本发明属于基因检测技术领域，具体地，涉及一种基于磁性颗粒提取纸片血rna、mrna的方法。
背景技术：
免疫是指免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，与机体其他系统相互协调，共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能。近几年，免疫组库测序分析已经成为免疫学的热门方法，促进了包括抗体发生、疫苗研发、肿瘤发生及自身免疫疾病等相关免疫学的研究并取得了众多创新性的成果。免疫组库测序技术(immunerepertoiresequencing,ir-seq)是目前最有效的免疫系统评估工具，以t/b淋巴细胞为研究目标，扩增决定b细胞受体或t细胞受体多样性的互补决定区(cdr区)，再结合高通量测序技术，实现实时、高敏感地监控对疾病发生或治疗产生应答的受体克隆扩增和细胞群体浓度，为临床更好地监测和分析生理及病理状态下机体的全面免疫状况及免疫细胞的发生和发展机制提供有效手段。
免疫组库测序技术因其对个体免疫系统实时和全面的分析，使其成为精准医疗的必要手段。免疫组测序技术可用于肿瘤免疫治疗、自身免疫疾病的诊断与治疗、移植与免疫重建、以及感染性疾病研究等方面，通过高通量测序技术监测患者免疫组库信息，对许多疾病的诊断以及预后的判断与治疗都具有重要意义。虽然，目前国内外已有多家生物技术公司能够提供免疫组库测序定制服务，但免疫组库测序在应用时，仍然存在一些难以解决的技术瓶颈。
首先是建库样本类型选择。免疫组库检测普遍以基因组dna(gdna)或者rna为模板，在细胞数相同的情况下，以gdna为模板时，基因在每个细胞中仅有一个拷贝，灵敏度低，非特异性产物比例高，测序结果质量低。以mrna为模板时，在细胞中的拷贝数高，具有更高的灵敏度，更接近真实的细胞受体蛋白表达。但rna样本容易降解，对提取、运输、保存都有较高要求，这些都增加了文库制备的成本和难度。
其次是rna的提取问题。在rna提取阶段，常用的提取方法有异硫氰酸胍法、苯酚法、离心柱试剂盒法。传统的异硫氰酸胍法、苯酚法在提取rna时，需要使用有毒的化学试剂并且提取纯化的核酸产量低。商用离心柱试剂盒虽然省时省力，但提取纯化过程依赖自旋柱和离心机，提取成本较高，多次离心步骤使得该方法不适用于自动化提取。
接着是文库构建时存在扩增偏差问题。无论是多重扩增方法或者5’-race方法，在解决扩增的偏差和重复性方面都存在着难以克服的问题，这使得免疫组库的检测结果与免疫系统的真实状态存在偏差，因此限制了免疫组库检测技术在精准医学领域中的应用。
最后是建库流程的可操作性问题。由于测序文库构建流程中需要对检测靶序列进行扩增，因此微量的核酸污染都会产生假阳性信号。现有的测序文库制备一般采用手动操作，这就需要操作人员具备相当的实验技巧和经验。同时测序文库构建普遍均存在着耗时、费力、操作复杂等问题。
综上所述，现有的免疫组库检测技术受到一些现实条件的约束，仍然存在一些难以解决的技术瓶颈，这使得免疫组库分析技术还未发挥出其巨大的应用潜力。
技术实现要素：
针对现有技术中rna样品容易降解，对提取、运输、保存要求较高，不易实现自动化提取等问题，本发明旨在提供一种基于磁性颗粒提取纸片血rna、mrna的方法，本发明的方法可实现在常温下保存和运输血液样品，利用磁性颗粒实现血液中rna的自动化提取。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明的磁性颗粒提取纸片血rna的方法，包括以下步骤：
一种基于磁性颗粒提取纸片血rna、mrna的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)利用指尖采血器自行采集指尖血存贮于whatman903滤纸片上，纸片血样本可以直接常温运送和保存；
