一种水稻抽穗期基因载体的应用的制作方法

本发明涉及水稻抽穗期基因的应用，尤其是10种水稻抽穗期基因的定点改良及品种北移。

背景技术：

水稻抽穗期(heading date,HD)是指水稻从播种到抽穗(开花)所经历的时间，抽穗期是影响水稻种植和生产的最重要因素之一，它决定着水稻的种植区域和产量等其他农艺性状。黑龙江是我国优质粳稻的主产区和商品粮区，属于北方高纬度寒地稻作区，其典型地势特征南北纬度跨度大(43o25′N到53o33′N)，对水稻生长来说，可以分成4个积温带，越往北部，积温越低，因而可种植品种越少，随着世界人口增长，作为主要粮食作物的水稻种植面积急需扩大，在黑龙江省北部，有大量种植区域可以开发，那里水源充足但是霜冻来临较早，因而对于早熟优质的水稻品种的开发成为当下的重中之重。

控制水稻抽穗期的基因众多，目前，已经有大量控制水稻抽穗期基因被报道，也有多个数量性状基因被克隆。但长日照条件下，控制水稻开花的基因主要有Hd1，Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7，Hd5/DTH8/Ghd8，Hd6，Hd16及Hd17，前期研究已明确Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8是控制黑龙江省水稻抽穗期的主效基因，因而可进一步通过分子辅助育种的方式，人工改造这三个主效基因及其不同组合方式，来选育适合当地的水稻品种，促进品种北移，同时扩大优良品种的种植区域。

技术实现要素：

本发明的目的是选取优质水稻品种，进行抽穗期基因的定点改良，最终获得早熟优质水稻品种，促进品种北移扩大种植面积。

本发明的一种水稻抽穗期基因载体的应用，它用于对水稻进行改良；

所述的水稻抽穗期基因载体为CRISPR/Cas9载体。

本发明的改良水稻品种Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8基因突变类型如图7所示。

本发明的有益效果：

本发明利用基因编辑技术对10种优质水稻品种进行抽穗期基因Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8的定点改良，经过一年的育种时间获得了纯合早熟优质改良后代。

每种材料的改良后代Hd2/OsPRR37，Hd4/Ghd7和Hd5/DTH8/Ghd8发生了不同的突变类型，导致抽穗期相对于改良前的材料至少提前5天，每种材料的种植面积至少可以北移一个积温带。

附图说明

图1为Hd2的靶点序列及构建的敲除载体形式，其中，椭圆形的标注为Hd2基因敲除靶点PAM，下划线标注为靶点序列；长方形框形标注为鉴定序列；

图2为Hd4的靶点序列及构建的敲除载体形式，其中，椭圆形的标注为Hd4基因敲除靶点PAM，下划线标注为靶点序列；长方形框形标注为鉴定序列；

图3为Hd5的靶点序列及构建的敲除载体形式，其中，椭圆形的标注为Hd5基因敲除靶点PAM，下划线标注为靶点序列；长方形框形标注为鉴定序列；

图4为Hd2、Hd4和Hd5基因的五个靶点构建于pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体骨架上的示意图；

