专利名称：猪肉及其制品中弓形虫rt-lamp快速检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域,涉及一种快速检测肉制品中弓形虫(7 gondii)的逆转录环介导等温扩增技术(Reverse Transcription Loop-Mediated IsothermalAmplification, RT-LAMP)检测方法，具体涉及一种猪肉及其制品中弓形虫RT-LAMP快速检测方法。
背景技术：
弓形虫病(toxoplasmosis)由刚地弓形虫)引起的一种人畜共患病，弓形虫病不仅给养猪业造成巨大损失，还严重威胁着人类的食品卫生安全和人类健康。猪肉是人们生活中最主要的动物性食品来源，人群可通过携带弓形虫的猪肉、肝脏等 动物源性产品而感染，猪弓形虫病的高发严重威胁着人类健康，对公共食品安全造成极大危害，目前，弓形虫的检测主要依靠血清学、病原形态鉴定等传统方法，然而，这些检测方法都有不足之处，如检测时间长，检测程序繁琐，工作量大，很难适应现代化食品安全快速检测的需要，严格的病原体检测是保障食品安全的重要环节，因此亟需建立一种操作简便、快速准确、灵敏度和特异性都较高的现代化检测弓形虫方法。逆转录环介导等温扩增技术(ReverseTranscription Loop-Mediated
Iso thermal Amp I i f i cat i on, RT-LAMP)特点是针对祀基因的8个区域设计6种特异性引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在大约65°C恒温条件下保温I小时左右即可完成核酸扩增反应，通过直接观察扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度即可判断扩增反应是否进行，具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。弓形虫核糖体RNA (ISsRNA)具有很好的种属特异性，而且18sRNA占细胞RNA总数的80%以上，以弓形虫18sRNA为目的基金诊断肉制品中弓形虫可以提高检测方法的特异性及敏感性，基于ISsRNA的优异性，结合RT-LAMP的快速、简便等优点，建立以18sRNA为目的基因的RT-LAMP快速检测方法，从而为肉制品的安全检测提供有效的手段和研究工具，为动物源性食品安全的监控及政府决策提供系统、科学的资料与依据。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种猪肉及其制品中弓形虫RT-LAMP快速检测方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下
步骤(I).样品前处理
猪肉及其制品取样25g，加入10倍猪肉及其制品体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质I min,制成组织勻楽；样品；
步骤(2).弓形虫RNA提取
取组织匀浆样品转移到离心管后，加入Trizol试剂，其中组织匀浆样品与Trizol试剂的体积含量比为1:10，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心5 min，取上清液至新的离心管中，加入200 μ 氯仿，盖上离心管盖，充分混合至溶液呈乳白状后，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入与该上清液等体积的异丙醇，充分混合后，常温静置10 min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，弃掉上清液，加入I ml体积含量为75%的乙醇洗涤离心管壁，在转速12000 rpm，温度为4 °C条件下离心10 min后，取沉淀物；常温下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
将RNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
步骤(3). RT-LAMP扩增
将RT-LAMP扩增反应体系振荡混匀后，置于65°C水浴锅中反应I h后，置于80°C水浴锅中2 min灭活Bst DNA聚合酶，得到扩增产物；
所述的RT-LAMP扩增反应体系为25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制剂，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜碱，1.0μ I的反转录酶，1.0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物组成；
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，在扩增产物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混匀后置于桌面上拍照并肉眼观察结果；颜色变为绿色为阳性，说明有弓形虫感染，橙色则为阴性，说明无弓形虫感染；或取扩增产物2 3 yL，于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察结果，有梯形条带为阳性，说明有弓形虫感染，无条带则为阴性，说明无弓形虫感染。本发明的有益效果本发明进行了反应的特异性验证和灵敏度检验，证明了引物设计的种间特异性和种内保守性，确保该反应能特异性检测出目标病原体，而避免假阳性的出现；同时确认了该方法可以检测出至少I个弓形虫速殖子。
具体实施例方式下面对本发明作进一步的分析。实施例I
步骤(I).样品前处理
取可疑病猪肉25g，加入10倍可疑病猪肉体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质Imin,制成组织勻楽；样品；
步骤(2).弓形虫RNA提取
