IL-2组合物及其使用方法与流程

il
‑
2组合物及其使用方法
1.对相关申请的交叉引用
2.本技术根据35 u.s.c.
§
119(e)要求于2019年5月24日提交的美国临时申请号62/852,768的优先权，通过引用将其全部内容并入。
3.关于序列表的声明
4.与本技术相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称是prva_002_01wo_st25.txt。文本文件约464kb，创建于2020年5月18日，正通过efs
‑
web以电子方式提交。
5.背景
技术领域
6.本公开涉及包含至少两条独立多肽链的可活化前蛋白，第一条包含与掩蔽部分融合的il
‑
2，第二条包含与掩蔽部分融合的il
‑
2结合蛋白，以及相关的药物组合物及其使用方法。
7.相关技术说明
8.白细胞介素2(il
‑
2)免疫疗法已被证明可用于治疗癌症(例如恶性黑色素瘤和肾细胞癌)以及慢性感染(例如hiv感染)。
9.然而，大多数il
‑
2疗法都存在某些问题。例如，当前形式的il
‑
2疗法循环半衰期很短，并且主要扩增免疫抑制性调节t细胞或t
reg
(参见，例如，arenas
‑
ramirez等人，trends in immunology.36:763
‑
777,2015)。此外，il
‑
2疗法的作用主要是全身性的，而不是局限于靶组织，导致许多严重的副作用，如呼吸问题、恶心、低血压、食欲不振、意识模糊、严重感染、癫痫发作、过敏反应、心脏问题、肾功能衰竭和血管渗漏综合征。尽管如此，il
‑
2疗法可以是有效的，并且在本领域中存在克服这些和其他缺点的未满足的需要。
10.本公开的实施方案通过提供包含il
‑
2的可活化前蛋白来解决这些问题以及更多问题，该前蛋白可以在疾病组织例如癌组织或肿瘤内被活化。
11.发明概述
12.本公开的实施方案包括可活化的前蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽包含第一掩蔽部分和il
‑
2蛋白，其中第一掩蔽部分包含第一结合部分和与il
‑
2蛋白融合的第一接头，其中第二多肽包含第二掩蔽部分和il
‑
2结合蛋白，其中第二掩蔽部分包含第二结合部分和与il
‑
2结合蛋白融合的第二接头，其中第一和第二掩蔽部分通过它们各自的第一和第二结合部分结合在一起，任选地作为二聚体，从而掩蔽il
‑
2蛋白的结合位点，所述结合位点与存在于免疫细胞表面的il
‑
2rβ/γc链结合(在体外或体内)，并且其中第一接头或第二接头中的至少一个是可切割接头。
13.在一些实施方案中，il
‑
2蛋白包含、由或基本上由与选自表s1或与seq id no:1(全长野生型人il
‑
2)的氨基酸21
‑
153的序列具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成，任选包含c145x(x是任何氨基酸)或c145s取代(如seq id no:1所定义)。在一些实施方案中，il
‑
2蛋白包含、由或基本上由与seq id no:2(具有c125s取代的成熟人
il
‑
2)具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成，任选地其中il
‑
2蛋白保留s125残基(如seq id no:2所定义)。在一些实施方案中，il
‑
2蛋白包含一个或多个取代，其选自k35c、r38c、t41c、f42c、e61c和v69c(如seq id no:2所定义)。在一些实施方案中，il
‑
2蛋白与il
‑
2结合蛋白形成二硫键，任选地通过权利要求4中的一种或多种半胱氨酸和il
‑
2结合蛋白中的一种或多种半胱氨酸。在一些实施方案中，il
‑
2蛋白在位置69、74或128处包含一个或多个氨基酸取代(如seq id no:2所定义)，任选地其中所述一个或多个氨基酸取代选自v69a、q74p和i128t(如seq id no:2所定义)。在一些实施方案中，il
‑
2蛋白在r38、f42、y45、e62、e68和/或l72位置处包含一个或多个氨基酸取代(如seqidno:2所定义)，任选地，其中一个或多个氨基酸取代选自r38a和r38k；f42a、f42g、f42s、f42t、f42q、f42e、f42n、f42d、f42r、f42k和f42i；y45a、y45g、y45s、y45t、y45q、y45e、y45n、y45d、y45r和y45k；e62a和e62l；e68a和e68v；和l72a、l72g、l72s、l72t、l72q、l72e、l72n、l72d、l72r和l72k，包括其组合，可选地选自f42a、y45a和l72g的组合；r38k、f42q、y45n、e62l和e68v；r38k、f42q、y45e和e68v；r38a、f42i、y45n、e62l和e68v；r38k、f42k、y45r、e62l和e68v；r38k、f42i、y45e和e68v；和r38a、f42a、y45a和e62a。在一些实施方案中，il
‑
2蛋白包含、由或基本上由与seqidno:3(成熟人il
‑
2“d10”变体)具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成，任选地其中il
‑
2蛋白保留如seq id no:3所定义的q74h、l80f、r81d、l85v、i86v和/或i92f取代中的任何一个或多个。
14.在一些实施方案中，il
‑
2结合蛋白是il
‑
2rα蛋白，或特异性结合il
‑
2蛋白的抗体或其抗原结合片段，任选地双特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，il
‑
2rα蛋白包含、由或基本上由与选自表s2的序列或与seq id no:4(全长野生型人il
‑
2rα)的氨基酸22
‑
187的序列具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，il
‑
2rα蛋白包含一个或多个选自如seq id no:6(人il
‑
2rαsushi 1到sushi 2结构域)所定义的d4c、d6c、n27c、k38c、s39c、l42c、y43c、i118c、和h120c的半胱氨酸取代。在一些实施方案中，il
‑
2rα蛋白与il
‑
2蛋白形成二硫键，任选地通过权利要求11中的一种或多种半胱氨酸和il
‑
2蛋白中的一种或多种半胱氨酸，任选地权利要求4中的一种或多种半胱氨酸，任选地一个或多个半胱氨酸对选自il2
‑
k35c和il2rα
‑
d4c、il2
‑
r38c和il2rα
‑
d6c、il2
‑
r38c和il2rα
‑
h120c、il2
‑
t41c
‑
il2rα
‑
i118c、il2
‑
f42c和il2rα
‑
n27c、il2
‑
e61c和il2rα
‑
k38c、il2
‑
e61c和il2rα
‑
s39c,和il2
‑
v69c和il2rα
‑
l42c，其中il
‑
2蛋白和il
‑
2rα蛋白之间的二硫键结合掩蔽了il
‑
2蛋白的结合位点，其优先结合t
reg
上表达的il
‑
2rαβγ链。在一些实施方案中，il
‑
2rα蛋白在如seq id no:6所定义的位置49和/或68处包含丙氨酸取代。
15.在一些实施方案中，特异性结合il
‑
2蛋白的抗体或其抗原结合片段选自完整抗体、fab、fab'、f(ab')2、单特异性fab2、双特异性fab2、fv、单链fv(scfv)、scfv
‑
fc、纳米抗体、双抗体、骆驼抗体(camelid)和微型抗体(minibody)中的一种或多种，任选地其中所述抗体是nara1或其抗原结合片段。
16.在一些实施方案中，第一掩蔽部分和/或第二掩蔽部分不结合il
‑
2蛋白或il
‑
2结合蛋白。在一些实施方案中，第一掩蔽部分和/或第二掩蔽部分结合il
‑
2蛋白。
17.在一些实施方案中，第一和第二结合部分通过一个至少一个非共价键结合在一起，任选地二聚化。在一些实施方案中，第一和第二结合部分通过一个至少一个共价键结合
在一起，任选地二聚化。在一些实施方案中，至少一个共价键包含至少一个二硫键。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分选自表m1。在一些实施方案中，第一结合部分和/或第二结合部分包含免疫球蛋白的抗原结合结构域，包括其抗原结合片段和变体。在一些实施方案中，第一结合部分和/或第二结合部分包含免疫球蛋白的ch1、ch2、ch3、ch1ch3、ch2ch3、ch1ch2ch3和/或cl结构域，包括其片段和变体。在一些实施方案中，第一结合部分和/或第二结合部分在n
‑
至c
‑
末端方向包含：(1)免疫球蛋白的抗原结合结构域，包括其抗原结合片段和变体；(2)免疫球蛋白的ch1、ch2、ch3、ch1ch3、ch2ch3、ch1ch2ch3和/或cl结构域，包括其片段和变体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含免疫球蛋白的vh或vl域，包括其抗原结合片段和变体。在一些实施方案中，第一结合部分和/或第二结合部分不结合抗原。在一些实施方案中，第一结合部分包含免疫球蛋白的vl和cl结构域，并且其中第二结合部分包含免疫球蛋白的vh和ch1结构域。在一些实施方案中，第一结合部分包含免疫球蛋白的vh和ch1结构域，并且其中第二结合部分包含免疫球蛋白的vl和cl结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白来自选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igd、ige和igm的免疫球蛋白类别。在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分各自包含亮氨酸拉链肽。在一些实施方案中，第一和第二掩蔽部分通过其各自的第一和第二结合部分结合在一起作为异源二聚体。在一些实施方案中，第一和第二掩蔽部分通过其各自的第一和第二结合部分结合在一起作为同源二聚体，任选地其中第一和第二结合部分中的每一个包含ch2结构域和ch3结构域。
18.在一些实施方案中，可切割接头包含蛋白酶切割位点，任选地其中可切割接头选自表s4。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点可被选自金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶中的一种或多种的蛋白酶切割。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点被选自以下中的一种或多种的蛋白酶切割：mmp1、mmp2、mmp3、mmp4、mmp5、mmp6、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、tev蛋白酶、matriptase、upa、fap、legumain、psa、激肽释放酶、组织蛋白酶a和组织蛋白酶b。在一些实施方案中，第一接头和/或第二接头长度为约1
