一种利用吸附柱提取细菌基因组dna的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用吸附柱提取细菌基因组dna的方法。
背景技术：
2.细菌基因组dna提取是当前分子扩增和检测领域中最基本的实验操作之一，有着很多经典的方法，如ctab法，但是这些方法针对样本中含有较多杂质质（如蛋白、肽链、rna、多糖等）的基因组dna提取无法达到理想的效果，并且耗时较长，相关溶剂使用也对人体伤害较大。近年来，利用吸附柱在细菌基因组dna提取应用中越来越多地受到关注，但也很难获得较纯的dna，从而影响到下游基因组dna扩增和检测。因此，需要一种提高dna纯度的细菌基因组dna提取方法。
技术实现要素：
3.为克服当前分子扩增和检测领域中所遇到的由于杂质较多而造成下游基因组dna扩增和检测失败的问题，去除样本中的杂质而特异性获得dna，本发明发明目的在于提供一种利用吸附柱提取细菌基因组dna的方法。
4.本发明目的通过以下方案实现：一种利用吸附柱提取细菌基因组dna的方法，其特征在于利用吸附柱提取细菌基因组dna的方法，可以去除杂质残留，获得高纯度的dna，该方法包括以下步骤：（1）取1ml细菌培养液至1.5 ml离心管，12000 rpm离心5分钟，弃上清液；（2）在细菌沉淀中加250 μl溶菌酶溶液，混匀，然后在37℃中保温20分钟；（3）加入200μl无水乙醇，混匀加入到吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃废液；（4）加入500
µ
l洗涤缓冲液，12000rpm 离心1分钟，弃废液；再次加入500
µ
l洗涤缓冲液，12000rpm 离心1分钟，弃废液，然后，12000rpm 离心2分钟，静置吹干；（5）更换一个洁净的离心管，在吸附柱内底部加入100μl洗脱缓冲液，静置2分钟，12000rpm离心2分钟收集dna。
5.所述的溶菌酶溶液的组成为0.1g溶菌酶/10ml 10mmol/l tris.clph 8.0 。
6.所述的洗涤缓冲液的组成为20mm nacl，2mm tris-hcl ph7.5。
7.所述的所述洗脱缓冲液的组成为10mm tris-cl ph8.5。
8.本发明提出的利用吸附柱提取细菌基因组dna的方法，去除了蛋白、肽链、rna、多糖等杂质的干扰对dna浓度的影响，可以避免传统dna提取中出现浓度低而导致下游试验失败的现象。
9.本发明的有益效果包括：（1）dna纯度较高。在本发明缓冲液的环境中吸附柱对dna的特异性吸附能力增强，使最终获得的dna纯度升高，od260/280值为1.80-1.90。
10.（2）操作便捷、省时、安全。该方法无需酚/氯仿等有毒有机试剂，基于吸附柱再配合溶菌酶溶液、洗涤缓冲液的使用可大幅度提高工作效率，操作方法简单高效。
11.（3）采用本发明方法提取的dna可广泛用于各种常规分子生物学操作，包括酶切、pcr、实时荧光pcr、lamp、文库构建、southern杂交、芯片检测、高通量测序等实验。
具体实施方式
12.结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
13.实施例1河流弧菌基因组dna，河流弧菌菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号cgmcc 1.1609，利用吸附柱提取细菌基因组dna的方法，以去除杂质残留，获得高纯度的dna，按以下步骤提取：（1）取1ml细菌培养液至1.5 ml离心管，12000 rpm离心5分钟，弃上清液；（2）在细菌沉淀中加250 μl溶菌酶溶液，混匀后在37℃中保温20分钟；（3）加入200μl无水乙醇，混匀加入到吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃废液；（4）加入500
µ
l洗涤缓冲液，12000rpm 离心1分钟，弃废液；再次加入500μl洗涤缓冲液，12000rpm 离心1分钟，弃废液，然后，12000rpm 离心2分钟，静置吹干；（5）更换一个洁净的离心管，在吸附柱内底部加入100μl洗脱缓冲液，静置2分钟，12000rpm离心2分钟收集dna。
14.本实施例中，所述溶菌酶溶液的组成为0.1g溶菌酶/10ml 10mmol/l tris.cl (ph 8.0)。
15.本实施例中，所述洗涤缓冲液的组成为20mm nacl，2mm tris-hcl ph7.5。
16.本实施例中，所述洗脱缓冲液的组成为10mm tris-cl ph8.5。
17.通过上述步骤完成河流弧菌基因组dna提取后，测得dna od260/od280为1.89，浓度为205ng/
µ
l（采用某市售吸附柱法dna提取试剂盒进行提取，所获得的od260/od280为1.78，dna浓度为200ng/
µ
l）。
18.将提取获得的河流弧菌基因组dna，采用河流弧菌特异引物进行pcr扩增，结果获得了条带单一且很亮的电泳条带，其长度也符合预期，表明基因组dna提取质量很好。
19.实施例2伊氏李斯特氏菌基因组dna，伊氏李斯特氏菌菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号cicc21663，按步骤如下提取：（1）取1ml细菌培养液至1.5 ml离心管，12000 rpm离心5分钟，弃上清液；（2）在细菌沉淀中加250 μl溶菌酶溶液，混匀，然后在37℃中保温20分钟；（3）加入200μl无水乙醇，混匀加入到吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃废液；（4）加入500
µ
l洗涤缓冲液，12000rpm 离心1分钟，弃废液；再次加入500μl洗涤缓冲液，12000rpm 离心1分钟，弃废液，然后，12000rpm 离心2分钟，静置吹干；（5）更换一个洁净的离心管，在吸附柱内底部加入100μl洗脱缓冲液，静置2分钟，12000rpm离心2分钟收集dna。
20.本实施例中，溶菌酶溶液的组成为0.1g溶菌酶/10ml 10mmol/l tris.cl (ph 8.0)。
21.本实施例中，所述洗涤缓冲液的组成为20mm nacl，2mm tris-hcl ph7.5。
22.本实施例中，所述洗脱缓冲液的组成为10mm tris-cl ph8.5。
23.通过上述步骤完成伊氏李斯特氏菌基因组dna提取后，测得dna od260/od280为1.90，浓度为220ng/
µ
l（采用ctab法进行提取，所获得的od260/od280为1.75，dna浓度为223ng/
µ
l）。
24.将提取获得的伊氏李斯特氏菌基因组dna，采用伊氏李斯特氏菌特异性引物进行实时荧光pcr扩增，也获得了符合预期的扩增结果，表明采用本发明方法获得的伊氏李斯特氏菌基因组dna质量很好。
25.此外，将提取获得的伊氏李斯特氏菌菌基因组dna，采用伊氏李斯特氏菌特异性引物进行lamp扩增，电泳结果显示，获得了预期的扩增结果，也表明采用本发明方法获得的伊氏李斯特氏菌基因组dna质量很好。