一种非o157产志贺毒素大肠杆菌的高效检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种非0157产志贺毒素大肠杆菌的高效检测方法。
【背景技术】
[0002]产志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli，STEC)，又称产Vero细胞毒素大肠杆菌(Vero cytotoxin-producingE.coli，VTEC)，是一类能引起人类致命性疾病的食物源性的病原菌。患者可出现腹泻、出血性肠炎和溶血性尿毒症(Haemolyticuraemic syndrome，HUS)。尽管许多血清型的STEC与人类疾病有关，已报道的STEC感染中，大多数暴发流行和散发病例都涉及STEC的一种特殊类型一肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichiacoli，EHEC) 0157:H7，非 0157STEC感染的病例也在增加。
[0003]目前由非0157血清型大肠杆菌致病菌引起的食物中毒持续上升，比如澳大利亚目前主要的流行株就是0111，因此建立一种快速准确的非0157:H7STEC病原菌的检测方法非常重要。在英国、北美、日本，关于0157的报道有很多，而在其他的国家，非0157可能更受重视，世界卫生组织对026、055、0103、0111、0128、0145等血清型尤为关注。非0157的分离率越来越高，埃及的饲养场、牛粪、屠宰场的分离率分别从4.6%、0.4%、2.1%上升到55.9%,74%,70.
[0004]根据血清型的不同，可将STEC分为0157STEC和非0157STEC。国外有报道对0157STEC和非0157STEC的毒力因子、致病机制、流行病学进行相关研宄和比较，而我国目前在非0157STEC相关方面的研宄报道较少，而对非0157STEC的检测方法更是缺乏。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于建立一种可以高效检测非0157产志贺毒素大肠杆菌的方法。
[0006]本发明所述的非0157产志贺毒素大肠杆菌的检测方法，包括以下步骤:
[0007](I)样品的采集
[0008](2)样品的前增菌:将采集的样品进行前增培养；
[0009](3) 二重PCR的鉴定:取培养物以煮沸法制得的DNA为模板，进行毒力基因stxl和stx2的二重PCR检测，剩余的培养物放置4°C冰箱保存；
[0010](4)非0157STEC分离:将步骤3中stxl和/或stx2阳性的样品进行非0157STEC分离；
[0011](5)多重PCR鉴定:步骤⑷中PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，stxl和/或stx2阳性的样品再进行毒力基因stxl、stx2、eaeA、ehxA的四重PCR检测；
[0012](6)0抗原的测定:步骤(5)中四重PCR检测的阳性样品于121°C，a高压破坏荚膜，暴露O抗原；取11111菌液离心12000r/min，5min，弃上清，加5%石炭酸生理盐水重悬；利用玻板、试管凝集试验测定O抗原。
[0013]本发明步骤(2)是将采集的样品低速离心以去除杂质颗粒，吸取上清于不含抗生素的EC肉汤中，加完上清后经酒精灯灼烧封口，放入41°C水浴锅中静置培养18-24h。本发明在前增菌的EC肉汤中不添加抗生素，提高了初筛率。
[0014]本发明重点改进非0157STEC的挑斑方法，其操作方法是:
[0015]用无菌枪头挑取山梨醇麦康凯平板上的粉色菌落，点种于已做好标记的LB平板上，每块平板挑取10个菌落，点种完的枪头放置同一个试管中摇振培养细菌。
[0016]步骤⑷是:将步骤(3)中stxl和/或stx2阳性的样品涂布于山梨醇麦康凯培养基，37°C静止培养18-24h，平板上的菌落为粉红色；每块平板挑取十个菌落，在挑斑之前，先在无菌的固体LB平板底部用记号笔划线，并做好标记，十个菌落一组；挑取粉色的单菌落时，用已灼烧并冷却的眼科镊子夹取一小枪头沾取一粉色单菌落，接种到已标记好的LB平板上，并将一沾取单菌落的枪头放置于已加5ml液体LB的无菌离心管中，每管放置十个上述已沾取粉色单菌落的枪头，与上述LB平板上已做好的标记相对应；将离心管于37°C，220r/min摇振过夜，LB平板于37°C静置培养过夜；取Iml离心管中混合菌落的培养液以煮沸法制得的DNA为模板，进行毒力基因stxl和stx2的二重PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果显示阳性者，再用小枪头沾取上述已标记培养好的LB平板上相对应的菌落置于已加5ml液体LB的试管中，37°C，220r/min摇振过夜；取Iml培养物以煮沸法制得的DNA为模板，进行毒力基因stxl和stx2的二重PCR检测。
[0017]本发明的特点是大大提高了前增菌的初筛率，并且大大减少了检测时间，简化了繁琐的操作步骤，节省了大量的人力物力，同时减少了因繁琐操作带来的人为因素而造成的偏差。
【具体实施方式】
[0018]实施例一
[0019]1、样品的采集
[0020]采集屠宰场、牛场的饮水及污水，置于含有35-40%甘油PBS的指形管中，并在相应的样品管中标上每头牛的耳标号，放在盛有冰袋的保温盒中运回实验室，并且立即将上述盛有棉拭子的指形管涡旋，挤压棉拭子，将棉拭子弃去。
[0021]2、样品的前增菌
[0022]将上述盛有棉拭液的指形管震荡混匀后，低速离心以去除杂质颗粒，吸取上清500 μ L于不含抗生素的EC肉汤中，加完上清后经酒精灯灼烧封口，放入41 °C水浴锅中静置培养 18-24h。
[0023]3、二重PCR的初筛鉴定
