3为外引物，FIP、BIP为内 引物，LF为环引物，其中F3、B3为猪瘟病毒RT-PCR检测引物，其中 F3CATGCCCAAGACACACCTTA B3CGTGGCATCGTATACCGG FIPCCTCTGCAGCACCCTATCAGGGGTCGCTAGGGTGAAATCAC BIPTGCTGTACATGGCACATGGAGTTCCTCCACTCCCATTGGTT LFCGTACTCCCATCACGTGGT 3、病毒DNA/RNA提取或细菌基因组DNA提取 使用康为世纪生物科技有限公司生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，提取猪瘟病 毒RNA以及对照病毒毒株的病毒基因组DNA/RNA，或者疑似猪瘟病变组织的RNA，使用细菌 基因组提取试剂盒(北京康为试剂，货号CW0552)提取对照菌株的基因组DNA。
[0024] 4、RT-LAMP反应体系建立 按照试剂盒说明书，按25yl体系配置： 2 X反应缓冲液 12. 5yL EM 1uL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 25 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 猪瘟病毒RNA 5 uL 超纯水 补足25uL。
[0025]RT-LAMP反应在以实时浊度仪（LA-320C，日本荣研公司）进行密闭全程监控的形 式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品 达到0. 1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度 以63 °C做为反应温度。
[0026] 5、RT-LAMP检测方法 1)特异性检测 使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒分别提取猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病 毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、细小病毒、圆环病毒2 型的基因组DNA/RNA。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取大肠杆菌、链球菌2型、副猪嗜 血杆菌、沙门氏菌和隐秘杆菌的基因组DNA，作为RT-LAMP反应的模板，同时进行各毒株和 菌株的RT-LAMP扩增，同时以水作为空白对照，检验RT-LAMP方法的特异性。
[0027] 2)敏感性检测 用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产销售的猪瘟诊断试剂盒提取猪瘟病毒的RNA，测定其浓度，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释成8个稀释度，以各RNA稀释度作 为模板，同时进行RT-LAMP扩增和RT-PCR扩增，其中检测RT-PCR扩增所需的试剂及运行条 件由该检测试剂盒提供，对比本发明的RT-LAMP方法和该检测试剂盒提供的RT-PCR方法对 检测猪瘟病毒的敏感性。
[0028] 3)荧光可视化检测 根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙 黄绿素商用染料，63°C下反应60分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线 分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
[0029] 实施例1RT-LAMP检测方法的特异性结果 对3株猪瘟病毒、7株对照病毒毒株、5株对照细菌和水对照进行RT-LAMP扩增，结果如 图1所示，猪瘟病毒反应管在20分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照毒株 反应管、5株对照细菌反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。
[0030] 实施例2RT-LAMP检测方法的敏感性结果 猪瘟病毒原始RNA的起始浓度为0. 8ng/yL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和RT-PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为0. 8X10_3ng/iiL，而RT-PCR法(北 京世纪元亨动物防疫技术有限公司）检测限为0.SXK^ng/yL。
[0031] 实施例3RT-LAMP检测方法的荧光可视化检测结果 根据浊度仪监控优化的条件，反应前加入荧光染料，63°C反应60分钟后，在紫外灯下 观察，图4为观察结果，左管为以猪瘟病毒为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对 照，为阴性结果。试验结果表明，本发明建立的RT-LAMP方法可以方便基层使用，只需使用 试剂盒配合本方法设计的RT-LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63°C60分 钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
[0032] 实施例4RT-LAMP检测猪瘟病毒定量标准曲线的绘制 以猪瘟病毒RNA为模板，以本RT-LAMP方法设计的外引物F3和B3为RT-PCR扩增引 物，将RT-PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a， 氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，测定重组质粒的起 始浓度，用RNA-FreeWater进行连续10倍倍比稀释，各稀释度溶液作为标准样品，进行RT-LAMP扩增。
