上、下游引物中有一种引物相对过量 (上游引物过量或下游引物过量）。
[0049] 在本发明的实施方案中，其中所述过量的引物与未过量的引物之间的数量比例为 (2~100) :1，例如为（4~50) :1，例如为（5~20) :1，例如为（5~10) :1。
[0050] 在本发明的实施方案中，中所述引物组对野生型核酸分子和存在缺失突变的核酸 分子扩增所得到的主要双链产物大小相近，例如为适合PCR扩增和/或检测的长度，例如为 100-400bp〇
[0051] 在本发明的实施方案中，其中所述的一对引物组包含一种上游引物和一种下游引 物。
[0052] 在本发明的实施方案中，其中所述的一对引物组包含一种上游引物和两种下游引 物，其中的一种下游引物位于缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合；
[0053] 或者所述的引物组包含两种上游引物和一种下游引物，其中的一种上游引物位于 缺失突变区域，即该引物可以和缺失突变区域结合。
[0054] 在本发明的实施方案中，所述试剂盒还包含任选的其它核酸扩增反应的必须组 分，例如包括耐高温核酸聚合酶，单核苷酸，缓冲溶液，金属离子，合适酸度的缓冲液等。这 些组分的选择、浓度的设定等均为本领域所公知。
[0055] 本发明还涉及本发明第二方面任一项的反应体系、或第三方面任一项的试剂盒用 于检测核酸分子是否存在缺失突变的用途。
[0056] 以下对本发明做进一步描述。
[0057] 在本发明中，所述缺失突变是指较长核酸片段的缺失，不包括单个核苷酸或几个 核苷酸的缺失，一般指15nt以上的寡核苷酸片段的缺失，尤其是100nt以上的寡核苷酸片 段的缺失。在本发明的实施方案中，所述缺失突变包含了从十几个（16个）碱基到几万个 (20. 5k个）碱基的缺失突变。
[0058]在本发明中，所述核酸分子的缺失突变是指断裂点位置已知且相对固定的缺失突 变；根据该已知缺失突变，设计相应的荧光探针和引物组。
[0059]在本发明中，所述断裂点位置是指缺失型核酸分子中所缺失序列的5'端第一个核 苷酸和/或3'端最后一个核苷酸的位置，或者野生型核酸分子中与之相对应的位置。
[0060]在本发明中，所述断裂点位置已知的缺失突变既包括已知该缺失突变的确切的断 裂点位置的情况，也包括已知该缺失突变的大概的断裂点位置的情况，可以围绕该大概的 断裂点位置设计引物，进行扩增，并且扩增产物之间具有可识别的熔解峰和/或Tm值。
[0061]本发明的方法既可以用于检测纯合型缺失突变，也可以用于检测杂合型缺失突 变，即可以用于基因分型。
[0062] 如果适当的话，本文所用"核苷酸"或"碱基"可互换使用，可经过修饰或未经修饰。
[0063]在本发明中，所述熔解曲线分析，就是在PCR扩增程序后增加一个升温步骤（有时 也可以是降温步骤），通过记录荧光随着温度的变化，检测扩增产物信息。目前的熔解曲线 分析包括了三种类型，分别是荧光染料法、荧光探针法和荧光染料联合荧光探针法。本发明 提供的方法适用于荧光探针法和荧光染料联合荧光探针法这两种类型。
[0064] 其中，荧光探针法就是使用荧光探针来检测特定位置的缺失突变，前提是荧光探 针与靶序列杂交后可以产生特异的荧光信号，这类探针在实时PCR中有很多种，其中用于 熔解曲线分析的探针包括自淬灭荧光探针（中国专利ZL201080023112. 9 ;美国专利，US 8, 691，504B2)，荧光能量共振转移探针（FRET探针，又称LightCycler?探针、相邻探针） (美国专利，US7,160,998B2;美国专利，US6,472,156B1;美国专利，US6,140,054)， 其它使用包括单标记的寡核苷酸探针（美国专利，US6, 635, 427B2)、HyBeac〇n(美国专 利，US2008/0311579A1)探针等。
[0065] 荧光染料联合荧光探针法就是同时加入荧光增敏或者荧光淬灭染料和荧光探针 的方法，利用其中的荧光探针来检测特定位置的缺失突变，比如所谓的诱导荧光能量共振 转移iFRET技术（美国专利，US7, 179, 589B2)，就是加入荧光嵌入染料的同时再加入单标 记的荧光探针，荧光嵌入染料结合双链DNA发出的荧光通过能量转移的方式可以增加荧光 标记探针的荧光，温度升高使得探针脱离靶序列，增敏荧光降低。Gupta等人（美国专利，US 2007/0020665A1)公布了一种丙型肝炎病毒分型的方式，则是在PCR反应中同时加入荧光 淬灭染料和荧光标记探针，杂交后发生荧光淬灭，温度升高使得探针脱离靶序列，淬灭的荧 光得以恢复而会使荧光增加。
[0066]所述的熔解曲线分析一般可以包括，在核酸扩增后，与靶序列结合的探针，在温度 升高过程中脱离靶序列并引起荧光强度变化，通过实时检测这一个过程中荧光强度随温度 的变化，获得荧光强度变化速率为纵坐标，温度为横坐标的熔解曲线，利用该熔解曲线可以 检测靶序列的缺失情况。上述熔解曲线分析也可以按另一种降温的方式获得，也就是从高 温到低温，检测荧光的变化。通过数据处理进行熔解曲线分析。
[0067]本发明的基本原理如下：
[0068]尽管下文描述了本发明假设的原理，但是，本发明的范围并不受到这些原理的限 制。
[0069] 在核酸分子（例如DNA)热变性过程中，有50 %核酸分子（例如DNA)变性解链时 的温度称为双链DNA的解链温度，又称熔解温度或熔点（Tm)。在溶剂固定的前提下，双链核 酸分子（例如DNA)的Tm值是固定不变的。当核酸分子（例如DNA)双链完全互补时，形成 的双链结构较为稳定，使核酸分子（例如DNA)双链解开所需温度较高，故Tm值也较高；核 酸分子（例如DNA)双链不完全互补时，形成的双链结构较不稳定，使双链解开所需温度较 低，故Tm值也较低，而且Tm值降低的程度也是依赖不完全互补的具体序列的。
