1.本发明属于酶基因工程和酶工程领域，涉及一种新型1,4-α-葡聚糖分支酶(简称gbe酶)基因的克隆与表达，具体地说涉及一种编码地衣芽孢杆菌atcc14580的gbe酶的dna序列及其表达与应用。
背景技术：
：：2.淀粉是以葡萄糖为基本单位聚合而成的多糖，是自然界中含量最丰富的碳水化合物之一，是人和动物的主要营养来源，有直链淀粉和支链淀粉两种类型，直链淀粉与支链淀粉的比例随淀粉的植物来源而变化。天然淀粉由于结构原因，存在分散性差、溶解度低、糊化温度较高、易回生等问题，从而影响其利用率。3.1,4-α-葡聚糖分支酶(1,4-α-glucanbranchingenzyme；gbe；ec2.4.1.18)是一种属于糖苷水解酶家族13的糖基转移酶，是合成糖原及支链淀粉的关键酶。它首先将底物分子上某一α-1,4糖苷键水解，切下一个直链葡聚糖片段，继而通过转糖基作用将该片段转移至余下底物分子上某一葡萄糖残基的第6位碳原子上，形成α-1,6糖苷键。已经在许多真核生物和原核生物中发现gbe，包括人、动物、真菌和细菌，不同来源的gbe分布有显著差异。植物通常有多种协同工作的gbe亚型；相反大多数细菌都只有一种gbe，具备分支酶所有的功能，在控制葡聚糖链中支点的频率和位置方面发挥着不可替代的作用。由于1,4-α-葡聚糖分支酶改性的淀粉即高支化淀粉具有特殊理化特性、生理功能及更高的安全性，gbe的特性使其在淀粉改性和高分支度淀粉的制备方面具有重要的价值，因此在食品、医药等工业中具有广阔的应用前景。4.基于gbe的应用价值，比如aquifexaeolicusvf5来源的分支酶用于环糊精制备(专利文献：jp2000316581a)；gb2095681公开了一种来自芽孢杆菌属(bacillus)的分支酶的生产方法以及利用该酶制备改良的食物产品的方法，据称该酶可以用于改善包括面包在内的特定食物产品的保质期。rhodothermusobamensis来源的分支酶在提高淀粉液化产物透明度方面有良好应用(专利文献：201810219838.8)；geobacillusthermoglucosidansstb02来源的淀粉分支酶可用于防止淀粉老化、用于抗性淀粉制备(专利号：201810531948.8)等。研究表明，分支酶作用于淀粉溶液时能够增加淀粉的溶解度和体系的稳定性，同时极大降低淀粉溶液的老化速度(eun-jook,soo-inr,hyun-ahb.biochemicalcharacterisationofaglycogenbranchingenzymefromstreptococcusmutans:enzymaticmodificationofstarch.foodchem2008,4:979–98)。另外分支酶能够应用于造纸工业中，在纸张的成型包衣流程中添加葡聚糖分支酶能够降解该流程中的淀粉溶液，减少其中老化淀粉的生成量，从而有助于提高纸张的均匀度和光滑度(专利文献：us6465203)。5.目前具有重要应用价值的淀粉分支酶主要来源于微生物。然而已报道的淀粉分支酶的应用受限于其酶学性质和催化特性等，使得性能优良且高活性的淀粉分支酶资源的开发具有重要的价值。且使用嗜热酶是工业应用的一种经济有效的策略，因为它能节省大量的冷却时间并能防止微生物的污染，且升高的反应温度可以加快反应过程，缩短反应时间。淀粉资源充分、高效利用的关键是要有酶学特性优良的酶系发挥作用，gbe是淀粉酶系中的一种，因此开发一些新型、耐高温和高效的gbe具有重要的研究意义和实际应用价值。6.由于野生微生物体内gbe含量普遍较低，且提取困难，故实际生产应用中比较重视开发gbe基因工程菌。大肠杆菌表达系统与其它表达系统相比，具有较清楚的遗传性状、操作简便、生长快、表达量大、培养成本低，适于大规模发酵培养的特点，是现阶段最常用的表达系统之一。7.传统获得新酶的做法是从土壤等环境样本中筛选和分离获得新酶，该方法往往需要消耗大量的时间和精力。近年来，计算机信息技术的进步使生物科学同样步入了大数据时代，这大大加速了生物信息学的发展，基因和蛋白数据库容量得到飞速提高。如何在浩瀚的生物信息海洋中快速定位获得所需要的信息，是目前生物资源更充分利用所遇到的难题。技术实现要素：8.为了克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种新的1,4-α-葡聚糖分支酶编码基因，及其编码的蛋白质。9.本发明提供了一种1,4-α-葡聚糖分支酶编码基因，缩写为gbe基因，其核苷酸序列为：seqidno.1，该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1884bp，g+c含量为46.9％，编码627个氨基酸，序列为：seqidno.2。所述编码基因来源于bacilluslicheniformisatcc14580。10.本发明中，所述基因的编码蛋白也属于本发明首次提出的新结构的蛋白质。本发明所述的1,4-α-葡聚糖分支酶基因编码的1,4-α-葡聚糖分支酶蛋白质，缩写为gbe酶，其氨基酸序列为：seqidno.2。11.本发明中，所述氨基酸序列如seqidno.2所示的1,4-α-葡聚糖分支酶最适反应ph为6.5，最适反应温度为60℃左右，并在30℃-50℃(1h)和ph6.0-8.0(24h)之间保持活性相对稳定，如在60.0℃孵育1h，残余酶活可达80％，说明所述gbe具优良的热稳定特性。12.本发明还提供了一种所述1,4-α-葡聚糖分支酶基因的获取方法，根据已报道的来源于嗜热芽孢杆菌的gbe，通过在ncbi上blast进行同源比对，选择同源性较高的序列作为其候选基因。13.