CCAACTGTGATGAA-3,。 所述的步骤4)中，正反向引物各liiL，浓度为10iimol/L;10Xbuffer为4iiL;dNTPmix为 3iiL;rTaq为 0? 75iiL;cDNA为 8iiL;用ddH20 定容至 30yL;TMV病毒的 正反向引物的序列为：5' -GCCACCGTTGCGTCGTCTACTCTAC-3'，CMV病毒的正反向引物 的序列为：5' -GCAGAGATGGCGGTAACGGATAAGT-3'，PVY病毒的正反向引物的序列为：5' -ATGTGTTCTCCTCTTGTGTC-3'。 本发明的原理是：病毒因其外壳蛋白基因序列较保守，所以可以设计特异性引物对其 扩增鉴定，用特殊的提取液研磨，病毒颗粒可稳定的分布于液相中，经温浴后，可吸附于PCR 管壁，加入反转录试剂后可反转录成cDNA，再经PCR扩增，可得到DNA。流程如图1所示。 由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明针对多种病毒病同时侵染的样品 可经一个反应一次就检测出来，对多种不同病毒病也可经一个反应依次检测出来，省时省 力。并且省去了RNA的提取步骤，进而省去了RNA提取时所需的试剂费，从而避免了RNA提 取时的复杂操作，尤其是多种病毒同时检测时，前期几种RNA的提取更是费时费力，此技术 只需要将几种病毒病的粗提液同时加入同一个管中，操作简单。 【附图说明】， 附图1为多重试管捕捉RT-PCR反应原理图， 附图2为TMV、CMV和PVY三种病毒病的多重试管捕捉RT-PCR检测凝胶电泳图， 注：图 2 中M为Makerl,条带大小依次为 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bpJ}c道1为TMV、CMV、和PVY分别侵染时用多重TC-RT-PCR同时检测的凝胶电泳检测图，泳道2 为TMV、CMV、和PVY复合侵染时用多重TC-RT-PCR同时检测的凝胶电泳检测图，目的条带大 小依次是CMV为 277bp,TMV为 336bp，PVY为 420bp。 本发明的实施例：多重试管捕捉RT-PCR的方法， 方法的建立， 1材料与方法， 1. 1病叶， 采自贵州主要的产烟区，经本实验室检测鉴定为阳性的TMV、CMV和PVY染病烟叶和TMV、CMV、PVY复合侵染的病叶。 1. 2主要试剂， rTaq酶、dNTP、M_MuLV反转录酶、Oligo(dT18)、RNasin购自Takara公司，MakerI购自Tiangen公司。洗涤缓冲液和样品提取缓冲液所需的药品均购自生工生物有限公司。 洗涤缓冲液:氯化钾（KC1) 0. 2g、氯化钠（NaCl) 8g、磷酸二氢钾（KH2P04) 0. 2g、磷酸氢 二钠（Na2HP04. 12H20) 2. 9g、土温20 (Tween-20) 500iiL，调节PH至7. 4,加蒸馏水定容至 1000mL，4°C条件下贮存备用。 样品提取缓冲液:亚硫酸钠（Na2S03)1. 3g、聚乙烯基吡咯烷酮（MV24000-4000,PVP) 20g、叠氮钠（NaN3)0.2g、土温20 (Tween-20)20ml，溶解于800ml洗涤缓冲液中，调节PH至 7. 4,加洗涤缓冲液定容至1000ml，4°C条件下贮存备用。 1%。DEPC水:将DEPC水用ddH20稀释1000倍，高压灭菌后备用。 1.3引物设计， 根据GenBank中的TMV、CMV、和PVY的外壳蛋白序列，根据引物设计的原则，用Primerf.O软件设计各自的特异性引物，引物由上海捷瑞有限公司合成。 引物序列如下表：
【主权项】