[0070] 基于上述理论，探针与靶杂交形成双链结构，与完全匹配的靶杂交，则形成的双链 结构的Tm值较高，若与不完全匹配的靶杂交时，形成的双链结构Tm值较低。因此，若能检测 到探针Tm值的变化，就能判断靶核酸序列是否存在缺失突变，乃至缺失突变的具体类型。
[0071] 荧光标记的探针要用于核酸序列缺失突变检测优选需要满足以下三个条件：一是 探针与靶序列杂交前后必须有荧光强度的变化；二是探针在扩增过程中必须保持完整，以 用于扩增后的熔解曲线分析；三是探针不能有过强的特异性，否则含有不匹配序列的核酸 序列不易与探针杂交。
[0072] 对荧光探针在熔解曲线分析过程中进行荧光信号的检测，就能观察到探针与靶的 杂交和解离过程，形成荧光强度随着温度变化而变化的曲线，即探针的熔解曲线，对熔解曲 线求导分析，就可以找到荧光变化最强的点，对应的温度即是探针的Tm值。探针与完全匹 配的祀杂交时形成的双链结构Tm值最高，与具有不同缺失突变的祀杂交时形成的双链Tm 较低，不同的缺失突变类型则可以形成不同的Tm值。
[0073]因此，根据本发明，采用熔解曲线，可以获得探针与待测核酸之间杂交体的熔点， 根据该熔点，可以检测待测核酸的缺失突变。
[0074] 或者，优选地，根据本发明，采用熔解曲线，可以获得探针与待测核酸之间杂交体 以及探针与参照核酸之间杂交体的熔点，根据这两个熔点的差异，可以检测待测核酸的缺 失突变。参照核酸可以是例如野生型核酸。
[0075] 在本发明的实施方案中，可以在反应体系或试剂盒中加入野生型或缺失突变型核 酸分子的参照序列。当与野生型核酸分子具有相同的Tm值或熔解峰时，则认定其为野生型 序列；当与缺失突变型核酸分子具有相同的Tm值或熔解峰时，则认定其为纯合型缺失突变 型序列；当同时含有上述两种熔解峰和两个Tm值时，认定其为杂合型缺失突变。
[0076] 或者在不含有上述参照序列时，也可以根据实验前预测得到的Tm值和熔解峰的 位置对结果进行判定。
[0077] 所述的熔点（Tm值）或退火温度可以在实验前利用本领域公知的方法预测获得， 例如通过DNAMAN、TMUtility、Primer5.0等软件计算得到。
[0078] 在本发明中，所述荧光探针优选与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点 的荧光探针，其包括但不限于自淬灭探针（例如参见中国发明专利ZL201080023112. 9)、 相邻探针（例如参见BernardP.S.，etal,AmericanJournalofPathology, 1998 ; 153(4):1055-1061.)、容忍型分子信标（例如参见HiyamH.EI-Hajj，etal，Journalof ClinicalMicrobiology, 2009 ;47 (4) : 1190-1198.)、只标记荧光基团的寡核苷酸探针如 HyBeacon探针（例如参见FrenchD.J.，etal,MolecularandCellularProbes, 2〇01; 15(6) : 363-374.)、荧光标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料（例 如参见GuptaA.P.etal，USpatentapplication,US2007/0020664Al.)〇
[0079] 在本发明的实施方案中，所述荧光探针为自淬灭探针。
[0080] 所述的自淬灭探针一般指的是，探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团 的寡核苷酸探针。该探针和靶核酸序列杂交时荧光强度增加。可在所述探针的5'末端标 记荧光基团而在3'末端标记淬灭基团，或可在所述探针的3'末端标记荧光基团而在5'末 端标记淬灭基团。当所述探针单独存在时，所述荧光基团与所述淬灭基团彼此接近而相互 作用致所述荧光基团发出的荧光被所述淬灭基团吸收而使探针荧光减弱，而当所述探针与 其靶核酸序列杂交时，所述荧光基团与所述淬灭基团相互分离致所述荧光基团发出的荧光 不能被所述淬灭基团吸收而使探针荧光增强。
[0081] 本发明所用探针的序列包含如下序列：该序列既可以与野生型核酸分子杂交，也 可以与发生缺失突变的核酸分子杂交，但两者形成的双链杂交体之间具有可区分的熔点差 异（例如熔点差异在2°C以上，例如在3°C以上，例如在4°C以上，例如在5°C以上，例如在 l〇°C以上，例如在15°C以上）。
[0082] 所述探针的序列例如可以为野生型靶核酸序列的完全互补序列，或，与野生型靶 核酸序列的完全互补序列相比有若干（例如1 一 10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个 或2个）错配，例如具有一个或多个（例如1 一 10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个 或2个）单碱基的转换、颠换、插入和/或缺失的序列。在本发明的实施方案中，所述探针 的序列在其5'端或3'端有若干个（例如1 一 10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或 2个）碱基与具有缺失突变的核酸分子序列不互补，这种不互补可以导致熔点的差异。
[0083] 或者所述探针的序列也可以设计为与具有缺失突变的靶核酸序列完全互补的序 列，或与具有缺失突变的靶核酸序列的完全互补序列相比有若干（例如1 一 10个