多重试管捕捉rt-pcr的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是一种多重试管捕捉RT-PCR的方法。
【背景技术】
[0002] 植物的病毒检测就是指对植物的种苗、种薯、块茎以及块根等繁殖材料以及花卉 盆景等各类植物进行病毒的检疫，植物病毒是一类极为重要的农业病害，几乎所有类别的 植物都会发生，而且一旦发生，对农业的作物产量与质量都会带来极大的损害。目前在对植 物病毒进行检测中，主要用到的方法有生物学测定法、血清学检测法、电子显微镜检测法、 分子生物学检测方法等。生物学植物病毒检测方法较慢，而且也受到季节和气候等因素的 限制，灵敏度不高，某些病毒却因为无法找到鉴别寄主而不能运用这种检测方法。血清学植 物病毒检测方法对操作环境和操作人员的要求都很高，且检测成本较高，目前常用的血清 学检测方法有酶联免疫的吸附法、快速免疫的滤纸法、免疫荧光技术、斑点免疫测定法以及 免疫胶体金的技术等。电子显微镜检测方法检测之前一定要先对不同的病毒组具备何种形 态以及典型的病毒特点都有所了解，而且检测的样品应该含有较高浓度的病毒。分子生物 学的检测法是病毒检测领域的一种全新方法，目前常用的检测方法有普通RT-PCR法、实时 荧光RT-PCR法、试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)，普通 RT-PCR法和实时荧光RT-PCR法都需提取病毒的DNA或RNA来检测，DNA和RNA的提取费时 费力，特别是RNA的提取对操作环境要求较高。IC-RT-PCR需要抗原抗体结合成本高且费 时。TC-RT-PCR是一种无需提取病毒RNA和DNA且无需抗原抗体结合的检测技术，省时方便， 且灵敏度高，目前该项技术一个反应仅能检测1种病毒，且在烟草病毒上没有应用。因此， 创建一套用TC-RT-PCR同时检测多种病毒病的方法应用于烟草病毒病的检测很有必要。 例如，现有技术的试管捕捉反转录聚合酶链式反应（TC-RT-PCR)检测技术，其方法步骤 如下： (1) 磨样 取0. 5 -lg病叶，加少许液氮研碎后加PBST(PH7. 4,含0. 05%TWeen-20, 2%PVP)，充分 研磨后，4°C10000r/min离心lOmin，获得病毒提取液。 (2) 包被 取病毒提取液100UL包被0. 2mLPCR管，37°C水浴3h;PBST洗管3次，DEPC水洗1次。 (3) 反转录 直接在PCR管中进行反转录，向已捕捉抗原的PCR管中同时加入病毒的反向引物（ 10iimol/L)liiL、适量的DEPC水 11.5iiL、5XM-MuLV反转录酶缓冲液 4iiL、dNTPs( 10mmol/L)liiL、01igo(dT18)(0.1mol/L)liiL，70°C水浴预变性从5min处理，然后立 即置于冰上冷却5min，再加入RNasin( 40U/iiL) 0.5iiL、M-MuLV反转录酶（200U/ UL)liiL;经 42°C1h，70°C10min合成cDNA，在-20°C下保存备用； (4) PCR扩增 加入正反向引物（10ymol/L)各 0.5iiL;再加入 10XPCRbuffer2.5iiL，dNTP(10mmol/L)0.L，5XTaqPCR(5U/iiL) 0? 125yL，cDNA5yL，用ddH2 0 补足 25yL， PCR反应程序：94°C4min; 94°C45s，55°C45s，72°C65s，共35个循环，最后一轮循环 后72°C延伸10min;PCR反应结束后，取10iiLPCR产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳， 经溴化乙锭染色后在凝胶成像仪上观察结果。 上述技术存在的问题是，仅应用一对引物，通过PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于 单一致病因子等的鉴定。即只能一次检测一种病毒样品，对于多种病毒同时侵染的样品不 能经过一次检测出来，且对于大批量的病毒样品检测速度较慢。 例如，多重RT-PCR检测技术 多重RT-PCR的主要用于多种病毒的同时检测或鉴定病毒，某些遗传病及癌基因的分 型鉴定。