‑
50、1
‑
40、1
‑
30、1
‑
20、1
‑
10、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3个氨基酸，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16,17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个氨基酸。在一些实施方案中，第一接头是可切割接头，并且其中第二接头是不可切割接头。在一些实施方案中，第一接头的切割，任选蛋白酶切割，从可活化的前蛋白释放第一掩蔽部分，从而掩蔽il
‑
2蛋白的结合位点，所述结合位点与存在于免疫细胞表面的il
‑
2rβ/γc链结合(在体外或体内)。在一些实施方案中，第一接头是不可切割接头，并且其中第二接头是可切割接头。在一些实施方案中，第二接头的切割，任选蛋白酶切割，从可活化的前蛋白释放第二掩蔽部分，从而掩蔽il
‑
2蛋白的结合位点，所述结合位点与存在于免疫细胞表面的il
‑
2rβ/γc链结合(在体外或体内)。在一些实施方案中，免疫细胞选自t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
19.在一些实施方案中，第一多肽进一步包含在第一掩蔽部分的游离末端的蛋白结构域a和/或在il
‑
2蛋白的游离末端的蛋白结构域b。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含位于第二掩蔽部分的游离末端的蛋白结构域c和/或位于il
‑
2结合蛋白的游离末端的蛋白结构域d。在一些实施方案中，蛋白质结构域a
‑
d相同或不同，并且任选地选自细胞受体靶向
部分、任选地双特异性靶向部分、抗原结合结构域、任选地双特异性抗原结合结构域、细胞膜受体胞外结构域(ecd)中的一种或多种、fc结构域、人血清白蛋白(hsa)、fc结合结构域、hsa结合结构域、细胞因子、趋化因子和可溶性蛋白配体。
20.在一些实施方案中，第一多肽以n
‑
至c
‑
末端方向包含第一掩蔽部分和il
‑
2蛋白。在一些实施方案中，第一多肽以n
‑
至c
‑
末端方向包含il
‑
2蛋白和第一掩蔽部分。在一些实施方案中，第二多肽以n
‑
至c
‑
末端方向包含第二掩蔽部分和il
‑
2结合蛋白。在一些实施方案中，第二多肽以n
‑
至c
‑
末端方向包含il
‑
2结合蛋白和第二掩蔽部分。
21.在一些实施方案中，第一多肽包含、由或基本上由与seq id no:9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、233、235、237、239、241、243或245具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成，其中第二多肽分别包含、由或基本上由与seq id no:85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、234、236、238、240、242、244或246具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成。
22.在特定实施方案中，例如，包含额外结构域例如免疫球蛋白抗原结合结构域，例如轻链可变区和/或重链可变区(参见例如图9a
‑
9b)的可活化前蛋白，第一多肽包含、由或基本上由与seqidno:247、250、253、256、259或262具有至少80、85、90、95、98或100％同一性同的氨基酸序列组成，第二多肽分别包含、由或基本上由与seqidno:248、251、254、257或263具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成，以及第三和/或第四多肽分别包含、由或基本上由与seqidno:249、252、255、258、261或264具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成。在特定的实施方案中，额外的结构域包含轻链可变区和/或重链可变区，其特异性结合目的抗原，例如成纤维细胞活化蛋白(fap)。
23.还包括编码本文所述的可活化前蛋白的重组核酸分子，例如，其中第一多肽和第二多肽编码在相同或分开的重组核酸分子上。
24.还包括包含本文所述的重组核酸分子的载体，例如，其中第一多肽和第二多肽编码在相同或分开的重组核酸分子或载体上。还包括包含本文所述的重组核酸分子或载体的宿主细胞。
25.具体实施方案包括产生可活化前蛋白的方法，包括在适合可活化前蛋白表达的培养条件下培养本文所述的宿主细胞，并从培养物中分离可活化前蛋白。
26.某些实施方案包括药物组合物，其包含至少一种本文所述的可活化前蛋白和药学上可接受的载体。
27.一些实施方案包括治疗受试者疾病的方法，和/或增强受试者免疫应答的方法，包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物或至少一种本文所述的可活化前蛋白。在一些实施方案中，疾病选自癌症、病毒感染和免疫紊乱中的一种或多种。在一些实施方案中，癌症是原发性癌症或转移性癌症，并且选自黑色素瘤(任选地转移性黑色素瘤)、肾癌(任选地肾细胞癌)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、间皮瘤、白血病(任选地淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性髓性白血病或复发急性髓性白血病)、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、b
‑
细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原始神经外胚层肿瘤(髓母细胞瘤)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、
睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。
28.在一些实施方案中，施用后，可活化的前蛋白通过细胞或组织(任选地癌细胞或癌组织)中的蛋白酶切割被活化，其释放包含蛋白酶切割位点的掩蔽部分，暴露il
‑
2蛋白的结合位点，所述结合位点与存在于免疫细胞表面的il
‑
2rβ/γc链结合(在体外或体内)，从而产生活化的蛋白。在一些实施方案中，活化的蛋白通过il
‑
2蛋白与存在于免疫细胞表面的il
‑
2rβ/γc链结合(在体外或体内)。在一些实施方案中，免疫细胞选自t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，活化蛋白中il
‑
2蛋白和il
‑
2结合蛋白之间的结合(可选地，il
‑
2蛋白和il
‑
2rα蛋白之间的二硫键结合)掩蔽了il
‑
2蛋白的结合位点(其与t
reg
上表达的il
‑
2rα/β/γc链结合)，从而干扰活化蛋白与t
reg
的结合。
29.在一些实施方案中，可活化前蛋白的施用和活化使受试者的免疫应答相对于对照增加约或至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000％或更多，任选地其中免疫应答是抗癌或抗病毒免疫应答。在一些实施方案中，可活化前蛋白的施用和活化使受试者中的细胞杀伤相对于对照增加约或至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000％或更多，任选地其中细胞杀伤是癌细胞杀伤或病毒感染细胞杀伤。
30.在一些实施方案中，病毒感染选自人类免疫缺陷病毒(hiv)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、杯状病毒相关腹泻、轮状病毒腹泻、乙型流感嗜血杆菌肺炎和侵袭性疾病、流感、麻疹、腮腺炎、风疹、副流感相关肺炎、呼吸道合胞病毒(rsv)肺炎、严重急性呼吸系统综合症(sars)、人乳头瘤病毒、单纯疱疹2型生殖器溃疡、登革热、日本脑炎、蜱传脑炎、西尼罗河病毒相关疾病、黄热病、爱泼斯坦
‑
巴尔病毒、拉沙热、克里米亚
‑
刚果出血热、埃博拉出血热、马尔堡出血热、狂犬病、裂谷热、天花、上呼吸道和下呼吸道感染和脊髓灰质炎，任选其中受试者是hiv阳性。
31.在一些实施方案中，免疫病症选自1型糖尿病、血管炎和免疫缺陷中的一种或多种。
32.在一些实施方案中，药物组合物通过肠胃外施用而施用于受试者。在一些实施方案中，肠胃外施用是静脉内施用。
33.某些实施方案包括本文所述的药物组合物在制备用于治疗受试者的疾病和/或增强受试者的免疫应答的药物中的用途。一些实施方案包括本文所述的药物组合物，其用于治疗受试者的疾病，和/或用于增强受试者的免疫应答。
34.附图的简要说明
35.图1a显示了人白介素2(il
‑
2)和人白介素2的蛋白质拓扑结构受体α链(il
‑
2rα)，图1b显示了il
‑
2与其受体il
‑
2rα(cd25)、il
‑
2rβ(cd122)和共同γ链(cd132)(pdb:2erj)复合的四级结构。
36.图2a说明了il
‑
2rα的n
‑
末端与掩蔽部分的c
‑
末端的融合，以及il
‑
2的n
‑
末端与掩蔽部分的c
‑
末端的融合。融合蛋白中il
‑
2与其信号传导il
‑
2rβ/γc受体的相互作用位点显示在il
‑
2rβ/γc相互作用界面。图2b说明了图2a中描述的融合结构的示意图。由于掩蔽部分导致的空间位阻，该融合蛋白中的il
‑
2不能与il
‑
2rβ/γc受体结合并通过其发出信号。图2c说明了图2a和2b中描述的蛋白质的蛋白质序列基序和配置的示意图。图2d说明了异源
二聚体融合结构的图解，具有位于第一多肽上il
‑
2的c末端的蛋白结构域、位于第一掩蔽部分n末端的蛋白结构域、位于第二多肽上il
‑
2结合蛋白(例如，il
‑
2rα)的c末端的蛋白结构域，以及位于第二掩蔽部分n末端的蛋白结构域。图2e显示了il
‑
2(或变体)和il
‑
2rα(或变体)之间的二硫键以形成紧密的il
‑
2/il
‑
2rα复合物。图2f说明il
‑
2rα(或变体)的n
‑
末端与掩蔽部分的c
‑
末端的融合以及il
‑
2(或变体)的n
‑
末端与掩蔽部分的c
‑
末端的融合。