本发明以研究比较透彻、热稳定性较高的gbe来源bacillusstearothermophilus的蛋白序列为ncbi查询序列，再通过blast比对，在比对结果中选取序列一致性在30％-80％之间的酶基因，并且可以通过购买等方式获得的gbe来源菌株，通过这种方法获得来自bacilluslicheniformisatcc14580未被国内外研究人员所表征的新型gbe基因。再通过结构域分析在线软件interpro分析本发明gbe基因，属于分支酶家族，并属于糖苷家族13。14.本发明还提供了一种含seqidno.1所示的1,4-α-葡聚糖分支酶基因的重组质粒pet32a(+)gbe；所述重组质粒是将如上所述的1,4-α-葡聚糖分支酶基因克隆到质粒pet32a(+)中所得。15.本发明还提供了一种含本发明所述1,4-α-葡聚糖分支酶基因或所述重组质粒的重组微生物，所述宿主微生物是bl21(de3)，获得基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)。16.本发明还提供了一种基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)的构建方法，由来源于地衣芽孢杆菌atcc14580的总dna获得seqidno.1的gbe基因，以质粒pet32a(+)为表达载体，以大肠杆菌bl21(de3)为表达宿主，通过选择培养基筛选得到包含该质粒的基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)。17.所述方法具体包括以下步骤：18.1)地衣芽孢杆菌atcc14580总dna的提取，所述基因组为模板扩增seqidno.1所示的目的基因，连接到质粒puc19上，转化至感受态的大肠杆菌dh5α，涂布于具有100μg/ml氨苄抗生素的固体培养基上，获取克隆质粒puc19-gbe；19.2)以步骤1)得到的克隆质粒puc19-gbe为模板扩增得到重组质粒pet32a(+)-gbe，通过cacl2转化法转化至感受态细胞大肠杆菌细胞bl21(de3)中，涂布于具有100μg/ml氨苄抗生素的固体培养基上，获得包含该重组质粒pet32a(+)-gbe的基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)。20.本发明还提供了一种由所述的构建方法得到的克隆质粒puc19-gbe、重组质粒pet32a(+)-gbe、或基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)。21.本发明还提供了一种所述的1,4-α-葡聚糖分支酶的表达方法，由如上所述的基因工程菌pet32a-gbe/bl21(de3)诱导表达获得，包括如下步骤：22.1)菌株的活化：将基因工程菌pet32a-gbe/bl21(de3)接种至2ml-3ml的种子培养基中，并于37℃、200rpm的摇床上培养12h。23.2)粗酶液的制备：将步骤1)活化好的种子培养液接种至发酵培养基中，装液量25ml-120ml，并于37℃、200rpm的摇床上培养菌液od600值为0.4-0.6时，加0.2mm-1.5mmiptg继续诱导表达9h-12h，停止发酵，离心，弃上清，收集沉淀，获得gbe的粗酶液。24.步骤1)中，所述种子培养液为lb液体培养基，其组成及含量为：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/l，酵母提取物：5g/l，nacl：10g/l；最后用蒸馏水补充体系至1l，调节ph至7.0，121℃高温高压灭菌20min，以备用。25.步骤2)中，所述发酵培养基为lb、tb、sob、soc液体培养基中的一种或几种；26.其中，所述lb液体培养基的组成为：胰蛋白胨/胰酪胨：10g/l，酵母提取物：5g/l，nacl：10g/l，最后用蒸馏水补充体系至1l，调节ph至7.0，121℃高温高压灭菌20min；27.所述tb液体培养基的组成为：胰蛋白胨/胰酪胨：2g/l，酵母提取物：24g/l，甘油：4ml/l，kh2po4：2.2g/l，k2hpo4：9.4g/l，调节ph至7.0，115℃高温高压灭菌20min；28.所述sob液体培养基的组成为：胰蛋白胨/胰酪胨：20g/l；酵母提取物：5g/l；nacl：0.5g/ml；kcl：2.5mm；mgcl2：2.5mm；琼脂粉：1g/l-2g/l；调节ph至7.0，115℃高温高压灭菌20min。29.所述soc液体培养基的组成为：胰蛋白胨/胰酪胨：20g/l；酵母提取物：5g/l；nacl：0.5g/ml；kcl：2.5mm；mgcl2：2.5mm；葡萄糖：20mm；琼脂粉：1g/l-2g/l；调节ph至7.0，115℃高温高压灭菌20min。30.本发明测1,4-α-葡聚糖分支酶酶活方法如下：31.酶活的测定中主要试剂的配置：32.0.4％(w/v)马铃薯淀粉溶液的配置(底物)：0.4％(w/v)的马铃薯淀粉在60℃下糊化1h后进行冷却，加入100mmtris-hcl(ph7.5)。33.显色液：碘液母液(i2：0.26g；ki：2.6g；蒸馏水定容至10ml)：0.5ml；1nhcl：0.5ml；蒸馏水定容至130ml。显色液用锡箔纸包裹以避光，作为备用显色液。34.1,4-α-葡聚糖分支酶酶活力的测定参照takada等(takatah,takahat,kurikit,etal.propertiesandactivecenterofthethermostablebranchingenzymefrombacillusstearothermophilus.applenvironmicrobiol.1994,60:3096–3104)的方法，具体方法为：将淀粉溶解于100mmol/ltris-hcl缓冲液(ph7.5)，制备浓度为0.1g/100ml的直链淀粉溶液。