一种prrsv逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒（PRRSV)的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS)是20世纪80年代末出现的一种新病，是由猪繁殖与 呼吸综合征病毒（PRRSV)引起的一种猪的高度接触性传染病，不同年龄、品种和性别的猪均 能感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪更易感染。该病以母猪流产，产死胎、弱胎、木乃 伊胎以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率为主要特征。PRRS于1987年在美国的北卡罗来 纳州首先发现，后迅速向世界各地蔓延，我国在1995年不慎引入。1996年中国学者在国内 分离到PRRSV，从而证实了本病在我国的存在。2006年以前，PRRS在我国一些地方散发， 有的地方呈现蔓延和流行的态势，主要表现为妊娠母猪繁殖障碍及仔猪呼吸困难。自2006 年夏季以来，在我国江西、安徽、浙江、湖南、湖北、江苏等省发生了以体温高热不退、皮肤发 红、呼吸困难为主要临床症状的疫病。剖检变化以弥散性、出血性间质淋巴结和各内脏器 官不同程度出血为突出特征，经流行病学调查、病毒分离、基因分析、动物试验等，最终确定 为，高热病是由猪蓝耳病病毒变异株所引起，鉴于其临床特征不同于经典猪蓝耳病病毒，将 其命名为高致病性猪蓝耳病。
[0003] PRRS发病急、传播快、发病率高、病程长、病死率高等，夏秋季多发，患病猪和带毒 猪是该病的重要传染源。猪繁殖与呼吸综合征病毒只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的 猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感，肥育猪也会发病。40日龄以内的仔 猪病死率高达100%，育肥猪病死率约为50% ;在一些地区的猪场，发病率接近100%，病死率 在30%~50%，甚至部分猪场的病死率可达80%以上。
[0004] 猪繁殖与呼吸综合征病毒主要经呼吸道或通过公猪的精液经生殖道在同猪群间 进行水平传播，也可以通过母子进行垂直传播，短期内便可波及全群或邻近群。易感猪也可 与带毒猪直接接触或与污染有猪繁殖与呼吸综合征病毒的运输工具、器械接触均可受到感 染。
[0005] 蓝耳病是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。猪感染病毒后2~14周均可通 过接触将病毒传播给其他易感猪，从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。仔猪感染猪 繁殖与呼吸综合征病毒后，通常1~2周内在血液中可检测到病毒，甚至到23d还能检测到 该病毒。这表明对个体而言，猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的活动期一般是比较短的，但 是，用感染后23d的猪扁桃体进行涂抹培养，检测到了猪繁殖与呼吸综合征病毒，这个重要 的发现表明，猪繁殖与呼吸综合征病毒可存在或"躲藏"在感染猪的某些部位。
[0006] 猪繁殖与呼吸综合征是危害我国猪生产的重要疫病，对该疾病密切监测和快速诊 断，有利于该病的防治。目前，猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测技术主要有常规方法和分子 生物学方法。常规方法是病毒的分离鉴定，其结果准确可靠，但常规鉴定方法存在操作复 杂，需要复杂的仪器设备，所需时间长，以及受影响的因素多等缺点，不利于猪繁殖与呼吸 综合征的快速诊断。分子生物学的方法主要是通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR)方法 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性基因，虽然RT-PCR方法较常规方法快速准确，但需 要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污 染导致出现假阳性结果，这些问题给基层和现场检测提出了一大难题。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了解决基层快速、准确并且实时检测猪繁殖障碍与呼吸综合征 病毒（PRRSV)，提供一种方便基层简便、快捷准确地检测PRRSV的试剂盒。为实现本发明目 的所使用的技术方案为： 一种PRRSV逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2X反应缓冲 液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和PRRSVRNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3 (SEQIDNO:l)与B3(SEQIDNO:2)、内引物FIP(SEQIDNO:3)与BIP(SEQIDN0:4) 和环引物LF(SEQIDNO:5)与LB(SEQIDNO:6); 其中引物的序列分别为： F3TGCTTAGGCTGGAGGGTG B3ATGGCACTGCTAGGCAAAT FIPGCCCTGAACACATTCAAGGGGGAGCATTGGACCGTCTCTGT BIPAGCATAAGGGCGGTCTTGGTTTCAAGGCAGGCAGGATCA LFTTATGCTCACAACAGCCCTGAAC LBACTGGCTGAGGTAATGCATTTG； 以上所述的 2X反应缓冲液包括Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0008] 以上所述的PRRSVRNA模板是病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取PRRSV的RNA。
[0009] 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0010] 以上所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL40-50mM、KCL20-30mM、MgS04 16-20mM、（NH4)2S04 20-25mM、Tween20 0? 2-0. 5%、Betaine1. 6-3. 2M和dNTPs2. 8-4mM， 其配制方法在pH为8. 8条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0011] 一种PRRSV逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测PRRSV，或者用于检测 兽医临床上疑似PRRSV感染的病变组织是否存在PRRSV，具体检测步骤包括： (1) RT-LAMP引物的设计与合成 (2) PRRSVRNA模板的提取 (3) RT-LAMP反应体系建立 (4) RT-LAMP检测方法。