37.图2g显示了可活化前蛋白(或前药)活化的示意图，其具有掩蔽部分，通过蛋白酶切割融合多肽中的底物接头序列。显示了接头1的蛋白酶底物序列的实例。接头中蛋白酶底物序列的消化释放了掩蔽部分施加的空间位阻，从而允许融合中的il
‑
2与il2rβ/γc受体结合并通过其发出信号。
38.图2h显示了可活化前蛋白(或前药)活化的示意图，其具有掩蔽部分以及在il
‑
2(或变体)和il
‑
2rα(或变体)之间的二硫键，通过蛋白酶切割融合多肽中的底物接头序列。显示了接头1的蛋白酶底物序列的实例。接头中蛋白酶底物序列的消化释放了掩蔽部分施加的空间位阻，从而允许融合中的il
‑
2与il2rβ/γc受体结合并通过其发出信号。
39.图2i显示了可活化前蛋白(或前药)活化的示意图，其具有掩蔽部分，通过蛋白酶切割融合多肽中的底物接头序列。显示了接头2的蛋白酶底物序列的实例。接头中蛋白酶底物序列的消化释放了掩蔽部分施加的空间位阻，从而允许融合中的il
‑
2与il2rβ/γc受体结合并通过其发出信号。
40.图2j显示了可活化前蛋白(或前药)活化的示意图，其具有掩蔽部分以及在il
‑
2(或变体)和il
‑
2rα(或变体)之间的二硫键，通过蛋白酶切割融合多肽中的底物接头序列。显示了接头2的蛋白酶底物序列的实例。接头中蛋白酶底物序列的消化释放了掩蔽部分施加的空间位阻，从而允许融合中的il
‑
2与il2rβ/γc受体结合并通过其发出信号。
41.图3a
‑
3b显示了在示例性可活化前蛋白中vh
‑
ch1和vl
‑
cl作为掩蔽部分的实例。图3a显示了il
‑
2rα在vh
‑
ch1的c
‑
末端的融合和il
‑
2在vl
‑
cl的c
‑
末端的融合。图3b显示了il
‑
2rα在vl
‑
cl的c
‑
末端的融合和il
‑
2在vh
‑
ch1的c
‑
末端的融合。图3c显示了图3a所述的可活化前蛋白的活化的示意图，图3d显示了图3b所述的可活化前蛋白融合蛋白的活化的示意图。
42.图4a
‑
4c显示了纯化和切割的蛋白质的sds
‑
page结果。图4a显示了非还原性sds
‑
page结果，图4b显示了还原性sds
‑
page结果。图4c说明了蛋白酶(tev)对il
‑
2融合蛋白的切割。“m”代表蛋白质标准标记物(marker)，“1”代表tev切割前的蛋白质，“2”代表tev切割后的蛋白质。
43.图5a
‑
5e说明了纯化的蛋白质的代表性hplc分析结果。
44.图6a
‑
6r说明了il
‑
2融合蛋白对m
‑
07e增殖的活性，由比色测定法(细胞计数试剂盒
‑
8(cck
‑
8))测定。
45.图7a
‑
7b说明了纯化的蛋白质的sds
‑
page结果。图7c说明了蛋白酶(tev)对il
‑
2融合蛋白的切割。图中“m”代表蛋白质标准标记物。图中“1”代表tev切割前的蛋白质，“2”代表tev切割后的蛋白质。图7d说明了纯化蛋白质的hplc分析结果。
46.图8a说明了切割的和未切割的p16121613对m
‑
07e增殖的活性，由比色测定法(细胞计数试剂盒
‑
8(cck
‑
8))测定。图8b显示了切割和未切割的p16121613与p13591366对m
‑
07e增殖的活性比较，由比色测定法(细胞计数试剂盒
‑
8(cck
‑
8))测定。
47.图9a
‑
9b说明了本文所述的可活化前蛋白的各种结构，包括包含多条链的前蛋白(也参见图2d)。
48.图10a
‑
10b显示了纯化蛋白质的sds
‑
page结果。图10a显示了非还原性sds
‑
page结果，图10b显示了还原性sds
‑
page结果。“m”代表蛋白质标准标记物。
49.图10c
‑
10d显示了蛋白酶对il
‑
2融合蛋白的切割。“m”代表蛋白质标准标记物。在图10c中，“1”代表tev切割前的蛋白质，“2”代表tev切割后的蛋白质。在图10d中，“1”代表蛋白酶切割前的蛋白质，“2”代表upa切割后的蛋白质，“3”代表mmp
‑
2切割后的蛋白质，“4”代表matriptase切割后的蛋白质，“5”代表legumain切割后的蛋白质。
50.图11a
‑
11p说明了纯化蛋白质的代表性hplc分析结果。
51.图12a
‑
12p说明了il
‑
2融合蛋白对m
‑
07e增殖的活性，由比色测定法(细胞计数试剂盒
‑
8(cck
‑
8))测定。
52.发明详述
53.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的那些相似或等效的相似或等效的任何方法、材料、组合物、试剂、细胞可用于本公开的主题的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，均通过引用整体并入本文，就像每个单独的出版物或参考文献都被明确地和单独地指示为通过引用并入本文作为完整阐述。本技术要求优先权的任何专利申请也以上述对于公开和参考文献的方式通过引用整体并入本文。
54.标准技术可用于重组dna、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的或如本文所述进行。这些和相关的技术和程序通常可以根据本领域公知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所描述的。除非提供具体定义，否则与本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学相关使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域熟知和常用的那些。标准技术可用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
55.出于本公开的目的，以下术语定义如下。
[0056]“一个”和“一种”在本文中用于指代一个/种或多个/种(即至少一个/种)语法对象。例如，“一个/种元件”包括“一个/种元件”、“一个/种或多个/种元件”和/或“至少一个/种元件”。
[0057]“约”是指到参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度的变化多至30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、数量、重量或长度。
[0058]
术语“可活化的前蛋白”、“可活化的前药”、“前药”或“前蛋白”在本文中可互换使用，是指至少包含掩蔽部分和活性结构域的可活化的前蛋白，或其衍生物/变体，如本文所述。在一个实施方案中，前蛋白还可包含一个或多个蛋白结构域。
[0059]
术语“抗原”是指能够被选择性结合剂(例如抗体)结合并且另外能够用于动物以产生能够结合该抗原的表位的抗体的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多个表位。如本文所用，术语“抗原”包括能够在适当条件下诱导对该物质的免疫应答并与免疫应答的
产物反应的物质。更广泛地，术语“抗原”包括抗体结合的任何物质，或抗体预期用于的任何物质，无论该物质是否具有免疫原性。对于此类抗原，可以通过重组方法鉴定抗体，而与任何免疫应答无关。
[0060]“拮抗剂”是指干扰或以其他方式降低另一试剂或分子的生理作用的生物结构或化学试剂。在一些情况下，拮抗剂与其他药剂或分子特异性结合。包括完全拮抗剂和部分拮抗剂。
[0061]“激动剂”是指增加或增强另一种试剂或分子的生理作用的生物结构或化学试剂。在一些情况下，激动剂与其他药剂或分子特异性结合。包括完全和部分激动剂。
[0062]
如本文所用，术语“氨基酸”旨在表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括在蛋白质生物合成过程中使用的20种(l)
‑
氨基酸以及其他氨基酸，例如4
‑
羟脯氨酸、羟赖氨酸、锁链素(desmosine)、锁链素(isodesmosine)、同型半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如本领域技术人员已知的(d)
‑
氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等。氨基酸类似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修饰形式。此类修饰可包括例如取代或置换氨基酸上的化学基团和部分或通过氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包括，例如，表现出功能相似性质(例如参考氨基酸的电荷和电荷空间特征)的有机结构。例如，模拟精氨酸(arg或r)的有机结构将具有位于相似分子空间中的正电荷部分，并且具有与天然存在的arg氨基酸侧链的e
‑
氨基相同程度的迁移率。模拟物还包括约束结构以保持氨基酸或氨基酸官能团的最佳空间和电荷相互作用。本领域技术人员知道或可以确定什么结构构成功能等效的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
[0063]
如本文所用，“处于发生疾病或不良反应的风险中”的受试者可能具有或可能没有可检测的疾病或疾病症状，并且在本文所述治疗方法之前可能已经或可能没有表现出可检测的疾病或疾病症状。“处于风险中”表示受试者具有一种或多种风险因素，其是与疾病发展相关的可测量参数，如本文所述和本领域已知的。具有一种或多种这些风险因素的受试者比没有一种或多种这些风险因素的受试者具有更高的发生疾病或不良反应的可能性。
[0064]“生物相容的”是指通常不会损害细胞的生物学功能或受试者并且不会导致任何程度的不可接受的毒性(包括过敏和疾病状态)的材料或化合物。
[0065]
术语“结合”是指由于例如共价键、静电键、疏水键和离子键和/或氢键相互作用，包括诸如盐桥和水桥之类的相互作用，两个分子之间的直接结合。
[0066]“编码序列”是指有助于编码基因的多肽产物的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不直接参与编码基因的多肽产物的任何核酸序列。
[0067]
在本公开中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”、“包含”和“包含”将被理解为暗示包括所述的步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤或元素的组。
[0068]“由
……
组成”是指包括并限于“由
……
组成”之后的任何内容。因此，短语“由
……
组成”表示列出的元素是必需的或强制性的，并且不存在其他元素。“基本上由
……