将50μl适当稀释的待测酶液与等体积的底物溶液混合，在一定温度中水浴中反应30min。再加入2ml碘液(工作液)终止反应，随即在660nm下检测吸光值。35.1,4-α-葡聚糖分支酶酶活力单位(u)定义：在以上条件下，每分钟底物与碘液的混合物吸光度值降低1％所需要的1,4-α-葡聚糖分支酶的酶量。36.根据以下公式确定酶溶液的gbe活性：gbe活性(单位(u)/ml)＝(对照溶液在660nm处的吸光度)-样品溶液在660nm处的吸光度)/对照物的吸光度660nm×100/40×20)。37.本发明提供改进测1,4-α-葡聚糖分支酶酶活方法：38.所述的底物种类可以为糊精、小麦淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉，优选为马铃薯淀粉。39.所述的不同马铃薯淀粉底物浓度可以为2g/l、4g/l、6g/l、8g/l、10g/l、12g/l，优选为4g/l浓度。40.所述的不同反应时间可以为10min-60min，优选为40min。41.在该优化的测酶活条件下，gbe有相对较高的酶活。其中，酶活为11u/ml，比初始发酵条件下的酶活提高了1.75倍。42.本发明还提供了一种基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)中高效表达gbe的生产方法，包括如下发酵条件的优化：43.所述的发酵培养基可以为lb、tb、sob和soc液体培养基，优选为tb液体培养基。44.其中，lb液体培养基的组成为：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/l，酵母提取物：5g/l，nacl：10g/l，琼脂粉：1g/l-2g/l；最后用蒸馏水补充体系至1l，调节ph至7.0，121℃高温高压灭菌20min。45.其中，tb液体培养基的组成为：胰蛋白胨：2g/l；酵母提取物：24g/l；甘油：4ml/l；kh2po4：2.2g/l：k2hpo4：9.4g/l；琼脂粉：1g/l-2g/l；调节ph至7.0，115℃高温高压灭菌20min。46.其中，sob液体培养基的组成为：胰蛋白胨：20g/l；酵母提取物：5g/l；nacl：0.5g/ml；kcl：2.5mm；mgcl2：2.5mm；琼脂粉：1g/l-2g/l；调节ph至7.0，115℃高温高压灭菌20min。47.其中，soc液体培养基的组成为：胰蛋白胨：20g/l；酵母提取物：5g/l；nacl：0.5g/ml；kcl：2.5mm；mgcl2：2.5mm；葡萄糖：20mm；琼脂粉：1g/l-2g/l；调节ph至7.0，115℃高温高压灭菌20min。48.所述的培养基初始ph可以为4.0～10.0，如4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，优选为ph7.0；49.所述的装液量可以为25ml、30ml、60ml、90ml和120ml，优选为25ml；50.所述的诱导时间可以为2h～14h，如2h、4h、6h、8h、10h、12h和14h，优选为10h；51.在该优化的发酵条件下，基因工程菌有相对最高蛋白表达量及酶活。其中，可溶性酶活为24.98u/ml，比初始发酵条件下的酶活提高了1.22倍。52.基因工程菌的初始发酵条件为：培养菌液的装液量为30ml，菌液od600值为0.4-0.6时，以1mmiptg为诱导物，在37℃诱导表达12h时，停止发酵，离心，收集沉淀，超声破碎，收集破碎上清，获得gbe的粗酶液。53.本发明所述重组酶gbe具优良的热稳定特性、酶学特性，具有分支活性，可用于淀粉改性，如高分支度改性淀粉的制备以及可溶性淀粉的制备等，适合食品、化妆品和医药等工业应用的需要，具有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。基于此，本发明还提供了所述1,4-α-葡聚糖分支酶基因、1,4-α-葡聚糖分支酶在制备具有1,4-α-葡聚糖分支酶作用的产品中的应用，用于淀粉加工、食品或饲料领域，用于高分支淀粉制备和/或淀粉改性、慢消化淀粉和/或抗性淀粉制备。本发明中，所述的1,4-α-葡聚糖分支酶基因、1,4-α-葡聚糖分支酶用于改性可溶性淀粉的制备、淀粉凝胶特性的优化或淀粉抗老化特性的优化。54.本发明的有益效果在于：55.(1)本发明针对具有特定催化功能的目标1,4-α-葡聚糖分支酶，利用微生物全基因组数据和生物信息学工具进行1,4-α-葡聚糖分支酶基因的初步筛选，能够快速获得最适温度为50-60℃的高温1,4-α-葡聚糖分支酶。本发明获取新型gbe较传统方法可有效减轻实验工作量，针对性强，筛选效率较高。56.(2)本发明改进了gbe酶活测定方法，增加其方法的灵敏度。因gbe在50°孵育1h的高热稳定性，在工程菌株发酵表达时，可以在高温50℃下孵育一定时间，以降解宿主菌内源蛋白，这样不仅可以减少杂蛋白对gbe酶活及gbe纯化时的干扰，也可以简化制备gbe的流程，对于推动gbe的工业化应用有重要意义。本发明为研究开发1,4-α-葡聚糖分支酶提供基础。对于其他酶的筛选和制备也提供了有价值的参考。该gbe的热稳定性是一个关键因素，在淀粉工业中通常需要热稳定酶，因为淀粉的糊化温度为60-75℃，gbe热稳定性强不仅有利于延长gbe酶的贮藏时间、减少酶在保存、运输过程中活力的损失，而且可以使酶在较高的温度下保持较高的活力，从而提高反应效率，缩短生产周期，进而降低生产成本，这种热稳定性和专一性使该酶在淀粉加工、食品工业、饲料、酿造、发酵、造纸、纺织工业和医药等工业具有较高应用潜力。