图5为10种水稻品种改良前后抽穗期基因组合形式图；

图6为10种水稻品种改良前后抽穗期基因的抽穗期数据变化图，以松粳9、龙稻5和龙粳20为三个积温带作为对照；

图7为10种材料的改良品种Hd2、Hd4和Hd5基因序列突变类型；

图8为部分品种改良前后株型差异变化图。

具体实施方式

通过以下试验验证本发明的效果：

(1)基因编辑载体的构建

定向选择抽穗期基因Hd2、Hd4及Hd5，利用CRISPRPrimer Designer x86软件设计Cas9敲除载体所用打靶引物为：

U3-Hd2-1-LP ggcATTGATAGCGATGACTCCACC

U3-Hd2-1-RP aaacGGTGGAGTCATCGCTATCAA

U6c-Hd2-2-LP tcaGCATACATGCAGTGACGAAGC

U6c-Hd2-2-RP aaacGCTTCGTCACTGCATGTATG

U6a-Hd4-1-LP gccGGAGAAGGATGTGGCCTGTG

U6a-Hd4-1-RP aaacCACAGGCCACATCCTTCTC

U3-Hd4-2-LP ggcAACTGGAACTCGTGCACCGG

U3-Hd4-2-RP aaacCCGGTGCACGAGTTCCAGT

U6b-Hd5-LP gttGTCGCCGGACTCGTTGTCCAA

U6b-Hd5-RP aaacTTGGACAACGAGTCCGGCGA)，

其中，U3-Hd2-1-LP、U3-Hd2-1-RP、U6c-Hd2-2-LP和U6c-Hd2-2-RP作为抽穗期基因Hd2的引物，U6a-Hd4-1-LP、U6a-Hd4-1-RP、U3-Hd4-2-LP和U3-Hd4-2-RP作为抽穗期基因Hd4的引物，U6b-Hd5-LP和U6b-Hd5-RP作为抽穗期基因Hd5的引物。

订购各基因的打靶引物，载体构建步骤如下：

ⅰ将100μM上下游引物各取1μL加入到98μL的0.5×TE溶液中，90℃热激30s，形成打靶接头；

ⅱgRNA表达盒连接反应：取pYL-U3(pYL-U6a～c)载体采用边切边连的方式，配制体系：

1μL 10×T4DNA ligase buffer

1μL pYL-U3-gRNA(pYL-U6a～c-gRNA)载体(10ng/μL)

1μL 接头(最终浓度0.1μM)

35U T4DNA连接酶(0.1μL)

5U BsaⅠ限制性内切酶

加 ddH₂O至10μL

PCR仪程序采用：37℃5min，20℃5min，5个循环将靶点接头连接到相应的启动子载体中；

通过巢式PCR将上述PCR片段连接入CRSPR/Cas9载体骨架上：

ⅲ第一轮PCR扩增

(U-F:5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3；

gRNA-R:5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3)

取2μL连接产物为模板，15μL PCR体系，使用引物U-F和gRNA-R各0.2μM，PrimerSTAR GXL高保真PCR酶扩增；

PCR程序：98℃2min，25循环：98℃10s，60℃10s，72℃20s，72℃5min；

ⅳ第二轮PCR扩增

B1’:5-TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

B2:5-AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3

B2’:5-TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

B3:5-AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3

B3’:5-TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

B4:5-AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3

B4’:5-TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

B5:5-AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3

B5’:5-TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3

BL:5-AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3，

取第一轮PCR产物1μL用H₂O稀释20倍，取1μL为模板，使用定位引物Bn和Bn’0.15μM，PrimerSTAR GXL高保真PCR酶扩增；

PCR程序：98℃2min，25循环：98℃10s，60℃10s，72℃30s，72℃5min；

ⅴ连接

用1％琼脂糖电泳检测扩增产物，回收各产物条带，注：各种启动子gRNA表达盒的长度为U3-gRNA＝564bp(534bp)；U6a-gRNA＝629bp(599bp)；U6b-gRNA＝515bp(485bp)；U6c-gRNA＝924bp(984bp)，其中，上述括号内的片段大小为BsaI切后的片段；计算填加量大约为20-70ng加入约40-60ng未切割的pYLCRISPR/Cas9-M T质粒(预先稀释成约100ng/l冷冻保存)，在15μL反应用10U BsaI 37℃酶切15min，再加1.5μL 10×DNAligase buffer，和35U T4ligase。

PCR仪设定程序：15循环:37℃5min；10℃5min，20℃5min。

其中，酶切体系为，酶切体系中的PCR获得的片段为巢式PCR获得的上述片段：

其中，连接体系为在上述酶切体系基础上加入连接酶以及缓冲液，酶切体系中的所加入的物质仍保留，继续进行下步的连接反应，连接体系具体为：

所述的PCR程序：15循环:37℃5min；10℃5min，20℃5min。

ⅵ取所有连接产物转化TransT1感受态，对单克隆进行PCR鉴定，随后提取质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒转化至农杆菌EHA105，用于水稻遗传转化。

(2)水稻遗传转化

ⅰ水稻种子去壳，用次氯酸钠灭菌，平铺到诱导培养基诱导愈伤两周，愈伤继代培养一次，大约一周长出黄色的愈伤颗粒；

ⅱ用LB+利福平(50mg/L)+抗生素培养农杆菌至OD₆₀₀为0.5左右；

ⅲ取500μL菌液5000g离心5min，去上清，在50mL离心管中用15mL共培培养基+100μmol/L乙酰丁香酮(AS)重悬菌液，挑选颗粒愈伤加入到此浸染液中，放置3-5min；