取组织匀浆样品转移到离心管后，加入Trizol试剂，其中组织匀浆样品与Trizol试剂的体积含量比为1:10，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心5 min，取上清液至新的离心管中，加入200 μ 氯仿，盖上离心管盖，充分混合至溶液呈乳白状后，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入与该上清液等体积的异丙醇，充分混合后，常温静置10 min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，弃掉上清液，加入I ml体积含量为75%的乙醇洗涤离心管壁，在转速12000 rpm，温度为4 °C条件下离心10 min后，取沉淀物；常温下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
将RNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
步骤(3). RT-LAMP扩增
将RT-LAMP扩增反应体系振荡混匀后，置于65°C水浴锅中反应I h后，置于80°C水浴锅中2 min灭活Bst DNA聚合酶，得到扩增产物；
所述的RT-LAMP扩增反应体系为25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制剂，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜碱，I. O μ I的反转录酶，I. O μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物组成；·
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，在扩增产物中直接加入IyL的SYBR Green I染料，混匀后置于桌面上，颜色变为绿色为阳性，说明有弓形虫感染；取扩增产物3 μ L，于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察，有梯形条带为阳性，说明有弓形虫感染。实施例2
步骤(I).样品前处理
取合格猪肉25 g，加入10倍可疑病猪肉体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质Imin,制成组织勻楽；样品；
步骤(2).弓形虫RNA提取
取组织匀浆样品转移到离心管后，加入Trizol试剂，其中组织匀浆样品与Trizol试剂的体积含量比为1:10，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心5 min，取上清液至新的离心管中，加入200 μ 氯仿，盖上离心管盖，充分混合至溶液呈乳白状后，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入与该上清液等体积的异丙醇，充分混合后，常温静置10 min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，弃掉上清液，加入I ml体积含量为75%的乙醇洗涤离心管壁，在转速12000 rpm，温度为4 °C条件下离心10 min后，取沉淀物；常温下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
将RNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
步骤(3). RT-LAMP扩增
将RT-LAMP扩增反应体系振荡混匀后，置于65°C水浴锅中反应I h后，置于80°C水浴锅中2 min灭活Bst DNA聚合酶，得到扩增产物；
所述的RT-LAMP扩增反应体系为25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制剂，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, 0. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜碱，I. 0μ I的反转录酶，I. 0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物组成；步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，在扩增产物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混匀后置于桌面上拍照并肉眼观察结果；颜色呈橙色则为阴性，说明无弓形虫感染；或取扩增产物2 yL，于2. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察结果，无梯形条带则为阴性，说明无弓形虫感染。实施例3
步骤(I).样品前处理
取样可疑猪肝25 g，加入10倍猪肝体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质I min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).弓形虫RNA提取
取组织匀浆样品转移到离心管后，加入Trizol试剂，其中组织匀浆样品与Trizol试剂的体积含量比为1:10，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心5 min，取上清液至新的离心管中，加入200 μ 氯仿，盖上离心管盖，充分混合至溶液呈乳白状后，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入与该上清液等体积的异丙醇，充分混合后，常温静置10 min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，弃掉上清液，加入I ml体积含量为75%的乙醇洗涤离心管壁，在转速12000 rpm，温度为4 °C条件下离心10 min后，取沉淀物；常温下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
将RNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
步骤(3). RT-LAMP扩增
将RT-LAMP扩增反应体系振荡混匀后，置于65°C水浴锅中反应I h后，置于80°C水浴锅中2 min灭活Bst DNA聚合酶，得到扩增产物；