组成”是指包括在该短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或有助于所列出元素的本公开中指定的活性或功能的其他元素。因此，短语“基本上由
……
组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但其他要素是可选的，并且取决于它们是否对所列要素的活性或功能产生实质性
影响而可能存在或不存在。
[0069]
术语“无内毒素”或“基本上无内毒素”通常涉及含有至多痕量(例如，对受试者没有临床不利生理影响的量)内毒素，优选不可检测量的内毒素的组合物、溶剂和/或器皿(vessel)。内毒素是与某些微生物相关的毒素，例如细菌，通常是革兰氏阴性菌，尽管内毒素可能存在于革兰氏阳性菌中，例如单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes.)。最普遍的内毒素是在各种革兰氏阴性细菌的外膜中发现的脂多糖(lps)或脂寡糖(los)，它们代表了这些细菌引起疾病的能力的核心致病特征。人体中的少量内毒素可导致发烧、降低血压、激活炎症和凝血，以及其他不利的生理影响。
[0070]
因此，在药品生产中，通常需要从药品和/或药品容器中去除大部分或全部痕量内毒素，因为即使是少量的内毒素也可对人体产生不良影响。为此可以使用去热原炉(depyrogenationoven)，因为分解大多数内毒素通常需要超过300℃的温度。例如，基于初级包装材料(如注射器或小瓶)，250℃的玻璃温度和30分钟的保持时间的组合通常足以使内毒素水平降低3个对数级。考虑了去除内毒素的其他方法，包括例如色谱法和过滤方法，如本文所述和本领域已知的。
[0071]
可以使用本领域已知的常规技术检测内毒素。例如，limulus amoebocyte lysate测定，其利用鲎(horseshoe crab)的血液，是检测内毒素存在的非常灵敏的测定。在该测定中，极低水平的lps会导致鲎裂解物发生可检测的凝固，这是由于放大该反应的强大的酶级联反应。内毒素也可以通过酶联免疫吸附试验(elisa)进行定量。为了基本上不含内毒素，内毒素水平可以小于约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10eu/mg活性化合物。通常，1ng脂多糖(lps)对应于约1
‑
10eu。
[0072]
术语“半数最大有效浓度”或“ec
50”是指如本文所述的药剂(例如，可活化的前蛋白)的浓度，在该浓度下，它在一些指定的暴露时间后诱导介于基线和最大值之间的半数应答；因此，梯度剂量反应曲线的ec
50
代表观察到其最大作用的50％时的化合物浓度。ec
50
还代表在体内获得50％最大作用所需的血浆浓度。类似地，“ec
90”是指观察到其最大作用的90％时的药剂或组合物的浓度。“ec
90”可以从“ec
50”和希尔斜率(hillslope)计算，或者可以使用本领域的常规知识直接从数据确定。在一些实施方案中，药剂(例如，可活化的前蛋白)的ec
50
小于约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200或500nm。在一些实施方案中，药剂将具有约1nm或更小的ec
50
值。
[0073]“免疫应答”是指源自免疫系统的任何免疫应答，包括来自细胞和体液、先天性和适应性免疫系统的应答。示例性细胞免疫细胞包括例如淋巴细胞、巨噬细胞、t细胞、b细胞、nk细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、单核细胞及其所有子集。细胞应答包括例如效应子功能、细胞因子释放、吞噬作用、胞吞作用、易位、运输、增殖、分化、活化、抑制、细胞
‑
细胞相互作用、细胞凋亡等。体液应答包括例如igg、igm、iga、ige、应答及其相应的效应子功能。
[0074]
药剂例如可活化前蛋白的“半衰期”可以指药剂失去其药理学、生理学或其他活性的一半所花费的时间，相对于在施用到生物体的血清或组织中时的活性，或相对于任何其他定义的时间点。“半衰期”还可以指药剂的量或浓度降低至施用到生物体的血清或组织中
的起始量的一半所需的时间，相对于在施用到生物体的血清或组织中时的活性，或相对于任何其他定义的时间点。可以在血清和/或任何一种或多种选定组织中测量半衰期。
[0075]
术语“调节”和“改变”包括“增加”、“增强”或“刺激”以及“减少”或“降低”，通常以相对于对照统计学显著或生理学显著的量或程度。“增加”、“刺激”或“增强”的量通常是“具有统计意义的”量，可包括由无组合物(例如，不存在试剂)或对照组合物产生的量的1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多倍(例如，500、1000倍)(包括所有整数和介于之间的范围例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。“减少”或“降低”的量通常是“统计上显著”的量，可包括由无组合物(例如，不存在试剂)或对照组合物产生的量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％,的减少。本文描述了比较和“统计显著”量的示例。
[0076]
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可互换使用，是指不限于任何特定长度的氨基酸聚合物。术语“酶”包括多肽或蛋白质催化剂。该术语包括修饰，例如肉豆蔻酰化、硫酸化、糖基化、磷酸化以及信号序列的添加或删除。术语“多肽”或“蛋白质”是指一条或多条氨基酸链，其中每条链包含通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可包含多条链，其非共价和/或共价连接在一起(通过肽键)，具有天然蛋白质的序列，即由天然存在的和特别是非重组细胞或基因工程或重组细胞产生的蛋白质，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。在某些实施方案中，多肽是由重组细胞产生的“重组”多肽，其包含一个或多个重组dna分子，这些分子通常由异源多核苷酸序列或多核苷酸序列的组合制成，否则将不会在细胞中发现。
[0077]
术语“多核苷酸”和“核酸”包括mrna、rna、crna、cdna和dna。该术语通常是指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核苷酸，也可以是任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的dna。术语“分离的dna”和“分离的多核苷酸”和“分离的核酸”是指已分离出不含特定物种的总基因组dna的分子。因此，编码多肽的分离的dna片段是指含有一个或多个编码序列但基本上是从获得该dna片段的物种的总基因组dna分离或纯化的dna片段。还包括不编码多肽的非编码多核苷酸(例如，引物、探针、寡核苷酸)。还包括重组载体，包括，例如，表达载体、病毒载体、质粒、粘粒、噬菌粒、噬菌体、病毒等。
[0078]
额外的编码或非编码序列可以但不必存在于本文所述的多核苷酸中，并且多核苷酸可以但不必连接至其他分子和/或支持材料。因此，多核苷酸或可表达的多核苷酸，无论编码序列本身的长度如何，都可以与其他序列例如表达控制序列组合。
[0079]
本文所指的术语“分离的”多肽或蛋白质是指主题蛋白质(1)不含至少一些通常在自然界中发现的其他蛋白质，(2)基本上不含来自相同来源例如来自相同物种的其他蛋白质，(3)通过来自不同物种的细胞表达，(4)已从至少约50％的多核苷酸、脂类、碳水化合物或其他材料(其天然与之相联)分离，(5)不与“分离的蛋白质”天然与之相联的蛋白质的部分相联(通过共价或非共价相互作用)，(6)与其天然不相联的多肽可操作地相联(通过共价或非共价相互作用)，或(7)自然界中不存在。这样的分离的蛋白质可以由基因组dna、cdna、mrna或其他rna编码，可以是合成来源，或其任何组合。在某些实施方案中，分离的蛋白质基本上不含会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或除此以外)的在其天然环境中发现的蛋白
质或多肽或其他污染物。
[0080]
在某些实施方案中，可以定义组合物中任何给定试剂(例如，可活化的前蛋白)的“纯度”。例如，某些组合物可包含试剂例如多肽试剂，其为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％纯(基于蛋白质或重量
‑
重量)，包括其间所有小数和范围，例如但绝不限于高效液相色谱法(hplc)，这是一种众所周知的柱色谱法，常用于生物化学和分析化学，用于分离、鉴定和定量化合物。
[0081]
术语“参考序列”通常是指核酸编码序列，或氨基酸序列，另一个序列正与之进行比较。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列均作为参考序列包括在内，包括按名称描述的那些以及在表和序列表中描述的那些。
[0082]
某些实施方案包括本文描述的蛋白质/多肽的生物活性“变体”和“片段”，以及编码它们的多核苷酸。“变体”包含一个或多个相对于参考多肽或多核苷酸的取代、添加、删除和/或插入(参见例如表和序列表)。变体多肽或多核苷酸包含与参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性或相似性或同源性的氨基酸或核苷酸序列，如本文所述，并基本上保留了该参考序列的活性。还包括由参考序列组成或通过添加、删除、插入或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150个或更多个氨基酸或核苷酸而与参考序列不同并基本上保留该参考序列的至少一种活性的序列。在某些实施方案中，添加或删除包括c
‑
末端和/或n
‑
末端添加和/或删除。
[0083]
如本文所用，术语“序列同一性”或例如包含“50％同一性的序列”是指序列在一个窗口的比较中在逐个核苷酸或逐个氨基酸的基础上是相同的。因此，“序列同一性百分比”可以通过在比较窗口内比较两个最佳比对序列，确定在两个序列都出现的相同核酸碱基(例如，a、t、c、g、i)或相同的氨基酸残基(例如，ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比对窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比来计算。
[0084]