ⅳ倒掉浸染液体，将愈伤组织平铺在滤纸晾2min，接到铺有一层无菌滤纸的共培培养基上，黑暗条件25℃培养3天；

ⅴ三天后将愈伤收集到50mL离心管中，先用灭菌蒸馏水洗3遍，每次10min，再用含有50mg/L的羧苄的灭菌水洗3遍，每次10min，洗液清亮即可，将愈伤在无菌滤纸晾干，接到恢复培养基；

ⅵ浸染愈伤恢复培养7天后，将其接到筛选培养基；

ⅶ25-30天之后，在筛选培养基中挑选抗性愈伤接到分化培养基；

ⅷ待分化培养基中长出小苗生根，即可开盖炼苗，取长至三叶真叶期的待测品种叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA；

(3)转基因植株的后代鉴定

ⅰ以提取的50ng基因组DNA为模板，以Hd2、Hd4和Hd5的鉴定引物

Sequencing-Hd2-F:5-AACCGCTCATCACAAC-3

Sequencing-Hd2-R:5-GGTAGAAGGAGGAAAGA-3

Sequencing-Hd4-F:5-AAGTGACCTCACCTGCTA-3

Sequencing-Hd4-R:5-CGGTGTTCCTCCTGAA-3

Sequencing-Hd5-F:5-TCCTCACCTCCTTTCCT-3

Sequencing-Hd5-R:5-GATGGTCTTCCGCTTCT-3，

采用购买自TransStart公司的HiFi酶进行扩增:

PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃降落退火30s，72℃延伸20s，共35个循环，再72℃延伸10min；

ⅱ取上述PCR的产物约8μL，从公司测序，用在线软件Degenerate Sequence Decoding(DSD)method(http://dsdecode.scgene.com)进行序列分析，分析结果显示序列中在PAM位置前第4个碱基位置开始，存在碱基缺失、插入或替换的突变类型，即证明这株植株的靶基因失去功能，成功做到基因敲除；

ⅲ统计T0代植株突变类型，据此对T1代设计HRM巢式引物，

第一轮PCR引物与具体实施方式一中第3部分引物相同，用购买自TransStart公司的EasyTaq酶进行扩增，PCR反应体系与具体实施方式一中第3部分相同，程序设定如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸20s，共16个循环，再72℃延伸10min，第二轮PCR以第一轮PCR样品稀释100倍为模板，采用不同突变类型的内侧引物：

Hd2-1-HRM-F：5-AGTTGATAGCGATGAC-3

Hd2-1-HRM-R:5-GGCACTGACCACCTGC-3

Hd2-2-HRM-F：5-AGGTGGTCAGTGCCCT-3

Hd2-2-HRM-R：5-TCATACATGCAGTGAC-3

Hd4-1-HRM-F：5-TATCGGAGAAGTATGTGGC-3

Hd4-1-HRM-R：5-TAACAGCCGCCATTGTCGGC-3

Hd4-2-HRM-F：5-ATATCGGCGCCCTGGCGCCA-3

Hd4-2-HRM-R：5-TTAAGAACTAGAACTCGT-3

Hd5-HRM-F：5-TACGGTGGGCATCCCGCC-3

Hd5-HRM-R：5-TCGCCGGACTCGTTGT-3，

用EasyTaq酶进行扩增同时在反应体系中加入1.4-1.5μL的20×EvaGreen(EvaGreen最终浓度为0.25-0.28x)，

PCR反应条件如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，共16个循环，再72℃延伸10min，将二轮产物放入LightScanner做HRM检测，Start Temp设为65℃，End Temp设为98℃；

ⅳ选取纯合类型的T2代材料，将每种突变材料种植成一行，同时种植亲本材料，统计二者抽穗期及其他农艺性状并拍照，如图7所示，以松粳9、龙稻5和龙粳20三种材料为东北三个积温带材料的对照组，统计各亲本材料抽穗期的同时，记录了各改良材料的抽穗期，每种材料抽穗期至少提前5天，例如松粳19甚至可以从第一积温带北移至第三季温带，而针对三种在北方不抽穗的材料，改良品种可以种植在第一、二积温带正常收获种子，这充分说明本发明成功完成了水稻品种的改良。