2)纸片血样本破碎后浸没于溶液中，将rna从纸片上溶解下来；
3)磁性颗粒提取rna：向步骤2)得到的溶液中加入磁性颗粒，通过磁性颗粒捕获rna、mrna，加入洗脱液得到rna溶液,加入nuclease-freeh2o得到mrna连接在磁性颗粒上的溶液；
4)文库构建：向步骤3)获得的rna溶液中加入建库试剂进行文库构建，根据凝胶电泳观察建库结果；逆转录扩增：向步骤3)获得的mrna溶液中分别加入对应的引物和反应缓冲液，直接在磁性颗粒上进行逆转录扩增，得到扩增产物。
5)对建库结果进行高通量测序和数据分析；进行凝胶电泳分析检测结果。
优选的，所述目标核酸分子包括总rna分子或mrna分子。
优选的，所述步骤2)中的溶液将rna、mrna从纸片上的溶解下来。
优选的，所述磁性颗粒为oligodt磁性颗粒。
优选的，所述步骤2)中溶解rna步骤为：干燥后的纸片血碎屑浸没于溶解溶液中，置于恒温混匀仪上。
优选的，所述步骤2)中rna溶解条件为：1000rpm，37℃，反应1h。
优选的，所述步骤3)中磁性颗粒提取rna步骤为：向步骤2)获得的溶液中加入磁性颗粒捕获rna；洗涤、磁分离后去上清；加入洗脱液，将磁性颗粒与rna溶液分离，得到的含有rna的上清液。
优选的，所述步骤4)中rna建库步骤分为两步进行，反应体系分别为：第一步5×buffer5μl、dntpmix1μl、rnasin(40u/μl)0.25μl、enzymemix1μl、irepertoirehtbi-mprimers4μl、rna13.75μl、加nuclease-freeh2o至25μl；第二步nuclease-freeh2o20μl、promegag2hotstartcolorlessmm25μl、communalprimers5μl、反应总体积为50μl。。
优选的，所述步骤4)中建库步骤的两步反应条件分别为：第一步50℃60min，95℃15min，94℃30s、60℃5min、72℃45s，进行10个循环，94℃30s、72℃3min，进行10个循环，72℃15min，反应完成后，4℃孵育。第二步94℃3min，94℃30s、72℃90s，进行30个循环，72℃15min，反应完成后，4℃孵育。
优选的，文库构建完成后，测序直接在全封闭的卡盒中自动完成。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明提出一种静脉血检测的替代方法-干血点(drybloodspot，dbs)法，也称为纸片血法。干血点法是一种微创采血方法，只需采集少量毛细血管根部或手指血液，将其滴在特殊的纸片上，然后与干燥剂一起放入密封袋中储存，得到的干燥纸片血即为待检测样本。血液成分吸附在纸片上，可在常温下长期保存，核酸不会降解，稳定性好，同时降低了检测过程中血液感染的风险。该方法不需要被检测者到指定的医疗机构由专业的医护人员进行静脉血采集，可通过一个简易的指尖采血器，自行采集血液滴到滤纸片上，通过纸片、干燥剂和密封袋即可完成血液在常温下的储存和运输，不需要低温保存、冷链运输，大大降低样本处理成本，特别适用于医疗资源贫乏的地区。
(2)随着分子诊断技术的长足发展，核酸检测的需求已从大量样本转向对微量样本的检测，本发明提出一种自动化提取痕量mrna的方法。采集少量毛细血管根部或手指血液，将其滴在特殊的纸片上，然后与干燥剂一起放入密封袋中储存，得到的干燥纸片血作为痕量核酸样品，进行微量核酸的提取。利用该方法可以实现痕量核酸样品的检测，后续研究可应用于法医检测、转基因检测、游离核酸检测、病毒检测等领域。