用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法(gap、bestfit、fasta和tfasta，wisconsin genetics software package release 7.0,genetics computer group,575science drive madison,wis.,usa)或通过检查和最佳比对(即，在比较窗口中产生最高百分比同源性)由任何选择的各种方法生成。也可以参考blast程序家族，例如altschul等人，nucl.acids res.25:3389,1997。
[0085]
术语“溶解度”是指本文提供的试剂(例如，可活化的前蛋白)溶解在液体溶剂中并形成均匀溶液的特性。溶解度通常表示为浓度，可以通过每单位体积溶剂的溶质质量(每千克溶剂的溶质克数、g/dl(100ml)、mg/ml等)、摩尔浓度(molarity)、摩尔浓度(molality)、摩尔分数(mole fraction)或其他类似的浓度描述。每溶剂的量可溶解的最大溶质平衡量是在规定条件下该溶质在该溶剂中的溶解度，包括温度、压力、ph值和溶剂的性质。在某些实施方案中，溶解度在生理ph或其他ph下测量，例如在ph5.0、ph6.0、ph7.0、ph7.4、ph7.6、ph7.8或ph8.0(例如，约ph5
‑
8)。在某些实施方案中，在水或生理缓冲液例如pbs或nacl(有或没有napo4)中测量溶解度。在具体实施方案中，溶解度是在相对较低的ph(例如，ph6.0)
和相对较高的盐(例如，500mm nacl和10mm napo4)下测量。在某些实施方案中，溶解度是在生物流体(溶剂)例如血液或血清中测量的。在某些实施方案中，温度可以是约室温(例如，约20、21、22、23、24、25℃)或约体温(37℃)。在某些实施方案中，药剂的溶解度为至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml，在室温或在37℃。
[0086]“受试者”或“有此需要的受试者”或“患者”或“有此需要的患者”包括哺乳动物受试者例如人类受试者。
[0087]“基本上”或“实质上”是指几乎完全或完全，例如，某些给定数量的95％、96％、97％、98％、99％或更高。
[0088]“统计上显著”是指结果不太可能是偶然发生的。统计显著性可以通过本领域已知的任何方法确定。常用的显著性度量包括p
‑
值，这是在原假设为真时观察到的事件发生的频率或概率。如果得到的p
‑
值小于显著性水平，则拒绝原假设。在简单的情况下，显著性水平定义为p值为0.05或更小。
[0089]“治疗反应”是指基于施用一种或多种治疗剂的症状的改善(无论是否持续)。
[0090]
如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗剂量”、“预防有效量”或“诊断有效量”是需要在施用后引发所需的生物反应需要的药剂(例如，可活化的前蛋白、活化的蛋白质)的量。
[0091]
如本文所用，“治疗”受试者(例如哺乳动物，例如人)或细胞是用于试图改变个体或细胞的自然过程的任何类型的干预。治疗包括但不限于施用药物组合物，并且可以预防性地进行，或在病理事件开始后或与病原体接触后进行。还包括“预防性”治疗，其可以针对降低所治疗的疾病或病症的进展速度、延迟该疾病或病症的发作或降低其发作的严重性。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或病症或其相关症状。
[0092]
术语“野生型”是指最经常在群体中观察到的基因或基因产物(例如，多肽)，因此被任意设定为基因的“正常”或“野生型”形式。
[0093]
除非另有明确说明，否则本说明书中的每个实施方案都适用于所有其他实施方案。
[0094]
可活化前蛋白
[0095]
本公开的实施方案涉及可活化的前蛋白或前药，其包含以前蛋白形式保持相对无活性的il
‑
2蛋白，并且其在与合适的环境接触时可以被活化。本文所述的可活化前蛋白包含至少两个单独或不同的多肽链，它们通过非共价键和/或某些共价键，例如二硫键，但不是通过肽键或酰胺键而结合在一起。通常，至少一条多肽链包含il
‑
2蛋白，并且至少一条多肽链包含il
‑
2结合蛋白，例如il
‑
rα蛋白。每条多肽链还包含掩蔽部分，该部分与另一条链中的掩蔽部分结合并在空间上阻碍il
‑
2蛋白质与细胞上的同源受体相互作用或结合。通常，至少一个掩蔽部分包含可切割的接头，其在靶组织中切割时从可活化的前蛋白复合物释放该掩蔽部分(及其空间位阻)，并通过暴露il
‑
2蛋白的至少一个活性位点或结合位点来恢复il
‑
2活性。这允许现在活化的蛋白的il
‑
2部分与其某些同源受体相互作用或结合，例如免疫细胞上的il
‑
2rβ/γc受体链，从而影响下游免疫细胞信号通路。
[0096]
本文所述的可活化前蛋白解决了标准il
‑
2疗法的许多缺点，包括高初始血清c
max
，其会导致免疫系统过度激活，由于否则il
‑
2的小分子尺寸和/或大量表达il
‑
2受体的免疫细胞的分解代谢导致的短pk，因为短pk和/或肿瘤靶向无效在靶组织(如癌症、肿瘤)中积累
不良，以及在正常组织中不期望的积累和免疫激活。
[0097]
本公开的实施方案因此包括可活化的前蛋白(复合物)，其包含第一多肽(链)和第二多肽(链)，
[0098]
其中第一多肽包含第一掩蔽部分和il
‑
2蛋白，其中第一掩蔽部分包含第一结合部分和与il
‑
2蛋白融合的第一接头，
[0099]
其中第二多肽包含第二掩蔽部分和il
‑
2结合蛋白，其中第二掩蔽部分包含第二结合部分和与il
‑
2结合蛋白融合的第二接头，
[0100]
其中第一和第二掩蔽部分通过它们各自的第一和第二结合部分结合在一起，任选地作为二聚体，从而在体外或体内掩蔽与存在于免疫细胞表面的il
‑
2rβ/γc链结合的il
‑
2蛋白的结合位点，
[0101]
并且其中第一接头或第二接头中的至少一种是可切割接头。
[0102]
在一些实施方案中，il
‑
2蛋白和il
‑
2结合蛋白相互作用或结合在一起，例如，通过非共价键或某些共价键(例如，二硫键)。在一些情况下，il
‑
2蛋白与il
‑
2结合蛋白例如il
‑
2rα蛋白的结合在空间上阻断或阻碍il
‑
2蛋白与其同源的在调节性t细胞(t
reg
)上表达的受体链il
‑
2rα/β/γc的结合。在某些情况下，这种结合和位阻在蛋白质的活化形式中得以保留，并且可以提供最大限度地减少抑制性t
reg
的活化，以及减少前蛋白和类似活性蛋白的消耗的优势。示例性il
‑
2蛋白和il
‑
2结合蛋白在本文别处描述。
[0103]
通常，如上所述，第一和第二掩蔽部分通过一个或多个键结合在一起，例如，二聚化在一起。这样的结合通常发生在每个掩蔽部分中包含的结合部分之间，而不是接头。但是，在某些情况下，接头可以有助于两个掩蔽部分之间的结合。两个掩蔽之间的相互作用(通过它们各自的结合部分)空间掩蔽或以其他方式阻断il
‑
2蛋白与存在于免疫细胞表面上的其同源受体(例如，il
‑
2rβ/γc链)的结合(在体外或体内)，从而使可活化的前蛋白保持其相对无活性的形式。在某些情况下，接头有助于空间掩蔽或阻断掩蔽部分的活性。
[0104]
更具体地，在一些实施方案中，第一和第二掩蔽部分经由至少一个非共价键、至少一个共价键(例如，至少一个二硫键)，或非共价键和共价键的任意组合二聚化在一起。然而，通常，第一和第二掩蔽部分不结合在一起或通过肽或酰胺键二聚化。在一些实施方案中，掩蔽部分通过它们各自的结合部分结合在一起作为异源二聚体，即由两个不同结合部分组成的异源二聚体。在一些实施方案中，掩蔽部分结合在一起作为同源二聚体，即由两个相同或几乎相同的结合部分组成的同源二聚体。因此，第一和第二掩蔽部分或第一和第二结合部分可以相同(或基本相同)或不同。在大多数情况下，第一和第二掩蔽部分不与il
‑
2蛋白或il
‑
2结合蛋白结合。然而，在一些情况下，掩蔽部分的之一或两者可结合il
‑
2蛋白和/或il
‑
2结合蛋白。
[0105]
如上所述，多肽链中的至少一种(即，第一多肽或第二多肽)包含可切割的接头，例如可被蛋白酶切割的接头。在一些情况下，蛋白酶在靶组织或细胞中表达，例如癌组织或癌细胞。在这种情况下接头的切割释放了一个掩蔽部分，消除了il
‑
2蛋白的空间位阻，并允许在患病组织或细胞中选择性活化il
‑
2蛋白(相对于正常或健康的组织或细胞)。这种选择性和局部活化不仅减少了所施用的il
‑
2的不必要消耗，从而增加了其半衰期，而且还减少了il
‑
2的不良全身效应，还有其他优点。本文描述了示例性掩蔽部分，包括结合部分和接头。
[0106]
每条多肽链的各种成分可以以任何方向融合。然而，接头区通常位于il
‑
2肽和掩
蔽部分的结合部分之间，对于包含il
‑
2结合蛋白的多肽链也是如此。例如，在一些实施方案中，第一多肽按n到c末端方向包含第一掩蔽部分(定向为第一结合部分和第一接头)和il
‑
2蛋白。在一些实施方案中，第一多肽按n到c末端方向包含il
‑
2蛋白和第一掩蔽部分(定向为第一接头和第一结合部分)。在某些实施方案中，第二多肽按n
‑
至c
‑
末端方向包含第二掩蔽部分(定向为第二结合部分和第二接头)和il
‑
2结合蛋白。在特定的实施方案中，第二多肽按n
‑
到c
‑
末端方向包含il
‑
2结合蛋白和第二掩蔽部分(定向为第二接头和第二结合部分)。
[0107]
某些可活化的前蛋白仅由上述蛋白链中的两条组成，即，它们仅由第一多肽和第二多肽组成，如本文所述(参见例如图2a
‑
2j和图3a
‑
3d中的各种结构)。然而，在某些情况下，某些可活化的前蛋白包含多条链，例如，其中第一和第二多肽链形成一个“核心结构”，可以在其上构建额外的或更高级的结构，各种核心结构可选地通过额外的蛋白质结合结构域结合在一起，例如，如图9a
‑
9b所示。额外的蛋白质结合结构域的实例包括免疫球蛋白结构域，例如轻链可变区、重链可变区和/或fc区，后者任选地包含旋钮和孔结构以改善所需对之间的特异性结合(参见图9a
‑
9b)。
[0108]
本文更详细地描述了可活化前蛋白的各个组分。
[0109]
il
‑
2蛋白。本文所述的可活化前蛋白包含至少一种“il
‑
2蛋白”(或白介素
‑
2蛋白)，包括人il
‑
2蛋白。il
‑
2是一种细胞因子信号，通过il
‑
2受体(il
‑
2r)，il
‑
2r是一种由多达三条链(称为α(cd25)、β(cd122)和γ(cd132)链)组成的复合物。il
‑
2由t细胞应答抗原性或有丝分裂刺激而产生，并且是t细胞增殖和其他对免疫应答调节至关重要的活动所必需的。il
‑
2可以刺激b细胞、单核细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞、自然杀伤细胞和神经胶质瘤细胞，以及其他免疫细胞。
[0110]
il
‑
2是一种15
‑
16kda的蛋白，由信号肽(残基1
‑
20)和活性成熟蛋白(残基21
‑
153)组成。示例性人il
‑