序列表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>一种水稻抽穗期基因载体的应用

<160>38

<210> 1

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> U3-Hd2-1-LP。

<400> 1

ggcATTGATAGCGATGACTCCACC 24

<210>2

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> U3-Hd2-1-RP。

<400> 2

aaacGGTGGAGTCATCGCTATCAA 24

<210>3

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> U6c-Hd2-2-LP。

<400> 3

tcaGCATACATGCAGTGACGAAGC 24

<210>4

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> U6c-Hd2-2-RP。

<400> 4

aaacGCTTCGTCACTGCATGTATG 24

<210>5

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>U6a-Hd4-1-LP。

<400> 5

gccGGAGAAGGATGTGGCCTGTG 23

<210>6

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>U6a-Hd4-1-RP。

<400> 6

aaacCACAGGCCACATCCTTCTC 23

<210>7

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>U3-Hd4-2-LP。

<400> 7

ggcAACTGGAACTCGTGCACCGG 23

<210>8

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>U3-Hd4-2-RP。

<400> 8

aaacCCGGTGCACGAGTTCCAGT 23

<210>9

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>U6b-Hd5-LP。

<400> 9

gttGTCGCCGGACTCGTTGTCCAA 24

<210>10

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>U6b-Hd5-RP。

<400> 10

aaacTTGGACAACGAGTCCGGCGA 24

<210>11

<211>38

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B1’。

<400> 11

TTCAGAggtctcTctcgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG 38

<210>12

<211>37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B2。

<400> 12

AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC 37

<210>13

<211>38

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B2’。

<400> 13

TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG 38

<210>14

<211>37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B3。

<400> 14

AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCCAAGCTC 37

<210>15

<211>38

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B3’。

<400> 15

TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG 38

<210>16

<211>37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B4。

<400> 16

AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC 37

<210>17

<211>38

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B4’。

<400> 17

TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG 38

<210>18

<211>37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B5。

<400> 18

AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC 37

<210>19

<211>38

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>B5’。

<400> 19

TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG 38

<210>20

<211>37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>BL。

<400> 20

AGCGTGggtctcGaccgGGTCCATCCACTCCAAGCTC 37

<210>21

<211>22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>U-F。

<400> 21

CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG 22

<210>22

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>U-F。

<400> 22

CGGAGGAAAATTCCATCCAC 20

<210>23

<211>16

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sequencing-Hd2-F。

<400> 23

AACCGCTCATCACAAC 16

<210>24

<211>17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sequencing-Hd2-R。

<400> 24

GGTAGAAGGAGGAAAGA 17

<210>25

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sequencing-Hd4-F。

<400> 25

AAGTGACCTCACCTGCTA 18

<210>26

<211>16

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sequencing-Hd4-R。

<400> 26

CGGTGTTCCTCCTGAA 16

<210>27

<211>17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sequencing-Hd5-F。

<400> 27

TCCTCACCTCCTTTCCT 17

<210>28

<211>17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Sequencing-Hd5-R。

<400> 28

GATGGTCTTCCGCTTCT 17

<210>29

<211>16

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd2-1-HRM-F。

<400> 29

AGTTGATAGCGATGAC 16

<210>30

<211>16

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd2-1-HRM-R。

<400> 30

GGCACTGACCACCTGC 16

<210>31

<211>16

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd2-2-HRM-F。

<400> 31

AGGTGGTCAGTGCCCT 16

<210>32

<211>16

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd2-2-HRM-R。

<400> 32

TCATACATGCAGTGAC 16

<210>33

<211>19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd4-1-HRM-F。

<400> 33

TATCGGAGAAGTATGTGGC 19

<210>34

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd4-1-HRM-R。

<400> 34

TAACAGCCGCCATTGTCGGC 20

<210>35

<211>20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd4-2-HRM-F。

<400> 35

ATATCGGCGCCCTGGCGCCA 20

<210>36

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd4-2-HRM-R。

<400> 36

TTAAGAACTAGAACTCGT 18

<210>37

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd5-HRM-F。

<400> 37

TACGGTGGGCATCCCGCC 18

<210>38

<211>16

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Hd5-HRM-F。

<400> 38

TCGCCGGACTCGTTGT 16