一种检测核酸分子缺失突变的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测核酸分子缺失突变的方法，尤其涉及一种通过探针熔解曲线 检测核酸分子缺失突变的方法，以及用于检测核酸分子缺失突变的反应体系和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 缺失突变是指染色体或DNA或RNA序列发生部分丢失的一种突变，可以造成遗传 物质的丢失。缺失突变可以是不同数量的核苷酸的缺失，可以从只有单个碱基缺失到整个 染色体片段的缺失。狭义的缺失突变指核酸分子较长片段的缺失，不包括单个碱基及少数 几个碱基的缺失。缺失突变常造成遗传物质的丢失，往往直接导致所编码蛋白表达量及表 达水平的变化，从而导致一系列生物学效应。缺失突变所导致的生物学效应，涉及到疾病发 病机制分析、疾病诊断标志物、药物敏感性、药物治疗靶点等领域。
[0003] 检测核酸分子缺失突变的方法已有很多，传统的包括Southern杂交法、荧光原位 杂交（fluorescentinsituhybridization,FISH)，上述两种方法在早期对基因缺失的发 现、缺失类型的鉴定等起了重要的作用，但是由于其具有操作步骤繁琐、费时费力、成本较 高、对实验人员要求高等缺点，不适合用于临床上常规的缺失突变检测。目前用于检测缺 失突变的主要技术是跨越断裂点PCR(gap-PCR)技术，该技术采用跨越断裂点的引物，通过 PCR扩增之后琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的有无及片段长度的大小来判定是否含有缺失 及缺失的类型。该技术在临床上得到比较广泛的应用，但需要PCR之后的电泳分析，操作步 骤较多，且易造成PCR产物污染，造成假阳性的发生。近年来发展的MLPA(多重连接依赖的 探针扩增，Multiplexligation-dependentProbeamplification)技术，可在一个反应中 同时检测多个核酸片段的缺失和重复，在临床上也得到较大的认可，但其检测成本高、操作 繁琐、需要特殊的仪器设备等限制，不适合临床常规使用。因此，开发一种准确稳定、快速简 便、无需PCR后处理的缺失突变检测技术，成为当前的迫切需要。
【发明内容】
[0004] 本发明的发明人经过大量实验和反复摸索，开发出一种基于荧光探针熔解曲线分 析技术的核酸分子缺失突变的检测方法，并进一步提供了基于该检测方法的反应体系和试 剂盒，由此完成了本发明。
[0005] 本发明第一方面涉及一种检测核酸分子是否存在缺失突变的方法，其包括以下 1)~4)项：
[0006] 1)根据核酸分子缺失的断裂点位置，设计荧光探针，使荧光探针与野生型核酸分 子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间的匹配程度具有差异，从而具有 不同的熔点（Tm)值；
[0007] 2)设计扩增核酸的引物组，该引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在缺 失突变的核酸分子，且扩增的产物包括核酸分子与荧光探针的结合区域；
[0008] 3)以待检核酸样本为模板，利用步骤1)和2)设计的探针和引物组，进行PCR扩增 和熔解曲线分析；
[0009] 4)根据熔解曲线分析中是否有相应的熔解峰和/或熔点（Tm)值的高低来判定是 否存在核酸缺失突变，以及任选地判断缺失突变的类型。
[0010] 在本发明的实施方案中，其中所述核酸为核糖核酸（RNA)或脱氧核糖核酸（DNA)。
[0011] 在本发明的实施方案中，其中所述缺失突变是指15nt以上的寡核苷酸片段的缺 失，例如是指l〇〇nt以上的寡核苷酸片段的缺失。
[0012] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针选自自淬灭探针、相邻探针、容忍型分 子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针（如HyBeacon探针）、荧光标记探针结合荧光嵌入 染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。
[0013] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变 的核酸分子形成的双链杂交体之间的熔点（Tm)值相差2°C以上，例如为3°C以上，5°C以上， 10°C以上，15°C以上。
[0014] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变 的核酸分子形成的双链杂交体之间匹配程度具有差异，这种差异可以是在荧光探针5'末 端与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间匹配程度有差 异，或荧光探针3'末端与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交 体之间匹配程度有差异。
[0015] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针为一种或多种。
[0016] 在本发明的实施方案中，其中所述引物组的上、下游引物中有一种引物相对过量 (上游引物过量或下游引物过量）。
[0017] 在本发明的实施方案中，其中所述过量的引物与未过量的引物之间的数量比例为 (2~100) :1，例如为（4~50) :1，例如为（5~20) :1，例如为（5~10) :1。
[0018] 在本发明的实施方案中，其中所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核 酸分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为适合PCR扩增和/或检测的长度，例如 为 100-400bp。
[0019] 在本发明的实施方案中，其中所述的引物组包含一种上游引物和一种下游引物。 在本发明的实施方案中，当缺失突变的长度小于200bp~300bp时，可以采用这种引物设计 方式。
[0020] 在本发明的实施方案中，其中所述的引物组包含一种上游引物和两种下游引物， 其中的一种下游引物位于缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合；