所述的RT-LAMP扩增反应体系为25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制剂，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜碱，I. 0μ I的反转录酶，I. 0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物组成；
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，在扩增产物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混匀后置于桌面上拍照并肉眼观察结果；颜色呈绿色为阳性，说明有弓形虫感染，或取扩增产物2 yL，于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察结果，有梯形条带为阳性，说明有弓形虫感染。实施例4
步骤(I).样品前处理
取样合格猪肝25 g，加入10倍猪肝体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质I min，制成组织匀浆样品；
步骤(2).弓形虫RNA提取
取组织匀浆样品转移到离心管后，加入Trizol试剂，其中组织匀浆样品与Trizol试剂的体积含量比为1:10，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心5 min，取上清液至新的离心管中，加入200 μ 氯仿，盖上离心管盖，充分混合至溶液呈乳白状后，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入与该上清液等体积的异丙醇，充分混合后，常温静置10 min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，弃掉上清液，加入I ml体积含量为75%的乙醇洗涤离心管壁，在转速12000 rpm，温度为4 °C条件下离心10 min后，取沉淀物；常温下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
将RNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
步骤(3). RT-LAMP扩增
将RT-LAMP扩增反应体系振荡混匀后，置于65°C水浴锅中反应I h后，置于80°C水浴 锅中2 min灭活Bst DNA聚合酶，得到扩增产物；
所述的RT-LAMP扩增反应体系为25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制剂，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜碱，I. 0μ I的反转录酶，I. 0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物组成；
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，在扩增产物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混匀后置于桌面上拍照并肉眼观察结果；颜色呈橙色则为阴性，说明无弓形虫感染；或取扩增产物2 yL，于2. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察结果，无梯形条带则为阴性，说明无弓形虫感染。实施例5
步骤(I).样品前处理
取样可疑肉丸25 g,加入10倍肉丸体积的灭菌蒸懼水中，用组织勻衆机均质I min,制成组织匀浆样品；
步骤(2).弓形虫RNA提取
取组织匀浆样品转移到离心管后，加入Trizol试剂，其中组织匀浆样品与Trizol试剂的体积含量比为1:10，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心5 min，取上清液至新的离心管中，加入200 μ 氯仿，盖上离心管盖，充分混合至溶液呈乳白状后，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入与该上清液等体积的异丙醇，充分混合后，常温静置10 min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，弃掉上清液，加入I ml体积含量为75%的乙醇洗涤离心管壁，在转速12000 rpm，温度为4 °C条件下离心10 min后，取沉淀物；常温下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
将RNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
步骤(3). RT-LAMP扩增
将RT-LAMP扩增反应体系振荡混匀后，置于65°C水浴锅中反应I h后，置于80°C水浴锅中2 min灭活Bst DNA聚合酶，得到扩增产物；所述的RT-LAMP扩增反应体系为25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制剂，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜碱，I. 0μ I的反转录酶，I. 0μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物组成；
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，在扩增产物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混匀后置于桌面上拍照并肉眼观察结果；颜色呈绿色为阳性，说明有弓形虫感染，或取扩增产物2 μ L，于2. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察结果，有梯形条带为阳性，说明有弓形虫感染。实施例6
步骤(I).样品前处理
取样合格肉丸25 g,加入10倍肉丸体积的灭菌蒸懼水中,用组织勻衆机均质I min,制成组织匀浆样品；
步骤(2).弓形虫RNA提取