多种病原因子的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病毒的特 异性引物，进行PCR扩增，可用于同时检测多种病毒或鉴定出是那一型病毒感染； 多重RT-PCR的试验步骤，同一般的PCR操作相同，只是反应中所加入的是多对引物而 不是一对引物。 (1) 总RNA的提取； (2) 合成cDNA:取200uLPCR反应管，反应总体积为20uL，加入9.OuLDEPC水、同时加 入1.0uL多种病毒的随机引物、适量的总RNA，离心混匀，95°C水浴5min，冰上放置2min; 再依次加入 5xM-MLVbuffer、10mmol/LdNTPs、200U/mLM-MLV、灭菌纯水，经 37°C10 min;42°C50min、70°C5min合成cDNA，在-20°C保存。 (3) PCR扩增 在0.2mLPCR管中依次加入lOxPCRbuffer、10umol/LdNTP、同时加入多种病原因子 的正反向引物（10umol/L)、1.0UTaqDNA聚合酶和cDNA，用DEPC水补至25uL;置PCR 仪中，94°C5min;94°C40S，54°C45s，72°C1min，循环 35 次；72°C7min;4°C保存 待用；PCR反应结束后，取10uLPCR产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，经溴化乙锭染色 后在凝胶成像仪上观察结果。 这种方法前期需要提取多种病毒的RNA耗时耗力且不易操作。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是：提供一种多重试管捕捉RT-PCR的方法，它不仅省去RNA提取这 个操作复杂，而且能在同一个反应中一次检测出多种病毒。 本发明是这样实现的：多重试管捕捉RT-PCR的方法，包括如下步骤： 1) 磨样：取TMV、CMV和PVY的病叶，向病叶中加入样品提取缓冲液充分研磨后，在温度 为4 °C、转速为10000r/min的条件下离心lOmin，获得病毒粗提取液； 2) 包被：取PCR管，用经步骤1)获得的TMV、CMV和PVY的病毒的粗提液同时包被，在 37°C的水浴中放置3h或在4°C下过夜；然后用洗涤缓冲液洗管3次，DEPC水洗1次； 3) 反转录：直接在PCR管中进行反转录；向已捕捉抗原的PCR管中同时加入TMV、 CMV和PVY三种病毒的反向引物、DEPC水、5XM-MuLV反转录酶缓冲液、dNTPs以及 Oligo(dT18)，然后在70°C的水浴中放置10min后，立即在冰浴下冷却5min，再加入RNasin 以及M-MuLV反转录酶；经42°C1h，70°C10min合成cDNA，在-20°C下保存备用； 4)PCR扩增：在同一个管中同时加入TMV、CMV和PVY三种病毒的正反向引物、lOXbuffer、dNTPmix、rTaq以及cDNA，用ddH20 定容；PCR反应程序是：94°C3min、94°C 30s、52°C45s、72°C1min，共30个循环，最后一轮循环后，72°C延伸10min;PCR反应 结束后，取PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像仪上观察结果。 所述的病叶质量与样品提取液的体积比为1 :1〇。 所述的样品提取缓冲液的PH值为7. 4最佳，其中，TWeen-20的体积百分比为0. 05%，PVP的质量与样品提取缓冲液的体积百分比为2%。 所述的步骤1)中病叶的取样量为〇. 5-lg;。 所述的步骤3)中，TMV、CMV和PVY三种病毒的反向引物各1iiL、其浓度均为10iimol/L各liiL;DEPC水为11.5iiL;5XM-MuLV反转录酶缓冲液为7iiL;dNTPs的浓度为10 mmol/L，体积为 3iiL，Oligo(或dT18)的浓度为 0.lmol/L，体积为 2iiL;RNasin的浓 度为40U/iiL，体积为1.5iiL;M-MuLV反转录酶的浓度为200U/iiL，体积为2iiL; TMV病毒的反向引物的序列为：5' -TCAGTTCGTGTTCTTGTCATCAGCG-3'，CMV病毒的反向 引物的序列为：5' -GTCGTCCAACCATTAACCACCCAAC-3'，PVY病毒的反向引物的序列为： 5, -AGATG