附图说明57.图1为本发明1,4-α-葡聚糖分支酶编码基因的pcr扩增电泳图。58.其中，m：核酸marker；1：gbe基因pcr扩增。59.图2为本发明1,4-α-葡聚糖分支酶基因表达载体的示意图。60.图3为本发明重组1,4-α-葡聚糖分支酶的sds-page电泳图和westernblot电泳图；61.其中，a为基因工程菌pet32a-gbe/bl21(de3)胞内上清的sds-page电泳结果(1：标准蛋白marker；2：重组蛋白破碎上清粗酶液)；62.b为基因工程菌pet32a-gbe/bl21(de3)胞内沉淀的sds-page电泳结果(1：标准蛋白marker；2：重组蛋白破碎沉淀包涵体酶；3：空载诱导)；63.c为基因工程菌pet32a-gbe/bl21(de3)westernblot电泳结果(1：胞外上清；2：胞内上清；3：胞内沉淀；m：蛋白marker)。64.图4为本发明1,4-α-葡聚糖分支酶酶学性质结果图；其中，a为温度对gbe的影响结果图，可获得gbe最适温度；b为温度对gbe稳定性的影响结果图，可获得gbe随温度变化的稳定性；其中，横坐标表示温度，纵坐标表示相对酶活；c为ph对gbe的影响结果图，可获得gbe最适ph；d为ph对gbe稳定性的影响结果图，可获得gbe随ph变化的稳定性；其中，横坐标表示ph，纵坐标表示相对酶活。65.图5为本发明基因工程菌pet32a-4gt/bl21(de3)在不同培养基中的生长曲线结果图。具体实施方式66.结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。67.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。68.本发明利用生物信息学的方法选取新型耐高温的芽孢杆菌来源的gbe基因，根据已报道的嗜热芽孢杆菌来源的gbe的氨基酸序列在ncbi上进行比对，以该方法筛选到的地衣芽孢杆菌atcc14580gbe基因为例，其序列与参考序列相似度达到67.55％。结合ncbi基因组信息获得orf，以全长序列设计gbe基因引物，以地衣芽孢杆菌atcc14580的基因组dna为模板，进行gbe基因全长的pcr扩增，得到gbe基因的全长序列。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1884bp，g+c含量为46.9％，基因序列为seqidno.1，编码627个氨基酸，其氨基酸序列为seqidno.2；以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，导入质粒pet32a(+)，并实现快速高效表达高温1,4-α-葡聚糖分支酶基因的工程菌株，可以在其胞内进行可溶性表达，对其重组菌株的发酵方法的优化，进一步实现gbe的高效表达，获取1,4-α-葡聚糖分支酶。69.本发明改进了gbe酶活的测定方法，增加了其方法的灵敏度，同时，在提高测定1,4-α-葡聚糖分支酶酶活方法的灵敏度的基础上，本发明构建的基因工程菌的gbe酶活可达到24.98u/ml；酶的最适反应ph值为6.5，在较宽的ph6.0-8.0范围内保持稳定。最适反应温度为60℃，在30℃-50℃保持较高的酶活力，在60℃残留酶活可达80％；bacillusstearothermophilusvgbe是先前报道的热稳定的be(kiel等，1991；takata等，1994)，因此在53℃时具有最佳温度，在60℃孵育30分钟后，gbe酶活约为80％，而此来源gbe则具有良好的高温适应性；该1,4-α-葡聚糖分支酶能高效地作用于多种淀粉，在以马铃薯淀粉为底物时酶活最高，gbe对于直链淀粉类的由α-1,4-糖苷键连接的低分支度的葡聚糖(多糖)类底物具有较弱的分支能力，对分支度较高的底物分支能力较强。70.实施例1gbe基因的扩增71.1.1新型gbe基因获得72.利用生物信息学的方法选取新型耐高温的芽孢杆菌来源的gbe基因，根据已报道的嗜热芽孢杆菌来源的gbe的氨基酸序列在ncbi上进行比对，以该方法筛选到的地衣芽孢杆菌atcc14580gbe基因为例，其序列与参考序列相似度达到67.55％。73.(1)地衣芽孢杆菌atcc14580总dna的提取：74.将地衣芽孢杆菌atcc14580在lb液体培养基中培养2天后，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀并悬浮于500μltris-edta缓冲液中，然后加入15μl溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μlrna酶，37℃下保温30min，加入30μl10％十二烷基硫酸钠溶液和15μl蛋白酶k，37℃下保温60min，加入100μl5m的nacl溶液和80μl十六烷基三甲基溴化铵，65℃下保温20min；用700μl的体积比为25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μl的体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用1400μl体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，向沉淀中加入200μl70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用tris-edta缓冲液溶解，即得到地衣芽孢杆菌atcc14580的总dna。75.1.2新型gbe基因pcr扩增76.