(3)本发明在建库样本类型选择上，以mrna为模板，具有更高的灵敏度，更接近真实的细胞受体蛋白表达。在细胞数相同的情况下，以gdna为模板时，基因在每个细胞中仅有一个拷贝，灵敏度低，非特异性产物比例高，测序结果质量低。
(4)本发明的磁性颗粒提取核酸的方法，不仅可以提取总rna分子，还可以特异性提取mrna分子。采用oligodt磁性颗粒，通过提取实验获得mrna分子。
(5)本发明在rna提取和建库阶段，利用磁性颗粒，可实现rna自动化提取建库。磁性纳米颗粒由于其具有易被外部磁场引导的磁性而被广泛应用于分子诊断，待测样品中的核酸可以静电吸附或共价结合到功能化的磁性纳米颗粒上，在外部磁场存在的情况下，可以从样品中分离得到纯化的核酸。利用磁性颗粒提取核酸具有众多明显的优势，如不需要多次离心步骤，易于实现自动化，可同时高通量地提取和检测多个样本。利用磁性颗粒进行封闭、全自动文库构建时，检测人员或者自动工作站不会接触到反应体系，所有操作皆在封闭的体系内自动化完成，从根本上控制污染的发生，可以大大加快研究进程，减少人工操作造成的误差，提高文库制备效率。
附图说明
图1为磁性颗粒提取rna示意图；
图2为实施例1中rna建库结果；
图3为磁性颗粒提取痕量mrna技术流程图；
图4为磁性颗粒提取mrna示意图；
图5为实施例2中mrna逆转录扩增结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1：
本实施例的磁性颗粒提取纸片血rna的方法，具体步骤包括：
1)磁性颗粒提取纸片血：
(1)用移液器吸取50μl新鲜血液滴到whatman903号样品收集滤纸上的一个圆形区域内，样品纸片与干燥剂一同放入带有密封条的生物安全袋中，在室温下过夜干燥；
(2)实验时取两片直径为12mm的圆形纸片血，用打孔器破碎纸片后，将碎屑置于2ml试管中，加入溶解溶液，置于恒温混匀仪上1000rpm，37℃，反应1h。
(3)振荡完成后，取200μl反应上清液，转移到一个新的2ml试管中，加入10mg/ml磁性颗粒溶液250μl，使用移液器上下吹打溶液10次，使其充分混匀，然后置于试管架上静置5min。
(4)将试管转移至磁力架上磁分离10min，保证磁性颗粒紧贴试管壁，吸弃废液。
(5)加入750μl70％的乙醇溶液，用移液器轻轻上下吹打10次清洗磁性颗粒，吸弃废液。再重复一次该清洗步骤。
(6)将试管置于恒温混匀仪上50℃开盖干燥5min，保证磁性颗粒完全干燥，聚集颗粒团簇出现龟裂为干燥标准。如果磁性颗粒未完全干燥，会影响核酸的提取结果。
(7)向干燥后的磁性颗粒中加入80μl无核酸酶水，10μl10×dnaseibuffer，10μldnasei，使用移液器将磁性颗粒与溶液上下吹打5次使其充分混匀，37℃孵育20min，消化dna。
(8)加入150μlpbs溶液，移液器上下吹打10次充分混匀，置于试管架上静置5min后，将试管转移至磁力架上磁分离10min，吸弃废液。
(9)磁性颗粒紧贴试管壁，加入750μl70％的乙醇溶液，移液器轻轻吹打10次清洗磁性颗粒，吸弃废液。再重复一次该清洗步骤。
(10)将试管置于恒温混匀仪上50℃开盖干燥5min，保证磁性颗粒完全干燥。
(11)加入30μl无核酸酶水，移液器吹打混匀10次。
(12)试管置于恒温混匀仪上60℃孵育1min，然后置于磁力架上磁分离3min，上清液转移至新试管备用。
2)rna建库第一轮扩增：将引物、目标rna分子、酶和反应缓冲液等反应体系混合，进行逆转录扩增，第一轮扩增产物。
在该步骤中，反应体系配方如下：25μl逆转录扩增体系：5×buffer5μl、dntpmix1μl、rnasin(40u/μl)0.25μl、enzymemix1μl、irepertoirehtbi-mprimers4μl、rna13.75μl。