2氨基酸序列提供于下表s1中。
[0111]
[0112]
[0113][0114]
因此，在某些实施方案中，il
‑
2蛋白包含、由或基本上由选自表s1的氨基酸序列或其活性变体或片段(其与选自表s1的序列具有至少80、85、90、95、98、或100％的同一性)组成。在一些实施方案中，“活性”il
‑
2蛋白或片段或变体的特征在于，例如，其在体外或体内结合存在于免疫细胞表面上的il
‑
2rβ/γc受体链并刺激下游信号传导活动的能力，不存在本文所述掩蔽部分所致的空间位阻。下游信号传导活动的例子包括il
‑
2介导的信号传导，其通过jak
‑
stat、pi3k/akt/mtor和mapk/erk通路中的一种或多种，包括其组合。总之，il
‑
2信号传导刺激了一系列下游通路，导致在cd4 t细胞、cd8 t细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞和肠上皮内淋巴细胞等的发育、功能和存活中起重要作用的应答。
[0115]
在特定实施方案中，il
‑
2蛋白是il
‑
2的成熟形式，或活性变体或片段，其包含、由或基本上由与seq id no:1的氨基酸21
‑
153具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，il
‑
2蛋白包含如seq id no:1所定义的c145x取代，其中x是任何氨基酸。在特定实施方案中，il
‑
2蛋白包含如seq id no:1所定义的c145s取代。
[0116]
某些il
‑
2蛋白包含、由或基本上由与seq id no:2(具有c125s取代的成熟人il
‑
2)具有至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，seq id no:2的活性变体或片段保留了s125残基，如本文所述。
[0117]
某些il
‑
2蛋白相对于表s1中的示例性氨基酸序列包含一个或多个定义的氨基酸取代。例如，一些il
‑
2蛋白包含一个或多个选自k35c、r38c、t41c、f42c、e61c和v69c的氨基酸取代(如seq id no:2定义)。在一些实施方案中，il
‑
2蛋白与il
‑
2结合蛋白(例如，il
‑
2ra)经由一个或多个选自k35c、r38c、t41c、f42c、e61c和v69c的半胱氨酸取代而形成二硫键。某些il
‑
2蛋白在69、74和/或128位置处包含一个或多个氨基酸取代，如seq id no:2所定义，包括其组合并且包括，例如，其中一个或多个氨基酸取代选自v69a，q74p和i128t，如seq id no:2所定义。一些il
‑
2蛋白在r38、f42、y45、e62、e68和/或l72位置处包含一个或多个氨基酸取代，如seq id no:2所定义，包括其组合并且包括，例如，其中一个或多个氨基酸取代选自r38a和r38k；f42a、f42g、f42s、f42t、f42q、f42e、f42n、f42d、f42r、f42k和f42i；y45a、y45g、y45s、y45t、y45q、y45e、y45n、y45d、y45r和y45k；e62a和e62l；e68a和e68v；和l72a、l72g、l72s、l72t、l72q、l72e、l72n、l72d、l72r和l72k，包括其组合。具体实例包括其中il
‑
2蛋白包含选自f42a、y45a、和l72g；r38k、f42q、y45n、e62l,和e68v；r38k、f42q、y45e,和e68v；r38a、f42i、y45n、e62l、和e68v；r38k、f42k、y45r、e62l,和e68v；r38k、f42i、y45e,和e68v；和r38a、f42a、y45a,和e62a的氨基酸取代的一个或组合。因此，il
‑
2蛋白可以包含上述氨基酸取代的任何一个或多个，包括其组合。
[0118]
前述il
‑
2蛋白的任何一种或多种可以与本文所述的任何其他组分组合，例如il
‑
2结合蛋白如il
‑
2rα蛋白、包括结合部分和接头的掩蔽部分，以及其它任选的蛋白结构域，以生成一个或更多个可活化的前蛋白或包含相同的更大的多链结构。
[0119]
il
‑
2结合蛋白。本文所述的可活化前蛋白包含至少一种“il
‑
2结合蛋白”。il
‑
2结合蛋白的实例包括il
‑
2rα蛋白，包括人il
‑
2rα蛋白，以及与本文所述的il
‑
2蛋白结合的抗体及其抗原结合片段。
[0120]
在特定实施方案中，il
‑
2结合蛋白是人il
‑
2rα蛋白，或其变体或片段(结合il
‑
2蛋白)。示例性的人il
‑
2rα氨基酸序列在下表s2中提供。
id no:6定义。因此，il
‑
2rα蛋白可包含前述氨基酸取代的任何一个或多个，包括其组合。
[0125]
在这些和相关实施方案的某些中，il
‑
2rα蛋白与il
‑
2蛋白形成至少一个二硫键(通过上述半胱氨酸的一种或多种和il
‑
2蛋白中的一种或多种半胱氨酸)。在具体实施方案中，il
‑
2rα和il
‑
2蛋白在选自il2
‑
k35c和il2rα
‑
d4c、il2
‑
r38c和il2rα
‑
d6c、il2
‑
r38c和il2rα
‑
h120c、il2
‑
t41c
‑
il2rα
‑
i118c、il2
‑
f42c和il2rα
‑
n27c、il2
‑
e61c和il2rα
‑
k38c、il2
‑
e61c和il2rα
‑
s39c，以及il2
‑
v69c和il2rα
‑
l42c的一种或多种半胱氨酸对之间形成至少一个二硫键。在具体的实施方案中，如上所述，il
‑
2蛋白和il
‑
2rα蛋白之间的结合(例如，二硫键结合)掩蔽或在空间上阻碍了优先结合il
‑
2rαβγ链(在t
reg
上表达)的il
‑
2蛋白的结合位点。在一些情况下，蛋白质的活性或活化形式(在切割至少一个接头并释放相应的掩蔽部分后)，保留了il
‑
2蛋白和il
‑
2rα蛋白之间的结合，因此不会优先结合t
reg
上表达的il
‑
2rαβγ链。
[0126]
如上所述，在某些实施方案中，il
‑
2结合蛋白包含特异性结合il
‑
2蛋白的抗体或其抗原结合片段。实例包括全抗体、fab、fab'、f(ab')2、单特异性fab2、双特异性fab2、fv、单链fv(scfv)、scfv
‑
fc、纳米抗体、双抗体、骆驼抗体(camelid)和微型抗体。在具体实施方案中，抗体是nara1或其抗原结合片段(参见，例如，arenas
‑
ramirez等人，science translational medicine.8:367ra166,2016；和美国申请号2019/0016797，通过引用并入本文)。在特定实施方案中，与上文类似，il
‑
2蛋白与抗il
‑
2抗体(或其抗原结合片段)之间的结合(例如，二硫键结合)掩蔽或空间阻碍il
‑
2蛋白的结合位点(其优先结合在t
reg
上表达的il
‑
2rαβγ链)。在某些情况下，蛋白质的活性或活化形式，在切割至少一个接头并释放相应的掩蔽部分之后，保留了il
‑
2蛋白和il
‑
2rα蛋白之间的结合，因此不会优先结合在t
reg
上表达的il
‑
2rαβγ链。
[0127]
如本文所用，术语“抗体”不仅包括完整的多克隆或单克隆种抗体，还包括其片段(例如dab、fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(scfv)、其合成变体、天然存在的变体、包含具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体和包含所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗体(及其抗原结合片段)的某些特性和表征在本文更详细地描述。
[0128]
抗体或抗原结合片段基本上可以是任何类型。如本领域公知的，抗体是一种免疫球蛋白分子，能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个表位识别位点特异性结合靶标，例如免疫检查点分子。
[0129]
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指包含与目的抗原结合的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个cdr的多肽片段。在这方面，本文所述抗体的抗原结合片段可包含来自结合靶分子的抗体的v
h
和v
l
序列的1、2、3、4、5或所有6个cdr。
[0130]
可以使用本领域众所周知的方法(参见davies等人，annual rev.biochem.59:439
‑
473,1990)量化抗体及其抗原结合片段的结合特性。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段以约或范围从≤10
‑7m到约10
‑8m的平衡解离常数与靶分子例如il
‑
2蛋白或其表位或复合物特异性结合。在一些实施方案中，平衡解离常数为约≤10
‑9m至约≤10
‑
10
m。在某些说明性实施方案中，抗体或其抗原结合片段对il
‑
2蛋白(其特异性结合)具有约、至少约或小于约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40,或50nm的亲和力(kd
或ec
50
)。
[0131]
如果诸如多肽或抗体之类的分子与特定细胞、物质或特定表位比其与其他细胞或物质或表位反应或结合更频繁、更迅速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则称其表现出“特异性结合”或“优先结合”如果抗体与靶细胞或表位的结合比其与其他细胞或物质或表位的结合具有更大的亲和力、亲和性、更容易和/或持续时间更长(例如以统计学显著的量)，则其“特异性结合”或“优先结合”靶细胞或表位。通常，表现出特异性结合的一对分子中的一个成员在其表面或空腔有个区域，其特异性地结合并因此与分子对中另一个成员的特定空间和/或极性组织互补。因此，该对的成员具有彼此特异性结合的特性。例如，特异性或优先结合特定表位的抗体是结合该特定表位比其结合其他表位具有更大的亲和力、亲合性、更容易和/或更长的持续时间的抗体。通过阅读这个定义也可以理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的抗体(或部分或表位)可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。该术语也适用于，例如，抗体对由许多抗原携带的特定表位具有特异性，在这种情况下，携带抗原结合片段或结构域的特异性结合成员将能够结合携带表位的各种抗原；例如，它可对来自具有共同表位的多个物种的许多不同形式的目标抗原产生交叉反应。