结合ncbi基因组信息获得orf，以全长序列设计gbe基因引物，以地衣芽孢杆菌atcc14580的基因组dna为模板，进行gbe基因全长的pcr扩增，得到gbe基因的全长序列。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1884bp，g+c含量为46.9％，基因序列为seqidno.1，编码627个氨基酸，其氨基酸序列为seqidno.2。所用引物为f1和r1，结果见图1所示，pcr扩增产物的dna序列如seqidno.1中自5’末端起第1位至第1884位核苷酸所示，与预期大小一致，表明成功从地衣芽孢杆菌atcc14580的基因组中扩增gbe基因。77.f1:5’‑tgctctagaatggctggtgtgagtgcctcg-3’(下划线xbai)(seqidno.3)78.r1:5’‑cgcggatcctccctttttcgctcctctct-3’(下划线xbai)(seqidno.4)79.pcr反应在50μl体系中进行：5×pcr缓冲液10μl，2.5mmol/ldntps4μl，10μmol/l上下游引物各1μl，模板dna1μl，primerstardna酶0.5μl，加双蒸水至总体系50μl；80.反应条件为：在94℃变性2min后开始循环，然后94℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸2min，共32个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到1884bp的pcr片段，割胶回收。将此条带回收并连接puc19载体、获得克隆载体puc19-gbe，热激法转化到大肠杆菌dh5α，经过菌落pcr鉴定重组子后测序。测序结果经ncbi的blast搜索比对，结果表明该条带的核苷酸序列与gbe一致。81.实施例2重组gbe的制备82.2.1gbe编码基因构建重组菌83.将已活化的含质粒重组菌pet32a(+)/dh5α和实施例1得到的含gbe重组菌puc19-gbe/dh5α分别接种至含100μg/ml氨苄抗生素的lb液体培养基中，于37℃、200rpm扩大培养12h后，进行质粒的抽提。以f2和r2作为gbe的特异性引物，以puc19-gbe为模板，进行gbe的pcr扩增。扩增后的gbe大小为1884bp，将与预计大小相符的gbe片段，进行琼脂糖dna凝胶回收。84.f2:5’‑cgcggatccatggctggtgtgagtgcctcg-3’(下划线bamhi)(seqidno.5)85.r2:5’‑ccgctcgagtccctttttcgctcctctct-3’(下划线xhoi)(seqidno.6)86.pcr条件：98℃预变性2min；随后30个循环(98℃10s，64℃15s，72℃120s)，72℃再延伸10min。87.用bamhi和xhol对回收后的gbe与质粒pet-32a(+)进行双酶切，酶切条件为37℃，2h。将符合预计大小的酶切产物进行dna琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，利用t4dna连接酶将双酶切后的质粒pet-32a(+)与gbe进行连接，gbe编码序列与pet32a(+)表达系统中存在的细菌硫氧还蛋白基因序列融合，构建重组质粒pet-32a(+)-gbe(图2)，并将连接液转化至感受态的大肠杆菌b中，并涂布于含100μg/ml氨苄抗生素的lb固体培养基平板上，构建重组菌pet32a(+)-gbe/dh5α。用引物f2(seqidno.5)和引物r3(seqidno.6)进行菌落pcr、酶切验证及测序。挑取验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)，并涂布于含100μg/ml氨苄抗生素的lb固体培养基平板上，挑选已经成功导入重组质粒的菌株。所述的构建pet-32a(+)-gbe重组质粒，连接体系如下：88.pet-32a(+)酶切空载体1μl89.酶切后的目的基因2.5μl90.t4dnaligase1μl91.t4dnaligasebuffer2.5μl92.加ddh2o至25μl。93.利用化学转化法的具体操作参考《分子克隆实验指南》(第三版)：制备大肠杆菌感受态细胞。在lb平板上划线接种bl21(de3)，37℃培养18-20h，挑取生长良好的单个菌落(直径2-3mm)接种于100mllb液体培养基中，37度200r/min摇荡培养约3h，测量od600值达到0.6-0.8。在无菌超净工作台内将培养液转移入两个无菌、用冰预冷过的50ml聚丙烯管中，冰浴10min，使培养物冷却至0℃。4℃4000r/min离心10min。尽弃上清，沉淀分别用20ml预冷的0.1mcacl2重新悬浮，冰浴1h后，4℃条件下4000r/min离心10min，弃除上清，沉淀分别用2ml预冷的0.1mcacl2重悬，加无菌甘油至终浓度5％，按100ul管进行分装，可立即使用或者-70℃保存。94.取制备好的感受态细胞bl21(de3)100ul加入到1.5ml离心管中，将连接好的pet32a(+)-gbe重组质粒5ul加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90s，冰浴1min-3min。加入400ullb，于37℃200r/min振荡培养45min使其复苏。复苏后的细菌悬液于4℃5000r/min离心10min，弃去400ul上清，用剩余的100ul重悬沉淀涂布于含有相应抗生素的lb琼脂平板。若转化产物为质粒则无需离心直接去100ul菌液涂布平板即可。37℃正置培养1h，在将平板翻过来，倒置37℃培养14h置出现菌落。即可获得工程菌株pet32a(+)-gbe/bl21(de3)。