取组织匀浆样品转移到离心管后，加入Trizol试剂，其中组织匀浆样品与Trizol试剂的体积含量比为1:10，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心5 min，取上清液至新的离心管中，加入200 μ 氯仿，盖上离心管盖，充分混合至溶液呈乳白状后，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入与该上清液等体积的异丙醇，充分混合后，常温静置10 min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，弃掉上清液，加入I ml体积含量为75%的乙醇洗涤离心管壁，在转速12000 rpm，温度为4 °C条件下离心10 min后，取沉淀物；常温下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；
将RNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；
步骤(3). RT-LAMP扩增
将RT-LAMP扩增反应体系振荡混匀后，置于65°C水浴锅中反应I h后，置于80°C水浴锅中2 min灭活Bst DNA聚合酶，得到扩增产物；
所述的RT-LAMP扩增反应体系为25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制剂，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, 0. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜碱，I. O μ I的反转录酶，I. O μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物组成；
步骤(4).扩增产物电泳检测
反应结束后，在扩增产物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混匀后置于桌面上拍照并肉眼观察结果；颜色呈橙色则为阴性，说明无弓形虫感染；或取扩增产物2 yL，于2. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察结果，无梯形条带则为阴性，说明无弓形虫感染。
上述所述的卩3、83、卩1卩、81卩、1^、1^引物如表I所示。表I
权利要求
1.猪肉及其制品中弓形虫RT-LAMP快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤 步骤(I).样品前处理 猪肉及其制品取样25g，加入10倍猪肉及其制品体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质I min,制成组织勻楽；样品； 步骤(2).弓形虫RNA提取 取组织匀浆样品转移到离心管后，加入Trizol试剂，其中组织匀浆样品与Trizol试剂的体积含量比为1:10，常温静置511^11;在转速12000印111，温度为4 °C条件下离心5 min，取上清液至新的离心管中，加入200 μ 氯仿，盖上离心管盖，充分混合至溶液呈乳白状后，常温静置5min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入与该上清液等体积的异丙醇，充分混合后，常温静置10 min ;在转速12000rpm，温度为4 °C条件下离心10 min，弃掉上清液，加入I ml体积含量为75%的乙醇洗涤离心管壁，在转速12000 rpm，温度为4 °C条件下离心10 min后，取沉淀物；常温下干燥沉淀物5min，力口入20 μ RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物； 将RNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度； 步骤(3). RT-LAMP扩增 将RT-LAMP扩增反应体系振荡混匀后，置于65°C水浴锅中反应I h后，置于80°C水浴锅中2 min灭活Bst DNA聚合酶，得到扩增产物； 所述的RT-LAMP扩增反应体系为25 μ I由2 μ I的25 mmol/L MgCl2,6. O μ I的2. 5mmol/L dNTPs,0. 5μ I 的 RNA 酶抑制剂，2· 5 μ I 的 IOXBst DNA Buffer, O. 5 μ I 的 10mmol/L F3 引物，0· 5 μ I 的 10 mmol/L Β3 引物，2· 5μ I 的 10 mmol/L FIP 引物，2· 5μ I 的10 mmol/L BIP 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LF 引物，L O μ I 的 10 mmol/L LB 引物，2. O μ I的5 mol/L甜菜碱，I. O μ I的反转录酶，I. O μ I的Bst DNA聚合酶，2. O μ I的RNA提取物组成； 步骤(4).扩增产物电泳检测 反应结束后，在扩增产物中直接加入I μ L的SYBR Green I染料，混匀后置于桌面上拍照并肉眼观察结果；颜色变为绿色为阳性，说明有弓形虫感染，橙色则为阴性，说明无弓形虫感染；或取扩增产物2 3 yL，于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，通过凝胶成像系统观察结果，有梯形条带为阳性，说明有弓形虫感染，无条带则为阴性，说明无弓形虫感染。
全文摘要
本发明公布了一种猪肉及其制品中弓形虫RT-LAMP快速检测方法。现有技术中检测时间长且繁琐，工作量大，很难适应现代化食品安全快速检测的需要。本发明取样加入Trizol试剂，离心取上清液加入200μl氯仿，充分混合离心后取上清液，加入与该上清液等体积的异丙醇，离心后加入1ml体积含量为75%的乙醇，离心后干燥沉淀物，加入20μlRNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；将RT-LAMP扩增反应体灭活BstDNA聚合酶，得到扩增产物；加入1μL的SYBRGreenⅠ染料，或于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果。本发明具有较高的特异性和灵敏度，且避免假阳性的出现。
文档编号C12Q1/68GK102899410SQ20121035740
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者曲道峰, 韩剑众, 陶斯悦, 郑柏玲, 苏春雷, 杜爱芳, 池娜 申请人:浙江工商大学