[0132]
免疫结合通常是指发生在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白特异性的抗原之间的非共价相互作用类型，例如作为说明而非限制，由于静电、离子、亲水性和/或疏水性吸引力或排斥力、空间力、氢键、范德华力、和其他相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(kd)表示，其中更小的kd代表更大的亲和力。所选多肽的免疫结合特性可以使用本领域公知的方法进行量化。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物的形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物伙伴的浓度、相互作用的亲和性，以及同样影响两个方向速率的几何参数。因此，“接通速率常数”(“on rate constant”，kon)和“断开速率常数”(“off rate constant”，koff)可以通过计算浓度和实际结合和解离速率来确定。koff/kon的比率可以划去所有与亲和力不相关的参数，因此等同于解离常数kd。如本文所用，术语“亲和力”包括两种试剂可逆结合的平衡常数，表示为kd或ec
50
。抗体对il
‑
2蛋白或表位的亲和力可以是，例如，从约100纳摩尔(nm)至约0.1nm、从约100nm至约1皮摩尔(pm)或从约100nm至约1飞摩尔(fm)。如本文所用，术语“亲和力”是指两种或更多种试剂的复合物在稀释后对解离的抵抗力。
[0133]
抗体可以通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任一种来制备。参见，例如，harlow和lane，antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory，1988。例如，可以使用kohler和milstein,eur.j.immunol.6:511
‑
519,1976,的技术及其改进来制备对目的多肽特异的单克隆抗体。还包括利用转基因动物如小鼠表达人抗体的方法。参见，例如，neuberger等，nature biotechnology14：826，1996；lonberg等人.,handbook of experimental pharmacology113:49
‑
101,1994；和lonberg等人,internal review of immunology13:65
‑
93,1995.particular examples include theplatform by(参见，例如，美国专利号6,596,541)。
[0134]
在某些实施方案中，如本文所述的抗体及其抗原结合片段包括重链和轻链cdr组，分别插入在重链和轻链框架区(fr)组，其为cdr提供支持并定义cdr相对于彼此的空间关系。如本文所用，术语“cdr组”是指重链或轻链v区的三个高变区。从重链或轻链的n端开始，
这些区域分别表示为“cdr1”、“cdr2”和“cdr3”。因此，抗原结合位点包括六个cdr，包括来自重链和轻链v区的每个的cdr组。包含单个cdr(例如，cdr1、cdr2或cdr3)的多肽被称为在本文中作为“分子识别单元”。许多抗原
‑
抗体复合物的晶体学分析表明，cdr的氨基酸残基与结合抗原形成广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链cdr3。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
[0135]
如本文所用，术语“fr组”是指四个侧翼氨基酸序列，其构建重链或轻链v区cdr组的cdr。一些fr残基可能会接触结合的抗原；然而，fr主要负责将v区折叠到抗原结合位点，特别是直接与cdr相邻的fr残基。在fr中，某些氨基酸残基和某些结构特征是非常高度保守的。对此，所有v区序列包含约90个氨基酸残基的内部二硫环。当v区折叠到结合位点后，cdr显示为突出的环基序，其形成抗原结合表面。人们普遍认为，存在fr的保守结构区，其会影响cdr环折叠成某些“规范”结构的形状——无论精确的cdr氨基酸序列如何。此外，已知某些fr残基参与非共价结构域间接触，其稳定抗体重链和轻链的相互作用。
[0136]
免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可以通过参考kabat,e.a.等人,sequences of proteins of immunological interest.4th edition.us department of health and human services.1987,及其更新确定。
[0137]
还包括“单克隆”抗体，指的是同种抗体群，其中单克隆抗体由参与表位选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)组成。单克隆抗体具有高度特异性，针对单个表位。术语“单克隆抗体”不仅包括完整的单克隆抗体和全长的单克隆抗体，还包括其片段(例如fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(scfv)、其变体、包含抗原结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和任何免疫球蛋白分子的其他修饰构型(其包括具有所需特异性和结合表位能力的抗原结合片段(表位识别位点))。不旨在限制抗体的来源或制备它的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物)。该术语包括整个免疫球蛋白以及上述“抗体”定义下的片段等。
[0138]
蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割igg分子以产生几个片段，其中两个(f(ab)片段)每个都包含一个共价异源二聚体，其包括一个完整的抗原结合位点。胃蛋白酶能够切割igg分子以提供几个片段，包括包含两个抗原结合位点的f(ab')2片段。根据某些实施方案使用的fv片段可以通过优先蛋白水解切割igm，以及在极少数情况下切割igg或iga免疫球蛋白分子产生。然而，fv片段更普遍地使用本领域已知的重组技术衍生。fv片段包括非共价vh::vl异源二聚体，其包括保留了大部分天然抗体分子的抗原识别和结合能力的抗原结合位点。参见inbar等人,pnas usa.69:2659
‑
2662,1972；hochman等人.,biochem.15:2706
‑
2710,1976；和ehrlich等人.,biochem.19:4091
‑
4096,1980。
[0139]
在某些实施方案中，考虑了单链fv(scfv)抗体。例如，可以使用遵循本技术教导的关于选择具有所需特异性的抗体的标准分子生物学技术来制备κ体(ill等人，prot.eng.10:949
‑
57,1997)；微体(minibody)(martin等人，embo j 13：5305
‑
9，1994)；双抗体(holliger等人,pnas 90:6444
‑
8,1993)；或janusins(traunecker等人，embo j 10：3655
‑
59,1991；和traunecker等人，int.j.cancer suppl.7:51
‑
52,1992)。
[0140]
单链fv(scfv)多肽是共价连接的vh::vl异源二聚体，由基因融合(其包括vh和vl编码基因，通过编码肽的接头连接)表达。huston等人(pnas usa.85(16):5879
‑
5883,1988)。已经采用了多种方法描述用于识别化学结构以将天然聚集但化学分离的轻和重多
肽链从抗体v区转化为scfv分子的化学结构(其将折叠成与抗原结合位点结构基本相似的三维结构)。参见，例如，美国专利号5,091,513和5,132,405，授予huston等人；和美国专利号4,946,778，授予ladner等人。
[0141]
在某些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段是“双抗体”的形式。双抗体是多肽的多聚体，每个多肽包含包含免疫球蛋白轻链结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白重链结合区的第二结构域，这两个结构域被连接(例如，通过肽接头)但不能相互结合以形成抗原结合位点：抗原结合位点由多聚体中一个多肽的第一个结构域与多聚体中另一个多肽的第二结构域结合而形成(wo94/13804)。一个抗体的双抗体片段由vh结构域组成(ward等，nature 341：544
‑
546，1989)。例如，可以通过基因融合来构建双抗体和其他多价或多特异性片段(参见wo94/13804；和holliger等人，pnas usa.90:6444
‑
6448,1993))。
[0142]
还包括包含连接到ch3结构域的scfv的微型抗体(参见hu等人，cancer res.56:3055
‑
3061,1996)。另见ward等，nature.341:544
‑
546,1989；bird等人,science.242:423
‑
426,1988；huston等人.,pnas usa.85:5879
‑
5883,1988)；pct/us92/09965；wo94/13804；和reiter等人.,nature biotech.14:1239
‑
1245,1996。
[0143]
在要使用双特异性抗体的情况下，这些可以是常规的双特异性抗体，它们可以以多种方式制造(holliger和winter，current opinion biotechnol.20 4:446
‑
449,1993)，例如，化学制备或从杂交杂交瘤制备，或可以是任何上面提到的双特异性抗体片段。双抗体和scfv可以构建不含fc区，仅使用可变区，可能会降低抗独特型(anti
‑
idiotypic)反应的效果。
[0144]
与双特异性全抗体相反，双特异性双抗体也可能特别有用，因为它们可以很容易地在大肠杆菌中构建和表达。可以使用来自文库的噬菌体展示(wo94/13804)来轻松选择具有适当结合特异性的双抗体(以及许多其他多肽例如抗体片段)。如果双抗体的一个臂要保持恒定，例如，具有针对抗原x的特异性，则可以制作文库，其中另一臂发生变化并选择具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可以通过knobs
‑
into
‑
holes工程制造(ridgeway等人，protein eng.，9：616
