一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0002] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪瘟病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003]猪癌（Swinefever,Hogcholera)又名猪霍乱（HogCholera，HC)，我国俗称烂肠 癌。欧洲为了区别于非洲猪癌称其为古典猪癌（Classicalswinefever，CSF)。其病原是 猪癌病毒（Hogcholeravirus，HCV或Classicalswinefevervirus，CSFV)，该病是猪的 一种接触性烈性传染病，临床以稽留高烧，皮肤和粘膜出现大量出血点为特征。猪瘟被世界 动物卫生组织（0IE)列入A类疫病名录，为须申报的动物传染病，我国也将其列为一类动物 传染病。该病于1833年首先发现于美国的俄亥俄州，全世界大多数养猪国家都存在，给 养猪业带来了巨大的经济损失。尽管世界各养猪大国对猪瘟病毒给予了足够的重视，但是 由于参差不齐的疫苗质量，不合理的免疫程序以及野猪群中携带的猪瘟病毒等因素，致使 猪瘟目前仍是威胁各国养猪业的一个极重要的传染病，常常突然爆发，造成巨大的经济损 失。每年用于预防接种、治疗、扑杀的费用数以亿计，我国也是一个受猪瘟危害较为严重的 国家。据统计，近几年来，因各种疾病死亡的牲猪占饲养总数（1998年达8亿头）的8%~ 10%，其中约1/3由猪瘟致死，每年的经济损失在10亿元左右。因其影响畜产品的贸易所 造成的间接损失更是不可估量。因此长期以来，猪瘟一直是兽医疫病研究的重点和热点之 〇
[0004] 猪瘟是危害我国猪生产的重要疫病，对猪瘟密切监测和快速诊断，有利于该病的 防治。目前，猪瘟病毒的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是病毒的 分离鉴定，其结果准确可靠，但常规鉴定方法存在操作复杂，需要复杂的仪器设备，所需时 间长的缺点，不利于猪瘟的快速诊断。分子生物学的方法是通过逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)方法检测猪瘟病毒的特异性基因，虽然RT-PCR方法较常规方法快速准确，但需要 设计特异性强的引物和昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电 泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种为基层快速、准确并且实时检测猪瘟病毒的方法，提供 一种快速、可视化并且可实时定量检测猪瘟病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒。为实现 本发明目的所使用的技术方案为： 一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2X反应缓 冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪瘟病毒RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物 F3(SEQIDN0:1)与B3(SEQIDN0:2)、内引物FIP(SEQIDN0:3)与BIP(SEQIDN0: 4)和环引物LF(SEQIDNO:5); 其中引物的序列分别为： F3CATGCCCAAGACACACCTTA B3CGTGGCATCGTATACCGG FIPCCTCTGCAGCACCCTATCAGGGGTCGCTAGGGTGAAATCAC BIPTGCTGTACATGGCACATGGAGTTCCTCCACTCCCATTGGTT LFCGTACTCCCATCACGTGGT； 所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0006] 以上所述的猪瘟病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪瘟 病毒RNA。
[0007] 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0008]以上所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgS04 15-20mM、（NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0? 4-0. 8%、Betaine1. 5-3. 0M和dNTPs2. 5-4mM， 其配制方法在pH为8. 7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0009] -种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测猪瘟病毒以及疑似 猪瘟病变组织是否感染猪瘟病毒，具体检测步骤包括： (1) RT-LAMP引物的设计与合成 (2) 猪瘟病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反应体系建立 (4)RT-LAMP检测方法。
[0010] 以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25ill计， 2X反应缓冲液 12. 5yL EM 1uL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 25 pmol F3 5 pmol B3 5pmol 猪瘟病毒RNA 5uL 超纯水 补足25yL。
[0011] 以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测 的方法。
[0012] 以上所述的RT-LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监 控，反应温度为63°C、反应在15-25分钟间出现扩增。
[0013]本发明的实质性特点和显著的进步是： 1)特异性强 本发明的RT-LAMP检测方法特异性检测出猪瘟病毒，而所检测的阴性对照病毒、阴性 对照细菌和水对照均无阳性结果出来，与RT-PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检 测结果、无需昂贵复杂的仪器，普通RT-PCR法需先进行反转录（RT)，然后再以RT产物为模 板进行PCR反应,使用了两个反应程序，而RT-LAMP方法可在一个反应管内同时完成两个反 应程序，一个小时即可完成扩增。