[0024]吸取上述培养物Iml以煮沸法制得DNA模板，进行毒力基因stxl和stx2的二重PCR检测，剩余的培养物放置4°C冰箱保存。
[0025]4、0157STEC 的分离
[0026]将步骤3中stxl和/或stx2阳性的样品涂布于山梨醇麦康凯培养基，37°C静止培养18-24h，平板上的菌落为粉红色。因其无鉴别作用，仍需继续挑斑，每块平板挑取十个菌落。在挑斑之前，先在无菌的固体LB平板底部用记号笔划线，并做好标记，十个菌落一组。挑取粉色的单菌落时，用已灼烧并冷却的眼科镊子夹取一小枪头沾取一粉色单菌落，接种到已标记好的LB平板上，并将一沾取单菌落的枪头放置于已加5ml液体LB的无菌离心管中，每管放置十个上述已沾取粉色单菌落的枪头，与上述LB平板上已做好的标记相对应。将离心管于37°C，220r/min摇振过夜，LB平板于37°C静置培养过夜。取Iml离心管中混合菌落的培养液以煮沸法制得的DNA为模板，进行毒力基因stxl和stx2的二重PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示阳性者，再用小枪头沾取上述已标记培养好的LB平板上相对应的菌落置于已加5ml液体LB的试管中，37°C，220r/min摇振过夜。取Iml培养物以煮沸法制得的DNA为模板，进行毒力基因stxl和stx2的二重PCR检测。
[0027]据我们十余年的流行病学调查数据，健康牛体内STEC的阳性率约为16%，分离率为5%，因此，绝大多数样品均属阴性样品，每十个候选菌落为一组，stx 二重PCR检测方法的实施，一次性去除了大量的阴性样品，节省了大量的人力、物力，并为获得非0157STEC阳性菌株缩短了时间。
[0028]5、多重PCR的鉴定
[0029]步骤4中PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，stxl和/或stx2阳性的样品涂布于LB固体培养基上，370C，静置培养过夜，挑取单菌落接种于5ml液体LB的试管中，37°C，220r/min过夜。取Iml毫升上述培养物以煮沸法制得的菌落DNA为模板，进行毒力基因Stxl、Stx2、eaeA, ehxA的四重PCR检测。结果显示阳性的样品加终浓度为20%的甘油于_70°C保存。
[0030]6、血清型的鉴定
[0031]将步骤5中四重PCR检测的阳性样品于121°C，2h高压破坏荚膜，暴露O抗原。取Iml菌液离心12000r/min，5min，弃上清，加5%石炭酸生理盐水重悬。利用玻板、试管凝集试验测定O抗原。
【主权项】
1.一种非0157产志贺毒素大肠杆菌的高效检测方法，包括以下步骤: (1)样品的采集 (2)样品的前增菌:将采集的样品进行前增培养； (3)二重PCR的鉴定:取培养物以煮沸法制得的DNA为模板，进行毒力基因stxl和stx2的二重PCR检测，剩余的培养物放置4°C冰箱保存； (4)非0157STEC分离:将步骤3中stxl和/或stx2阳性的样品进行非0157STEC分离； (5)多重PCR鉴定:步骤(4)中PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，stxl和/或stx2阳性的样品再进行毒力基因stxl、stx2、eaeA、ehxA的四重PCR检测； (6)0抗原的测定:步骤(5)中四重PCR检测的阳性样品于121°C，2h高压破坏荚膜，暴露O抗原；取Iml菌液离心12000r/min，5min，弃上清，加5%石炭酸生理盐水重悬；利用玻板、试管凝集试验测定O抗原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)是将采集的样品低速离心以去除杂质颗粒，吸取上清于不含抗生素的EC肉汤中，加完上清后经酒精灯灼烧封口，放入41°C水浴锅中静置培养18_24h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤⑷是:将步骤(3)中stxl和/或stx2阳性的样品涂布于山梨醇麦康凯培养基，37°C静止培养18-24h，平板上的菌落为粉红色；每块平板挑取十个菌落，在挑斑之前，先在无菌的固体LB平板底部用记号笔划线，并做好标记，十个菌落一组；挑取粉色的单菌落时，用已灼烧并冷却的眼科镊子夹取一小枪头沾取一粉色单菌落，接种到已标记好的LB平板上，并将一沾取单菌落的枪头放置于已加5ml液体LB的无菌离心管中，每管放置十个上述已沾取粉色单菌落的枪头，与上述LB平板上已做好的标记相对应；将离心管于37°C，220r/min摇振过夜，LB平板于37°C静置培养过夜；取Iml离心管中混合菌落的培养液以煮沸法制得的DNA为模板，进行毒力基因stxl和stx2的二重PCR检测；琼脂糖凝胶电泳结果显示阳性者，再用小枪头沾取上述已标记培养好的LB平板上相对应的菌落置于已加5ml液体LB的试管中，37°C，220r/min摇振过夜；取Iml培养物以煮沸法制得的DNA为模板，进行毒力基因stxl和stx2的二重PCR检测。
【专利摘要】本发明涉及一种非O157产志贺毒素大肠杆菌的高效检测方法。该方法包括样品的采集、样品的前增菌、二重PCR的鉴定、非O157STEC分离、多重PCR鉴定以及O抗原、H抗原的测定步骤。本发明大大提高了前增菌的初筛率，并且大大减少了检测时间，简化了繁琐的操作步骤，节省了大量的人力物力，同时减少了因繁琐操作带来的人为因素而造成的偏差。
【IPC分类】C12R1-19, C12Q1-10, C12Q1-68
【公开号】CN104651528
【申请号】CN201510121567
【发明人】高崧, 陈先亮, 高清清, 吴瑶瑶, 李甜甜, 姜海清
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月19日