95.2.2重组gbe的表达96.菌株的活化：取一环平板上的本发明实施例2筛选获得的基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)菌体接种至含100μg/ml氨苄抗生素的2mllb液体培养基中，于37℃、200rpm扩大培养12h。97.菌株的发酵：将已活化的基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)菌体培养液按1％接种量，接种至装有30ml、含100μg/ml氨苄抗生素的lb液体培养基中，200rpm，37℃发酵培养，待菌液od600增至0.6时，加入1mmiptg诱导表达12h。停止发酵后，将发酵液经10000rpm离心10min，收集沉淀，其中沉淀用超声破碎仪进行破碎，再次离心，获得胞内上清和沉淀，即可获得胞内中的粗酶。98.其中，lb培养基：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/l；酵母提取物：5g/l；nacl：10g/l；琼脂粉(固体lb培养基则加入)：1g/l-2g/l；最后用蒸馏水补充体系至1l，调节ph至7.0，121℃高温高压灭菌20min。99.2.3重组表达的gbe活性测定100.酶活的测定中主要试剂的配置：101.4g/l(w/v)马铃薯淀粉溶液的配置(底物)：4g/l(w/v)的马铃薯淀粉在60℃下糊化1h后进行冷却，加入100mmtris-hcl(ph7.5)。102.显色液：碘液母液(i2：0.26g；ki：2.6g；蒸馏水定容至10ml)：0.5ml；1nhcl：0.5ml；蒸馏水定容至130ml。显色液用锡箔纸包裹以避光，作为备用显色液。103.1,4-α-葡聚糖分支酶酶活力的测定参照takada等(takatah,takahat,kurikit,etal.propertiesandactivecenterofthethermostablebranchingenzymefrombacillusstearothermophilus.applenvironmicrobiol.1994,60:3096–3104)的方法并稍作改动，具体方法为：将淀粉溶解于100mmol/ltris-hcl缓冲液(ph7.5)，制备浓度为4g/l的底物溶液。将50μl适当稀释的待测酶液与等体积的底物溶液混合，在60℃水浴中反应40min。再加入2ml碘液(工作液)终止反应，随即在660nm下检测吸光值。104.本发明提出改进测1,4-α-葡聚糖分支酶酶活方法：105.具有不同浓度的底物对gbe酶活性测定的影响106.分别配置含2g/l、4g/l、6g/l、8g/l、10g/l、12g/l的马铃薯淀粉的底物溶液，高温糊化1h，待溶液冷却后，将50μl适当稀释的待测酶液与等体积的底物溶液混合，在60℃水浴中反应30min。再加入2ml碘液(工作液)终止反应，随即在660nm下检测吸光值，以最高酶活为100％，分别测定它们的相对酶活。结果表明，底物浓度为4g/l时，酶活最高，因此，最终选择4g/l的马铃薯淀粉作为后续酶活测定底物浓度。107.2)反应时间对gbe酶活性测定的影响108.将本发明获得的最优浓度为4g/l的马铃薯淀粉作为底物，高温糊化1h，待溶液冷却后，将50μl适当稀释的待测酶液与等体积的底物溶液混合，在60℃水浴中反应，不同的反应时间：10min、20min、30min、40min、50min、60min，再加入2ml碘液(工作液)终止反应，随即在660nm下检测吸光值，以最高酶活为100％，分别测定它们的相对酶活。结果表明，反应时间为40min，其gbe酶活最高，因此，最终选择反应时间40min，作为后续酶活测定底物浓度。109.最终确认，将淀粉溶解于100mmol/ltris-hcl缓冲液(ph7.5)，制备浓度为4g/l的底物溶液。将50μl适当稀释的待测酶液与等体积的底物溶液混合，在60℃水浴中反应40min。110.以1％的淀粉底物反应时间为30min，酶活为4u/ml，将其作为对照组，与本发明改进的gbe测定酶活方法以4g/l的淀粉底物、反应时间为40min，酶活为11u/ml，提高1.75倍。111.1,4-α-葡聚糖分支酶酶活力单位(u)定义：在以上条件下，每分钟底物与碘液的混合物吸光度值降低1％所需要的1,4-α-葡聚糖分支酶的酶量。112.根据以下公式确定酶溶液的gbe活性：gbe活性(单位(u)/ml)＝(对照溶液在660nm处的吸光度)-样品溶液在660nm处的吸光度)/对照物的吸光度660nm×100/40×20)。113.由酶活的测定结果可知，基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)菌株的胞内酶活为11u/ml。114.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page电泳)以及蛋白质免疫印迹(westernblot)115.pet32a-gbe/bl21(de3)重组菌株表达的重组gbe其理论分子量为92.6kda。由图3可知，在1mmiptg诱导下，基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)的发酵细胞中上清和沉淀分子量大小一致的条带(箭头处)。说明在iptg诱导下，gbe在工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)中实现胞内可溶性和包涵体的表达。116.2.5gbe的纯化117.