1. 一种多重试管捕捉RT-PCR的方法，其特征在于：包括如下步骤： 1) 磨样：取三种病毒病病叶，向病叶中加入样品提取缓冲液充分研磨后，在温度为4 °C、转速为10000r/min的条件下离心10min,获得病毒粗提取液； 2) 包被：取PCR管，用经步骤1)获得的TMV、CMV和PVY的病毒的粗提液同时包被，在 37°C的水浴中放置3h或在4°C下过夜；然后用洗涤缓冲液洗管3次，DEPC水洗1次； 3) 反转录：直接在PCR管中进行反转录；向已捕捉抗原的PCR管中同时加入TMVXMV 和PVY三种病毒的反向引物、DEPC水、5 XM-MuLV反转录酶缓冲液、dNTPs以及01 igo (dT18)， 然后在70°C的水浴中放置IOmin后，立即在冰浴下冷却5min，再加入RNasin以及M-MuLV 反转录酶；经42°C I h，70°C 10 min合成cDNA，在-20°C下保存备用； 4. PCR扩增：在同一个管中同时加入TMV、CMV和PVY三种病毒的正反向引物、 lOXbuffer、dNTP mix、rTaq 以及 cDNA，用 CldH2O 定容；PCR 反应程序是：94°C 3 min、94°C 30 s、52°C 45 s、72°C I min，共30个循环，最后一轮循环后，72°C延伸10 min;PCR反应 结束后，取PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳，经溴化乙锭染色后在凝胶成像仪上观察结果。
2. 根据权利要求1所述的多重试管捕捉RT-PCR的方法，其特征在于：所述的病叶质量 与样品提取液的体积比为1 :1〇。
3. 根据权利要求1所述的多重试管捕捉RT-PCR的方法，其特征在于：所述的样品提取 缓冲液的PH值为7. 4最佳，其中，TWeen-20的加入量为总体积的0. 05%，PVP的质量与样 品提取缓冲液的体积百分比为2%。
4. 根据权利要求1所述的多重试管捕捉RT-PCR的方法，其特征在于：所述的步骤1)中 病叶的取样量为〇. 5-lg ;。
5. 根据权利要求1所述的多重试管捕捉RT-PCR的方法，其特征在于：所述的步骤 3)中，TMV、CMV和PVY三种病毒的反向引物各lyL、其浓度均为lOymol/L各IyL; DEPC水为11. 5μ L ;5XM-MuLV反转录酶缓冲液为7μ L ;dNTPs的浓度为10 mmol/L，体 积为 3μ L，Oligo(ClT18)的浓度为 0· lmol/L，体积为 2μ L ;RNasin 的浓度为 40 U/μ L， 体积为I^yL5M-MuLV反转录酶的浓度为200 U/yL，体积为2μ L ;TMV病毒的反向 引物的序列为：5 '-TCAGTTCGTGTTCTTGTCATCAGCG-3 '，CMV病毒的反向引物的序列为：5 '-GTCGTCCAACCATTAACCACCCAAC -3'，PVY 病毒的反向引物的序列为：5'-AGATGCCAACTGTGATG AA_3'。
6. 根据权利要求1所述的多重试管捕捉RT-PCR的方法，其特征在于：所述的步 骤4)中，正反向引物各lyL，浓度为10 ymol/L;10Xbuffer为4yL;dNTPmix 为3 μ L ;rTaq为0· 75 μ L ;cDNA为8 μ L ;用CldH2O定容至30 μ L ;TMV病毒的正反向 引物的序列为：5' - GCCACCGTTGCGTCGTCTACTCTAC -3'，CMV病毒的正反向引物的序 列为：5' - GCAGAGATGGCGGTAACGGATAAGT -3'，PVY病毒的正反向引物的序列为：5' -ATGTGTTCTCCTCTTGTGTC -3'。
【专利摘要】本发明公开了一种多重试管捕捉RT-PCR的方法，本发明针对多种病毒病同时侵染的样品可经一个反应一次就检测出来，对多种不同病毒病也可经一个反应依次检测出来，省时省力。并且省去了RNA的提取步骤，进而省去了RNA提取时所需的试剂费，从而避免了RNA提取时的复杂操作，尤其是多种病毒同时检测时，前期几种RNA的提取更是费时费力，此技术只需要将几种病毒病的粗提液同时加入同一个管中，操作简单。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-70, C12R1-94
【公开号】CN104651530
【申请号】CN201410787492
【发明人】任锡毅, 刘作易, 黄永会, 刘永翔
【申请人】贵州省生物技术研究所
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年12月19日