反应条件：50℃60min，95℃15min，94℃30s、60℃5min、72℃45s，进行10个循环，94℃30s、72℃3min，进行10个循环，72℃15min，反应完成后，4℃孵育。
扩增产物处理：第一轮扩增反应完成后，向扩增产物中加入25μl无核酸酶水的，将产物体积从25μl增加到50μl。取40μl反应产物至新的pcr管中，与36μl磁性颗粒混合均匀，盖上盖子，室温下将磁性颗粒与产物孵育3min。然后将pcr管放置于磁力架上磁分离3min，保持试管固定在磁力架上，吸弃废液。保证磁性颗粒紧贴试管壁，加入160μl85％的乙醇溶液，用移液器轻轻上下吹打12次清洗磁性颗粒。重复一次该清洗步骤(85％的乙醇溶液现配现用)。然后将pcr管置于恒温混匀仪上50℃开盖干燥5min，保证磁性颗粒完全干燥，聚集的磁性颗粒团出现龟裂为干燥标准，如果磁性颗粒未完全干燥，则会影响后续扩增实验。
3)rna建库第二轮扩增：以逆转录扩增产物为模板，加入第二轮扩增体系与磁性颗粒混合均匀进行扩增反应建库。扩增体系如下：nuclease-freeh2o20μl、promegag2hotstartcolorlessmm25μl、communalprimers5μl，反应总体积为50μl。
反应条件：94℃3min，94℃30s、72℃90s，进行30个循环，72℃15min，反应完成后，4℃孵育。
整体的反应过程如图1所示，如在步骤2)的连接反应体系中存在某种目标核酸分子则可以依次经过步骤2)的链接反应及步骤3)的扩增反应，形成超支化滚环扩增反应产物。若不存在目标核酸分子，则无法进行链接及扩增反应，最终无法形成的超支化滚环扩增反应产物。
4)测序前处理：第二轮pcr反应完成后，得到cdna文库，在送去测序之前，要先对文库进行一个测序前处理。将pcr2的产物置于磁力架上磁分离2-3min，上清液为cdna文库。用移液器吸取45μl上清液置于新的pcr管中，加入33μl磁性颗粒溶液充分混匀，盖上管盖，室温下孵育3min。然后置于磁力架上磁分离2-3min，弃去上清液。保持pcr管在磁力架上，保证磁性颗粒紧贴管壁，加入160μl85％的乙醇溶液，使用移液器轻轻上下吹打12次洗涤磁性颗粒。重复一次该清洗步骤。然后将pcr管置于恒温混匀仪上50℃开盖干燥5min，保证磁性颗粒完全干燥，聚集的磁性颗粒团簇出现龟裂为干燥标准，如果磁性颗粒未完全干燥，则会影响测序实验结果。移除磁力架，向pcr管中加入37μl无核酸酶水，与磁性颗粒充分混合均匀，静置孵育2min。然后置于磁力架上磁分离2-3min，上清液为cdna文库，将上清液转移至新的试管中用于测序实验。
图2为文库构建结果，泳道1、2为磁性颗粒法提取纸片血，3、4为柱式法提取纸片血，5、6为柱式法提取外周血。由图2可见，通过对比三种提取方法建库结果，说明磁性颗粒能成功提取纸片血rna进行建库测序。
实施例2
1)针对每一种目标核酸分子分别设计相应引物序列，本实施例涉及4种目标分子的检测，目标分子1～4(标号记为#1、#2、#3、#4)的引物序列分别如下所示，扩增对应的目标核酸分子得到97bp、179bp、285bp、532bp长度的产物。扩增引物序列分别为上游引物和下游引物，分别记为序列-1和序列-2：
目标分子#1扩增通用引物序列：序列-1：5’-cgaccactttgtcaagctca-3’；
序列-2：5’-ttactccttggaggccatgt-3’；
目标分子#2扩增通用引物序列：序列-1：5’-tctaaaggtgcgggagta-3’；
序列-2：5’-cttcttgtctgcgatgct-3’；