将基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)于含100ug/mllb液体培养基中发酵扩大培养，待菌液od600值增至0.6时，加入诱导物1mmiptg，诱导表达培养12h。待发酵结束后，将发酵物于4℃，12000rpm离心机中离心，弃上清，留沉淀。118.借助镍柱亲和层析方法，将上述菌体，超声破碎，离心得到胞内上清；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mm磷酸钠、0.5m氯化钠、20mm咪唑、ph7.4的缓冲液a溶解，并在缓冲液a中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；ni亲和柱用缓冲液a平衡后，将上样样品吸入ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液a、含20-500mm咪唑的缓冲液a、含500mm咪唑的缓冲液a洗脱，流速1ml/min，分管收集含gbe酶酶活的洗脱液；活力组分在ph＝6.5、50mm磷酸钠缓冲液中透析过夜后，得纯化gbe酶制品。本发明通过本实例获得的纯化的gbe进行的相关分析。119.实施例3gbe酶学特性研究120.3.1温度对酶活力的影响121.最适反应温度的测定：在不同温度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)，ph7.5的条件下测定实例2获得gbe的活性，将最高酶活力设定为100％，每个实验做3个平行，结果取平均值。图4a表明，重组1,4-α-葡聚糖分支酶gbe的最适反应温度为60℃。122.热稳定性的测定：将实例2获得gbe在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，ph7.5下保温1h，于冰上迅速冷却，各自测定残余酶活力，以未保温的酶活力为100％。图4b表明，经测定该gbe最适反应温度为60℃，并在30℃-50℃之间保持相对稳定，在60℃下孵育1h残留酶活可达80％，与目前报道的大多数gbe的温度性质不同，1,4-α-葡聚糖分支酶gbe表现出了良好的高温适应性，在30°‑60°温度范围内都能保持较高的酶活力。有潜力应用于高温条件下淀粉液化加工行业。123.3.2ph对酶活力的影响124.最适反应ph的测定：在不同ph值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0)，60℃下测定实例2获得gbe的活性，将最高活力设定为100％，图4c表明，重组1,4-α-葡聚糖分支酶gbe的最适ph为6.5。125.ph稳定性的测定：将实施例2获得gbe在ph＝4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0下，4℃保持24h，后各自测定其残余活力，以ph7.0的酶活力为100％。图4d表明，重组1,4-α-葡聚糖分支酶gbe在ph6.0-8.0范围内处理24h后酶活力仍保持在80％以上，具有一定的ph稳定范围。126.3.3gbe底物特异性127.直链淀粉内部几乎全部由线性的α-1,4-糖苷键连接，而其他淀粉(小麦淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉等)中存在着不同含量的α-1,6-糖苷键。α-1,6-糖苷键构成了淀粉的分支结构，其中直链淀粉分支度最低。分支度的不同使得这些淀粉具有了不同的结构和理化性质。128.本发明分别以糊精、马铃薯淀粉，玉米淀粉，直链淀粉，小麦淀粉为底物测定实例2获得的1,4-α-葡聚糖分支酶gbe的底物特异性，将淀粉溶解于100mmol/ltris-hcl缓冲液(ph6.5)，配制成浓度4g/l，60℃水浴中反应40min，以最适底物时的酶活为100％，计算得到其他底物条件下的相对酶活力。分别配置含4g/l(w/v)的，对实施例2纯化后的gbe酶进行底物特异性分析，结果表明gbe对所测底物均具有较高活性，其中以马铃薯淀粉为底物时活性最高；以马铃薯淀粉和玉米淀粉为底物时，1,4-α-葡聚糖分支酶gbe表现出相对较高的酶活，以直链淀粉为底物时，该酶的酶活明显降低。129.结果表明，gbe对于直链淀粉类的由α-1,4-糖苷键连接的低分支度的葡聚糖(多糖)类底物具有较弱的分支能力，对分支度较高的底物分支能力较强，这种专一性使该酶在淀粉加工、食品工业、酿造、发酵、纺织工业和医药等工业具有较高应用潜力。130.实施例4利用gbe制备改性淀粉的透明度及溶解性的应用分析131.参照实施例2中制备的gbe处理马铃薯淀粉40min，4℃冷藏不同的时间，间隔时间测定600nm下的吸光度以判断其透明度。结果显示，加gbe酶处理不同时间后的马铃薯改性淀粉与未加gbe酶马铃薯淀粉对照组相比较，od600吸收光值一直在降低，表明gbe可以增加淀粉的透明度。132.同时，对淀粉溶解性特性进行测定，以判断gbe作用于淀粉后对其溶解性特性的影响。结果显示，与对照相比，gbe作用于马铃薯淀粉后，在起始阶段能够显著提高改性淀粉的溶解性，提供稳定性提高，并随着酶作用时间的延长，得到的淀粉分支度提高，溶解性提高。133.实施例5gbe菌株发酵条件的优化134.1)培养基种类的优化135.将已活化的基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)以1％的接种量分别转接于含100ug/ml氨苄抗生素的30mllb、tb、sob和soc液体培养基中，并于37℃、200rpm的摇床中振荡培养。在时间点为2h，4h，6h，8h，10h，12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h和48h时，分别进行取样，并测菌液od600的平均值(每个时间点取3瓶平行样)，绘制其生长曲线。