[0014] 2)灵敏度高 提取的猪瘟病毒RNA原始浓度为0. 8ng/yL，北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生 产销售猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒的检测限约为0. 8X1(T2ng/yL，而使用本发明 检测方法，检测限约为〇. 8X1(T3ng/yL，敏感性是瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒提供的 RT-PCR方法的10倍。
[0015] 3)迅速获得结果 普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反 应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组 DNA/RNA提取到获取试验结果，需要5-6小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在 20分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便-依据反应管浊度值 的变化情况即可判读结果，扩增反应结束即可获得试验结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电 泳紫外线显像分析或者反应结束后加入荧光染料来判读结果，从病毒基因组DNA/RNA提取 到获得最终结果可在2-3小时内完成。
[0016] 4)不造成污染 目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在 反应前加入的钙黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖，能有效避免实验 环境的污染。此外，本发明的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管 的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果， 不需要开盖，能有效避免污染。
[0017] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320C池度仪来实时分析RT-LAMP反应的结 果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即 可求出各时间的猪瘟病毒（CSFV)拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明RT-LAMP方法特异性检测结果；其中1 :猪瘟病毒兔化弱毒株；2 :猪 瘟病毒石门株；3 :猪瘟病毒野毒梧州株；4 :猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒；5 : 口蹄疫病 毒；6 :伪狂犬病毒；7 :传染性胃肠炎病毒；8 :流行性腹泻病毒；9 :细小病毒；10 :圆环病毒 2型；11 :大肠杆菌0157:H7 ;12 :2型链球菌；13 :副猪嗜血杆菌；14 :沙门氏菌；15 :隐秘杆 菌；16:水对照。3株猪瘟病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管、5株对照 细菌反应管和水对照反应管均无扩增。
[0019] 图2是使用本发明RT-LAMP方法进行的猪瘟病毒敏感性检测结果，图3是使用北 京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产销售的猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒(货号： CSF20140814P)进行的猪瘟病毒敏感性检测结果，其中1 :0. 8ng/iiL; 2 :0. 8XKT1ng/ iiL;3 :0? 8X1(T2ng/iiL;4 :0? 8X1(T3ng/iiL;5 :0? 8X1(T4ng/iiL;6 :0? 8X1(T5ng/iiL; 7 :0? 8X10_6ng/iiL;8 :0? 8X10_7ng/iiL;猪瘟病毒原始RNA的起始浓度为 0? 8ng/iiL，经 10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和RT-PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限 约为0. 8X10_3ng/iiL，而猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒检测限约为0. 8X10_2ng/iiL。
[0020] 图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪瘟病毒基因组RNA为模板的反 应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
[0021] 图5是本发明定量检测猪瘟病毒的标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的 浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪瘟病毒拷贝数。
【具体实施方式】
[0022] 1、材料的准备 猪瘟病毒（CSFV)包括(猪瘟兔化弱毒株、猪瘟病毒野毒石门株、猪瘟病毒野毒梧州株)， 对照毒株包括猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、传染性胃肠炎病 毒、流行性腹泻病毒、细小病毒、猪圆环病毒2型，对照细菌包括大肠杆菌、2型链球菌、副 猪嗜血杆菌、沙门氏菌、隐秘杆菌，为市售疫苗毒株，或为广西兽医研究所分离鉴定和保存。 LAMP法RNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP246,病毒基因组DNA/RNA 提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。
[0023] 2、RT-LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的猪瘟病毒编码N蛋白的基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软 件PrimerExplorerV4软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B