHC γ 区块中的一个或多个单核苷酸多态性等位基因的寡核苷酸引物。17. 如权利要求16所述的试剂盒，其中，所述试剂盒适于进行PCR-SSP测定。18. -种用于为受体鉴定移植供体的核苷酸阵列，所述核苷酸阵列包含对MHCy区块中 的一个或多个单核苷酸多态性等位基因具有特异性的探针。19. 一种进行一个或多个PCR-SSP测定以检测MHC γ区块中的单核苷酸多态性的方法， 所述方法包括： i) 将基因组DNA与DNA聚合酶混合以形成DNA-聚合酶混合物， ii) 将所述DNA-聚合酶混合物与用于扩增来自MHCy区块的单核苷酸多态性等位基因 的寡核苷酸引物合并，以形成反应混合物，及 i i i)使所述反应混合物经历热循环以产生扩增产物。20. 如权利要求19所述的方法，所述方法还包括分析所述扩增产物以检测所述单核苷 酸多态性。21. 如权利要求20所述的方法，其中，所述扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳来分析。22. 如权利要求19~21中任一项所述的方法，其中，所述基因组DNA是高分子量人类基 因组DNA。23. 如权利要求19~22中任一项所述的方法，其中，所述基因组DNA的浓度为约20ngAU 至约 lOOng/μΙ。24. 如权利要求19~23中任一项所述的方法，所述方法包括从生物样品中提取基因组 DNA025. 如权利要求24所述的方法，其中，所述方法包括从酸-柠檬酸盐-葡萄糖溶液(ACD) 或EDTA抗凝全血中提取基因组DNA。26. 如权利要求19~25中任一项所述的方法，其中，所述基因组DNA的光密度(OD)比的 测量值为0D26Q/28Q〉1 · 8 〇27. 如权利要求19~26中任一项所述的方法，其中，所述单核苷酸多态性等位基因在C4 基因中。28. 如权利要求27所述的方法，其中，所述单核苷酸多态性等位基因选自C2321、T9763、 C9796、T9819、T9881、T10289、T10309、C10676、A11437、A11483、G12071、A12152、A12568、 A12837、G12749、A12877、A13189、C13193、A13950、A14483、T14563、T14757、A14831、T14952、 615108、(：16954、1'17316、1'19588和/或厶20170。29. 如权利要求28所述的方法，其中，所述方法包括检测至少24个单核苷酸多态性等位 基因。30. -种为需要移植的受体鉴定移植供体和/或减少移植受体发展移植物抗宿主病的 可能性的方法，所述方法包括进行权利要求19-29中任一项所述的方法以鉴定移植受体和/ 或潜在移植供体的MHC γ区块中的单核苷酸多态性。31. 权利要求13~17中任一项所述的试剂盒或权利要求18所述的核苷酸阵列在鉴定移 植受体和/或潜在移植供体的MHC γ区块中的单核苷酸多态性中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105899675SQ201480067952
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年10月15日
【发明人】D·C·塞伊尔, H·M·霍干, K·梅尔考利亚
【申请人】康内西奥基因组学私人有限公司