目标分子#3扩增通用引物序列：序列-1：5’-agcgagcatcccccaaagtt-3’；
序列-2：5’-gggcacgaaggctcatcatt-3’；
目标分子#4扩增通用引物序列：序列-1：5’-aggtcggagtcaacggatttg-3’；
序列-2：5’-gtgatggcatggactgtggt-3’；
2)磁性颗粒提取纸片血：
(1)用移液器吸取50μl新鲜血液滴到whatman903号样品收集滤纸上的一个圆形区域内，样品纸片与干燥剂一同放入带有密封条的生物安全袋中，在室温下过夜干燥；
(2)实验时取两片直径为12mm的圆形纸片血，用打孔器破碎纸片后，将碎屑置于2ml试管中，加入400μl溶液，置于恒温混匀仪上1000rpm，37℃，反应1h。
(3)振荡完成后，取200μl反应上清液，转移到一个新的2ml试管中，加入10mg/ml磁性颗粒溶液250μl，使用移液器上下吹打溶液10次，使其充分混匀，然后置于试管架上静置5min。
(4)将试管转移至磁力架上磁分离10min，保证磁性颗粒紧贴试管壁，吸弃废液。
(5)加入750μl70％的乙醇溶液，用移液器轻轻上下吹打10次清洗磁性颗粒，吸弃废液。再重复一次该清洗步骤。
(6)将试管置于恒温混匀仪上50℃开盖干燥5min，保证磁性颗粒完全干燥，聚集颗粒团簇出现龟裂为干燥标准。如果磁性颗粒未完全干燥，会影响核酸的提取结果。
(7)向干燥后的磁性颗粒中加入80μl无核酸酶水，10μl10×dnaseibuffer，10μldnasei，使用移液器将磁性颗粒与溶液上下吹打5次使其充分混匀，37℃孵育20min，消化dna。
(8)加入150μlpbs溶液，移液器上下吹打10次充分混匀，置于试管架上静置5min后，将试管转移至磁力架上磁分离10min，吸弃废液。
(9)磁性颗粒紧贴试管壁，加入750μl70％的乙醇溶液，移液器轻轻吹打10次清洗磁性颗粒，吸弃废液。再重复一次该清洗步骤。
(10)将试管置于恒温混匀仪上50℃开盖干燥5min，保证磁性颗粒完全干燥。
(11)加入30μl无核酸酶水，移液器吹打混匀10次，得到mrna连接在磁性颗粒上的目标溶液。
3)mrna逆转录第一轮扩增：将引物、目标mrna分子、酶和扩增反应缓冲液等反应体系混合，进行逆转录扩增，得到第一轮扩增产物。
在该步骤中，反应体系配方如下：25μl逆转录扩增体系：5×onesteprt-pcrbuffer5μl、10mmdntpmix1μl、upstreamprimer1.5μl、downstreamprimer1.5μl、onesteprt-pcrenzymemix1μl、templaterna5μl，加rnase-freewater至25μl。
反应条件：50℃210min，55℃30min，95℃15min，95℃20s、54℃20s、72℃30s，进行30个循环，72℃10min，反应完成后，4℃孵育。
4)第二轮扩增：以逆转录扩增产物为模板，加入第二轮扩增体系如下：2×
反应条件：95℃2min，95℃20s、54℃20s、72℃30s，进行30个循环，72℃10min，反应完成后，4℃孵育。
5)扩增产物检测：第二轮pcr反应完成后，得到cdna文库，进行凝胶电泳检测。
图5为磁性颗粒提取mrna扩增结果，泳道1、2、3、4分别为97bp、179bp、285bp、532bp长度扩增产物，5～8分别为1～4的阴性对照。由图5可见，oligdt磁性颗粒提取mrna后直接进行逆转录扩增，成功扩增出四种片段长度的产物，说明磁性颗粒能成功提取痕量mrna进行核酸检测。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里与描述的图例。