[0012] 以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25yL计， 2X反应缓冲液 12. 5yL EM 1yL FIP 40pmol BIP 40pmol LF 25pmol LB 25 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol PRRSV RNA 5 uL 超纯水 补足25 uL。
[0013] 以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测 的方法。
[0014] 以上所述的RT-LAMP检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监 控，反应温度为63 °C、反应在20-30分钟间出现扩增。
[0015] 本发明的实质性特点和显著的进步是： 1)特异性强 本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测出猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒（PRRSV)， 所检测的阴性对照病毒、阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来，与RT-PCR检测结果一 致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器，普通RT-PCR法需先进行反转录 (RT)，然后再以RT产物为模板进行PCR反应，使用了两个反应程序，而RT-LAMP方法可在一 个反应管内同时完成两个反应程序，一个小时即可完成扩增。
[0016] 2)灵敏度高 普通的RT-PCR检测方法的灵敏度为1. 736X1(T4ng/yL，而使用本发明检测方法，检测 限约为 1.736X10_6ng/yL，是普通RT-PCR的 100 倍。
[0017] 3)迅速得出结果 普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应 方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒RNA提取 到获取试验结果，需要5-6小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在20-30分钟 间出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行 比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应 管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性 反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外 线分析显像或者开盖加入荧光染料进行来判读结果，从病毒RNA提取到获得最终结果可在 2-3小时内完成。
[0018] 4)不造成污染 目前虽然已经建立有RT-LAMP显色法用于检测猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒，但显色 法只能是反应结束后开盖加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果， 或者通过跑电泳的方法进行结果判定，开盖检测容易造成气溶胶产物污染实验室。而本发 明的RT-LAMP荧光目视检测方法，荧光染料是在反应前加入，避免开盖造成污染。此外，本 发明的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结 果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效 避免污染。
[0019] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeter real-time LA-320池度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果， 不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可 求出各时间的猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明RT-LAMP检测方法特异性检测结果；其中：1:猪繁殖障碍与呼吸综 合征病毒北美型CH-1株；2 :猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒北美型TJM-F92株；3 :猪繁殖障 碍与呼吸综合征病毒北美型JXA1株；4 :猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒欧洲型；5 :猪瘟病 毒；6 : 口蹄疫病毒；7 :伪狂犬病毒；8 :传染性胃肠炎病毒；9 :流行性腹泻病毒；10 :细小病 毒；11 :圆环病毒2型；12 :大肠杆菌0157 :H7 ;13 :2型链球菌；14 :副猪嗜血杆菌；15 :沙门 氏菌；16 :隐秘杆菌；17 :水对照。4株猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(北美型和欧洲型）反 应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管、5株对照细菌反应管和水对照反应管均无 扩增。
[0021] 图2和图3是本发明RT-LAMP检测及传统RT-PCR检测的敏感性检测结果；其中1: 1. 736X102ng/yL；2 ： 1. 736X101ng/yL；3 ： 1. 736X10°ng/yL；4 ： 1. 736X10_1ng/yL； 5 :1. 736Xl(T2ng/yL;6 :1. 736Xl(T3ng/yL;7 :1. 736Xl(T4ng/yL;8 :1. 736Xl(T5ng/ yL；9 ：1. 736X10_6ng/yL；10 ：1. 736X10_7ng/yL； 11 ： 1. 736X10-8ng/yL； 12 ： 1. 736X10-9ng/yL;13 :1. 736X10-1。ng/yL;14 :water。繁殖障碍与呼吸综合征病毒原 始RNA的起始浓度为1. 736X102ng/yL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和RT-PCR 扩增，其中RT-PCR检测为国标法，结果显示RT-LAMP法检测限约为1. 736X10_6ng/yL，而 RT-PCR法检测限为 1. 736X10_4ng/yL。
[0022] 图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管