[0021] 或者所述的引物组包含两种上游引物和一种下游引物，其中的一种上游引物位于 缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合；
[0022] 在本发明的实施方案中，当缺失突变的长度大于200bp~300bp时，可以采用这种 多引物设计方式。
[0023] 在本发明的实施方案中，所述方法还包含加入其它核酸扩增反应的必须组分的步 骤，例如包括加入耐高温核酸聚合酶，单核苷酸，缓冲溶液，金属离子，合适酸度的缓冲液等 的步骤。这些组分的选择、浓度的设定以及反应程序等均为本领域所公知。
[0024] 本发明第二方面涉及一种检测核酸分子是否存在缺失突变的反应体系，其含有至 少一种待测核酸分子、至少一种荧光探针、和至少一对引物组，其中：
[0025] 所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交 体之间具有不同的熔点（Tm)值，
[0026] 所述引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在缺失突变的核酸分子，且扩 增的产物包括核酸分子与荧光探针的结合区域。
[0027] 在本发明的实施方案中，其中所述核酸为核糖核酸（RNA)或脱氧核糖核酸（DNA)。
[0028] 在本发明的实施方案中，其中所述缺失突变是指15nt以上的寡核苷酸片段的缺 失，例如是指l〇〇nt以上的寡核苷酸片段的缺失。
[0029] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针选用自淬灭探针、相邻探针、容忍型分 子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针（如HyBeacon探针）、荧光标记探针结合荧光嵌入 染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。
[0030] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变 的核酸分子形成的双链杂交体之间的熔点（Tm)值相差2°C以上，例如为3°C以上，5°C以上， 10°C以上，15°C以上。
[0031] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变 的核酸分子形成的双链杂交体之间匹配程度具有差异，这种差异可以是在荧光探针5'末 端与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间匹配程度有差 异，或荧光探针3'末端与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交 体之间匹配程度有差异。
[0032] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针为一种或多种。
[0033] 在本发明的实施方案中，其中所述引物组的上、下游引物中有一种引物相对过量 (上游引物过量或下游引物过量）。
[0034] 在本发明的实施方案中，其中所述过量的引物与未过量的引物之间的数量比例为 (2~100) :1，例如为（4~50) :1，例如为（5~20) :1，例如为（5~10) :1。
[0035] 在本发明的实施方案中，所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸分 子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为适合PCR扩增和/或检测的长度，例如为 100-400bp〇
[0036] 在本发明的实施方案中，其中所述的一对引物组包含一种上游引物和一种下游引 物。
[0037] 在本发明的实施方案中，其中所述的一对引物组包含一种上游引物和两种下游引 物，其中的一种下游引物位于缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合；
[0038] 或者所述的引物组包含两种上游引物和一种下游引物，其中的一种上游引物位于 缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合。
[0039] 在本发明的实施方案中，所述反应体系还包含任选的其它核酸扩增反应的必须组 分，例如包括耐高温核酸聚合酶，单核苷酸，缓冲溶液，金属离子，合适酸度的缓冲液等。这 些组分的选择、浓度的设定以及反应程序等均为本领域所公知。
[0040] 本发明第三方面涉及一种检测核酸分子是否存在缺失突变的试剂盒，其含有至少 一种荧光探针、和至少一对引物组，其中：
[0041] 所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交 体之间具有不同的熔点（Tm)值，
[0042] 所述引物组既能扩增野生型核酸分子，又能扩增存在缺失突变的核酸分子，且扩 增的产物包括核酸分子与荧光探针的结合区域。
[0043] 在本发明的实施方案中，其中所述缺失突变是指15nt以上的寡核苷酸片段的缺 失，例如是指l〇〇nt以上的寡核苷酸片段的缺失。
[0044] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针选用自淬灭探针、相邻探针、容忍型分 子信标、只标记荧光基团的寡核苷酸探针（如HyBeacon探针）、荧光标记探针结合荧光嵌入 染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料。
[0045] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变 的核酸分子形成的双链杂交体之间的熔点（Tm)值相差2°C以上，例如为3°C以上，5°C以上， 10°C以上，15°C以上。
[0046] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针与野生型核酸分子和与存在缺失突变 的核酸分子形成的双链杂交体之间匹配程度具有差异，这种差异可以是在荧光探针5'末 端与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交体之间匹配程度有差 异，或荧光探针3'末端与野生型核酸分子和与存在缺失突变的核酸分子形成的双链杂交 体之间匹配程度有差异。
[0047] 在本发明的实施方案中，其中所述荧光探针为一种或多种。
[0048] 在本发明的实施方案中，其中所述引物组的