136.其中，lb培养基：胰蛋白胨(胰酪胨)：10g/l，酵母提取物：5g/l，nacl：10g/l；最后用蒸馏水补充体系至1l，调节ph至7.0，121℃高温高压灭菌20min。tb培养基：胰蛋白胨：2g/l；酵母提取物：24g/l；甘油：4ml/l；kh2po4：2.2g/l：k2hpo4：9.4g/l；调节ph至7.0，115℃高温高压灭菌20min。sob液体培养基的组成为：胰蛋白胨：20g/l；酵母提取物：5g/l；nacl：0.5g/ml；kcl：2.5mm；mgcl2：2.5mm；琼脂粉：1g/l-2g/l；调节ph至7.0，115℃高温高压灭菌20min。137.soc液体培养基的组成为：胰蛋白胨：20g/l；酵母提取物：5g/l；nacl：0.5g/ml；kcl：2.5mm；mgcl2：2.5mm；葡萄糖：20mm；琼脂粉：1g/l-2g/l；调节ph至7.0，115℃高温高压灭菌20min。。138.由图5结果表明，在tb培养基中，基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)的对数生长期时间最长，生长速率与生长密度也相对最高，其od600值最高可增至12.5。该时期菌株的生长活力旺盛，菌体密度越高，有助于gbe蛋白的高效表达。因此，选择tb培养基来发酵该重组菌，能相对最优化地表达gbe。菌株生长相对较好的其它培养基依次为soc、sob和lb。139.2)培养基初始ph的优化140.设置培养基初始ph分别为4、5、6、7、8、9和10。将活化的基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)以1％的接种量分别转接于具有不同初始ph，且含100μg/ml氨苄抗生素的的30mltb液体培养基中，每个条件下取3瓶平行样。待样品于37℃、200rpm的摇床中振荡培养至菌液od600为0.6时，加入1mmiptg，诱导表达12h。将发酵完成后的各菌液进行od600值的测定，并测定胞内可溶性酶活，并选出相对最优的初始培养基的ph。141.由结果分析，基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)在ph值为7.0的培养基中，表达相对最高的酶活。而在ph值为4和9的培养基中，酶活较低。这表明该菌在过酸或过碱的环境中生长对gbe的酶活有明显的抑制作用。142.3)装液量的优化143.以1％(v/v)的接种量分别转接已活化的基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)至25ml、30ml、60ml、90ml和120ml的tb液体培养基中，培养基中含100μg/ml的氨苄抗生素，每个条件下3瓶平行样。并将其在37℃、200rpm的摇床中振荡培养。待其od600值增至0.4-0.6时，加入1mmiptg，于同样培养条件下诱导培养12h。后期菌体取样及处理与2)培养基初始ph的优化中一样。144.由结果分析，当基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)发酵液的装液量为25ml时，有最高的酶活。随着装液量的增加，酶活逐渐降低。这是因为，装液量的过多使细胞溶氧量不足，从而抑制了菌株的产酶能力。145.4)诱导时间的优化146.以1％(v/v)的接种量转接活化的基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)至含100ug/ml氨苄抗生素的25ml的tb液体培养基中，每个条件下3瓶。待样品于37℃、200rpm振荡培养至od600为0.4-0.6时，加入1mmiptg诱导培养。在诱导表达时间为2h、4h、6h、8h、10h、12h和14h。后期菌体取样及处理与2)培养基初始ph的优化中一样。147.由结果可知，基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)在诱导时间为10h之前，随着诱导时间的延长，gbe的酶活逐渐增加。当诱导时间为10h，酶活达到最高值。而后，随着时间的延长，酶活逐渐降低。148.最终确认，基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)以1％的接菌量接种至25mltb培养基中(ph7.0)，以1mmiptg作为诱导物，在37℃诱导发酵培养10h，菌株发酵表达的gbe酶活相对最高。因此，选择该发酵条件作为基因工程菌pet32a(+)-gbe/bl21(de3)菌株制备gbe的最佳发酵条件。149.表1为基因工程菌pet32a-4gt-/bl21(de3)优化前后的发酵条件比较150.表1[0151][0152]表2为优化前后的酶活比较。优化前后，od600数据显示菌株密度由原来的3.52增至8.98，菌体生长密度提高了1.55倍；gbe酶活由11.23u/ml提高到24.98u/ml，酶活提高了122.43％。[0153]表2[0154][0155]在本发明中，gbe表现出耐高温特性，具有在淀粉的改性过程中，该gbe的热稳定性是一个关键因素，gbe热稳定性强不仅有利于延长gbe酶的贮藏时间、减少酶在保存、运输过程中活力的损失，而且可以使酶在较高的温度下保持较高的活力，从而提高反应效率，缩短生产周期，进而降低生产成本。这对淀粉在食品工业中的运用非常重要。[0156]本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。当前第1页12当前第1页12