[0033]设置对照：浓度为 2. 05X101ng/iiL、2. 05X10°ng/iiL、2. 05XKT1ng/iiL、 2.05XKT2ng/iiL、2.05XKT3ng/iiL、2.05Xl(T4ng/iiL和 2.05XKT5ng/iiL的重组质 粒标准样品各一个，因为标准样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为〇. 1的时间值成线性 关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1)做成标准曲线，获得标准曲线方程， y=0. 4391X-8. 2696,如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0. 9975,呈良好的线 性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数2. 05， 即为 2.05xl(Tyng/yL。依据拷贝数换算公式copies/iiL= (6.02x1023x(ng/ulx 10_9)) /(DNAlengthx660)，DNAlength为载体序列大小加上目的基因序列大小，为 2693+220=2913bp，将其换算成拷贝数（copies/iiL):6. 02x1023x(2.05xl(Tyx1(T9)/ (2913x660)，简化为：6. 41x108xl0_y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分 钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于4. 9,则浓度为1(T4 9,再乘以基数2. 05,即为 该样品的浓度2.05\1〇-4_9叩/1^，拷贝数为6.41叉10 8叉1〇-4_9，即为6.41叉1031(：(^68/ UL，从而达到定量的效果。
[0034]表1
【主权项】
1. 一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RT-LAMP 引物、2 X反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪瘟病毒RNA模板，所述的RT-LAMP 引物包括外引物 F3 (SEQ ID N0:1)与 B3 (SEQ ID N0:2)、内引物 FIP (SEQ ID N0:3)与 BIP (SEQ ID N0:4)和环引物 LF (SEQ ID N0:5); 其中引物的序列分别为： F3 CATGCCCAAGACACACCTTA B3 CGTGGCATCGTATACCGG FIP CCTCTGCAGCACCCTATCAGGGGTCGCTAGGGTGAAATCAC BIP TGCTGTACATGGCACATGGAGTTCCTCCACTCCCATTGGTT LF CGTACTCCCATCACGTGGT ； 所述的 2X 反应缓冲液包括 Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2SCV Tween20、Betaine 和 dNTPs〇
2. 根据权利要求1所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述 的猪瘟病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪瘟病毒RNA。
3. 根据权利要求1所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述 的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4. 根据权利要求1所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所 述的 2X 反应缓冲液包括 Tris-HCL 35-50mM、KCL 15-35mM、MgSO4 15-20mM、（NH4)2SO4 15-25mM、Tween20 0·4-0. 8 %、Betaine I.5-3. OM 和 dNTPs 2·5-4 mM。
5. -种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于检测猪瘟病 毒以及疑似猪瘟病变组织是否感染猪瘟病毒，具体检测步骤包括： (1) RT-LAMP引物的设计与合成 (2) 猪瘟病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反应体系建立 (4) RT-LAMP检测方法。
6. 根据权利要求5所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在 于，所述的RT-LAMP反应体系建立以25 μ 1计， 2 X反应缓冲液 12. 5 yL EM I yL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 25 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 猪瘟病毒RNA 5 μ L 超纯水 补足25 μ L。
7. 根据权利要求5所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在 于，所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
8. 根据权利要求5所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在 于，所述的RT-LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
【专利摘要】本发明公开了一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪瘟病毒RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF。特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测证实，本发明提供的RT-LAMP检测方法特异性检测出猪瘟病毒，可实时监测反应并且定量检测出猪瘟病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪瘟病毒带来便利。
【IPC分类】C12Q1-70, C12R1-93, C12Q1-68
【公开号】CN104651535
【申请号】CN201510095337
【发明人】冯世文, 李军, 潘艳, 彭昊, 杨威, 胡帅, 陈泽祥, 钟舒红, 谢宇舟, 禤雄标, 马春霞, 柳锋, 陶立, 许力干, 谢永平, 韦志锋, 秦若甫, 兰美益
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月4日