一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0002] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪圆环病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003] 圆环病毒（PCV)属于圆环病毒科，是目前已知脊椎动物病毒中最小的一种。猪是圆 环病毒的主要宿主，各种年龄的猪对圆环病毒均有较强易感性。胚胎期或生后早期感染的 猪，往往在断奶后才发病，一般集中在5周龄~18周龄，尤其在6周龄~12周龄最多见。怀 孕母猪感染圆环病毒后，导致繁殖障碍，并可经胎盘垂直传染给仔猪。感染猪可自鼻液、粪 便等排泄物中排出病毒，经消化道、呼吸道引起感染。
[0004] 以圆环病毒II型（PCV-2)为主要病原，并与猪细小病毒（PPC)或与猪繁殖、呼吸 综合征病毒（PRRSV)等病原共同感染而引起的一种新的传染病一一断奶仔猪衰竭综合征， 近年来，已在世界各地发生；此外圆环病毒可引起猪皮炎与肾病综合征，该病发病率可达 14%，病死率可高达30% ;可引起增生性坏死性间质性肺炎，该病发病率为2% ~30%，病死 率为4% ~10% ;还可造成繁殖障碍，导致母猪发情率增加、产木乃伊胎、流产以及死产和产 弱仔等，给养猪业带来严重威胁和巨大的经济损失。
[0005] 对圆环病毒的快速准确诊断是临床上防治猪圆环病毒的关键。目前实验室诊断 PCV的方法大致可分为2类：①病毒的分离与鉴定；②分子生物学方法。病毒分离与鉴定具 有结果准确可靠的特点，多用于急性病例的确诊和新疫区的确定，但此方法需要多次操作 程序，影响因素较多，且费时费力，不适于此病的快速诊断。分子生物学方法包括PCR、定量 PCR、套式PCR，虽然PCR方法较病毒分离鉴定方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本 较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果， 也不适合基层和现场检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决基层检测猪圆环病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题， 提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪圆环病毒的试剂盒，为实现本发明目的所使用的 技术方案为：一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2X反应缓 冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪圆环病毒DNA模板；所述的LAMP引 物包括外引物F3(SEQIDNO:l)与B3(SEQIDNO:2)、内引物FIP(SEQIDNO:3)与BIP (SEQIDN0:4)和环引物LF(SEQIDNO:5)与LB(SEQIDNO:6); 其中： F3GGGAGTCTGGTGACCGTT B3CCATCCCACCACTTGTTTCT FIPACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCGAGCAGCACCCTGTAACG BIPCACGTCATTGTGGGGCCACCTTCCAGTATGTGGTTTCCGG LFTTCAAAAGTTCAGCCAGCCC LBTGTGGTAAAAGCAAATGGGCT； 所述的 2X反应缓冲液是Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0007] 以上所述的猪圆环病毒DNA模板提取自猪圆环病毒培养物，是使用病毒基因组 DNA/RNA提取试剂盒提取。
[0008] 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0009]以上所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL10-30mM、MgS04 15-28mM、（NH4)2S04 18-28mM、Tween20 0? 5-1. 5%、Betaine1. 3-3. 5M和dNTPs 2. 4-4. 8mM，其配制方法在pH为8. 6条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0010] 一种猪圆环病毒环介导等温扩增试剂盒的应用，于兽医临床上检测疑似猪圆环病 变组织是否含有猪圆环病毒，具体检测步骤包括： (1) LAMP引物的设计与合成 (2) 检测猪圆环病毒DNA模板的提取 (3) LAMP反应体系建立 (4) LAMP检测方法。
[0011] 以上所述的LAMP反应体系建立以25yl计， 2X反应缓冲液 12. 5yL BstDNA聚合酶 1 yL FIP 40pmol BIP 40pmol F3 5pmol B3 5pmol 猪圆环病毒DNA 2yL 超纯水 补足25yL。
[0012] 以上所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的 方法。
[0013] 以上所述的LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控， 反应温度为63 °C、反应在20-30分钟间出现扩增。
[0014] 本发明的实质性特点和进步是： 1)特异性强 所检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简 便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。
[0015] 2)灵敏度高 普通PCR检测方法的灵敏度为1. 274X1CT2ng/yL，而使用本发明的LAMP检测方法，检 测限约为1.274父10_31^/1^，是普通？0?的10倍。
[0016] 3)迅速获得结果 普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在 反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组DNA提取 到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在25分钟左右出 现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，依据反应管浊度值的变化情况即可 判断结果，扩增反应结束即可获得试验结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显 像来判定结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
[0017] 4)不造成污染 目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反 应前加入的钙黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖。此外，本发明的 LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行 荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
[0018] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320池度仪来实时分析LAMP反应的结果，不 同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求 出各时间的猪圆环病毒2型拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明的LAMP方法特异性检测结果，其中1 :猪圆环病毒2型；2:细小病 毒；3 :伪狂犬病毒；4 :猪瘟病毒；5 :蓝耳病病毒；6 : 口蹄疫病毒；7 :传染性胃肠炎病毒；8 : 流行性腹泻病毒；9 :空白对照(水)。猪圆环病毒2型反应管出现浊度的上升曲线，7株对照 病毒反应管和水对照反应管均无扩增。
[0020] 图2和图3是分别使用本发明LAMP方法和普通PCR方法进行的猪圆环病毒2型敏 感性检测的结果。其中 1 :1. 27X102ng/yL;2 :1. 27X101ng/yL;3 :1. 27X10°ng/yL;4 : 1. 27X10_1ng/yL； 5 :1. 27Xl(T2ng/yL;6 :1. 27Xl(T3ng/yL;7 :1. 27Xl(T4ng/yL;8 : 1. 27Xl(T5ng/yL;9 :1. 27X1(T6ng/yL;10 :1. 27X1(T7ng/yL;11 :1. 27X1(T8ng/yL; 12 :水。猪圆环病毒2型基因组DNA的起始浓度为1. 27X102ng/yL，经10倍倍比连续稀 释后，进行LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的LAMP法检测限约为1. 27X1(T3ng/yL，而 普通PCR方法检测限约为1. 27Xl(T2ng/yL。
[0021] 图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪圆环病毒2型基因组DNA为模 板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
[0022] 图5是本发明猪圆环病毒2型定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的 浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪圆环病毒2型 拷贝数。
【具体实施方式】
[0023] 1、材料的准备 猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、传染性胃肠炎病 毒、流行性腹泻病毒、细小病毒，均为市售疫苗。LAMPDNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科 技有限公司，货号LMP204 ;病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公 司，货号CW0548。
[0024] 2、LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的圆环病毒2型Rep基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物， LF和LB为环引物，其中 F3GGGAGTCTGGTGACCGTT B3CCATCCCACCACTTGTTTCT FIPACGCTTCTGCATTTTCCCGCTCGAGCAGCACCCTGTAACG BIPCACGTCATTGTGGGGCCACCTTCCAGTATGTGGTTTCCGG LFTTCAAAAGTTCAGCCAGCCC LBTGTGGTAAAAGCAAATGGGCT 3、病毒基因组DNA提取 使用病毒基因组DNA