‑
621，1996)。
[0145]
在某些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段是的形式。是去除了铰链区的igg4抗体(参见genmab utrecht，the netherlands；也参见，例如，us20090226421)。这种抗体技术创造了一种稳定的、更小的抗体形式，预计比当前的小抗体形式具有更长的治疗窗口。igg4抗体被认为是惰性的，因此不会与免疫系统相互作用。可以通过消除抗体的铰链区来修饰完全人igg4抗体以获得相对于相应的完整igg4(genmab,utrecht)具有不同稳定性特性的半分子片段。将igg4分子减半只留下上一个区域，其可以与同源抗原(例如疾病靶标)结合，因此仅与靶细胞上的一个位点单价结合。对于某些癌细胞表面抗原，这种单价结合可能不会刺激癌细胞生长，如使用具有相同抗原特异性的二价抗体所见，因此技术可为某些可能难以用常规抗体治疗的癌症类型提供治疗选择。的小尺寸在治疗某些形式的癌症时可以带来很大的好处，可以使分子更好地分布在较大的实体瘤上，并可能提高疗效。
[0146]
在某些实施方案中，本文所述的抗体和抗原结合片段是纳米抗体的形式。微型抗体由单个基因编码并在几乎所有原核和真核宿主，例如大肠杆菌(参见美国专利号6,765,087)、霉菌(例如曲霉属或木霉属)和酵母菌(例如酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属或毕赤酵母属(参见美国专利号6,838,254)中产生。生产过程是可扩展的，并且已经生产了数公斤的纳米抗体。纳米抗体可以被配制为一种即用型溶液，保质期长。nanoclone方法(参见wo 06/079372)是一种专有的基于自动化高通量选择b细胞的针对所需靶标生成纳米抗体的方法。
[0147]
还包括重链二聚体，例如来自骆驼抗体和鲨鱼的抗体。骆驼抗体和鲨鱼抗体包含两条链的v样和c样结构域的同源二聚体对(都没有轻链)。由于骆驼抗体中重链二聚体igg的vh区没有与轻链进行疏水相互作用，重链中通常接触轻链的区域在骆驼抗体中变成亲水性氨基酸残基。重链二聚体igg的vh结构域称为vhh结构域。鲨鱼ig
‑
nar包含一个可变结构域(称为v
‑
nar结构域)和五个c样恒定结构域(c
‑
nar结构域)的同源二聚体。
[0148]
在骆驼抗体中，抗体库的多样性是由互补的vh或vhh区中的互补决定区(cdr)1、2和3确定的。骆驼vhh区中的cdr3的特征在于其平均16个氨基酸的相对较长的长度(muyldermans等，1994，protein engineering7(9)：1129)。这与许多其他物种的抗体的cdr3区域形成对比。例如，小鼠vh的cdr3平均有9个氨基酸。可以通过例如2005年2月17日公布的美国专利申请号20050037421公开的方法制成骆驼抗体衍生的抗体可变区文库(其保持了骆驼抗体的可变区的体内多样性)。
[0149]
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。这些实施方案是指通常使用重组技术制备的嵌合分子，其具有源自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点，并且分子的剩余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域或仅移植到可变结构域中合适的框架区上的cdr。表位结合位点可以是野生型或通过一个或多个氨基酸取代而修饰。这消除了恒定区在人类个体中作为免疫原，但对外来可变区的免疫应答的可能性仍然存在(lobuglio等人，pnas usa 86：4220
‑
4224，1989；queen等人，pnas usa.86：10029
‑
10033，1988年；riechmann等人，nature。332:323
‑
327,1988)。抗体人源化的说明性方法包括在美国专利号7,462,697中描述的方法。
[0150]
另一种方法不仅侧重于提供源自人类的恒定区，而且还修饰可变区，以便尽可能地将它们重塑为人类形式。众所周知，重链和轻链的可变区都含有三个互补
‑
决定区(cdr)，根据相关表位的不同而变化并决定结合能力，两侧是四个框架区(fr)，这些框架区在给定物种中相对保守，并假定为cdr提供支架。当针对特定表位制备非人抗体时，可以通过将来自非人抗体的cdr移植到人抗体中存在的fr上来“重塑”或“人源化”可变区。这种方法对各种抗体的应用已被sato等人,cancer res.53:851
‑
856,1993；riechmann等人,nature 332:323
‑
327,1988；verhoeyen等人l.,science 239:1534
‑
1536,1988；kettleborough等人,protein engineering.4:773
‑
3783,1991；maeda等人,human antibodies hybridoma 2:124
‑
134,1991；gorman等人.,pnas usa.88:4181
‑
4185,1991；tempest等人.,bio/technology 9:266
‑
271,1991；co等人.,pnas usa.88:2869
‑
2873,1991；carter et al.,pnas usa.89:4285
‑
4289,1992；and co等人,j immunol.148:1149
‑
1154,1992报道。在一些实施方案中，人源化抗体保留所有cdr序列(例如，包含来自小鼠抗体的所有六个cdr的人源
化小鼠抗体)。在其他实施方案中，人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个cdr(一、二、三、四、五、六)，其也被称为一个或多个cdr“源自”来自原始抗体的一或多个cdr。
[0151]
在某些实施方案中，抗体是“嵌合”抗体。在这方面，嵌合抗体由抗体的抗原结合片段与不同抗体的异源fc部分可操作地连接或以其他方式融合而组成。在某些实施方案中，fc结构域或异源fc结构域是人源的。在某些实施方案中，fc结构域或异源fc域是小鼠来源的。在其他实施方案中，异源fc结构域可以来自与亲本抗体不同的ig类别，包括iga(包括亚类iga1和iga2)、igd、ige、igg(包括亚类igg1、igg2、igg3和igg4)和igm。在进一步的实施方案中，异源fc结构域可以由来自一种或多种不同ig类别的ch2和ch3结构域组成。如上所述，关于人源化抗体，嵌合抗体的抗原结合片段可仅包含如本文所述的抗体的一个或多个cdr(例如，本文所述抗体的1、2、3、4、5或6个cdr)，或可包含完整可变结构域(vl、vh或两者)。
[0152]
任何一种或多种上述il
‑
2结合蛋白可以与本文所述的任何其他成分组合，例如il
‑
2蛋白、包括结合部分和接头的掩蔽部分和其他任选的蛋白质结构域，以产生一个或多个可活化的前蛋白或包含同样的更大的多链结构。
[0153]
掩蔽部分。如上所述，本文所述的可活化前蛋白包含第一多肽和第二多肽，每一个都包含“掩蔽部分”。即，第一多肽包含第一掩蔽部分，并且第二多肽包含第二掩蔽部分。任何给定的可活化前蛋白中的第一和第二掩蔽部分可以相同(或基本相同)或不同。
[0154]
在某些情况下，掩蔽部分二聚体掩蔽了il
‑
2蛋白的活性结构域。因此，在本文提供的可活化前蛋白的背景下，当包含il
‑
2/il
‑
2结合蛋白复合物(例如，il
‑
2/il
‑
2rα复合物)的“活性结构域”通过添加在至少一个掩蔽部分(通过一个或多个可切割接头)而被修饰并且存在靶标(例如，il
‑
2rβ/γc受体链)时，活性结构域与其靶标的结合相对于等效活性结构域(未通过添加掩蔽部分而被修饰)的特异性结合被阻断、减少或抑制。
[0155]
在一些实施方案中，掩蔽部分变构地抑制可活化前蛋白与其靶标的结合，例如免疫细胞表面上的同源il
‑
2rβ/γc受体链。在这些和相关的实施方案中，可活化的前蛋白与其靶标不显示结合或基本上不显示结合，或不超过0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％的结合(与活性结构域或单独的il
‑
2蛋白的结合相比)，任选至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84、96小时或5、10、15、30、45、60、90、120、150、180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长，任选地在体内或在靶标替换(target displacement)体外测定(本领域可用)中测量。
[0156]
本文所述的掩蔽部分各自包含促进第一和第二掩蔽部分之间结合的“结合部分”和将每个结合部分与其各自的il
‑
2蛋白或il
‑
2结合蛋白(例如，il
‑
2rα蛋白)分开的“接头”。每个可活化前蛋白中的至少一个接头是可切割接头，切割后释放至少一个掩蔽部分从而暴露il
‑
2蛋白的活性或结合位点，任选地在肿瘤位点或癌组织中。第一和第二结合部分可以相同或不同，并且第一和第二接头可以相同或不同。在一些实施方案中，第一掩蔽部分和/或第二掩蔽部分不结合il
‑
2蛋白或il
‑
2结合蛋白。
[0157]
结合部分的结构特性会因多种因素而异，例如干扰il
‑
2与其靶标结合所需的最小氨基酸序列、结合部分与il
‑
2蛋白或il
‑
2结合蛋白之间的接头的长度、适合提供半胱氨酸
‑
半胱氨酸二硫键解离的半胱氨酸存在或不存在于il
‑
2蛋白或il
‑
2结合蛋白内或侧翼，等等。
[0158]
结合部分的一般实例在下表m1中提供。
[0159]
表m1.示例性结合部分短肽亮氨酸拉链肽vhvlvh
‑
ch1vl
‑
clvh
‑
clvl
‑
ch1ch3ch2ch3fab
‑
ch3fab
‑
ch2ch3抗原结合结构域
‑
ch3抗原结合结构域
‑
ch2ch3ch3变体ch2ch3变体fab
‑
ch3变体fab
‑
ch2ch3变体抗原结合结构域
‑
ch3变体抗原结合结构域
‑
ch2ch3变体
[0160]
因此，在某些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分选自表m1。
[0161]
在特定实施方案中，第一结合部分和/或第二结合部分包含免疫球蛋白的抗原结合结构域，包括其抗原结合片段和变体，例如vl结构域和/或vh结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域不结合抗原，例如人抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合抗原，例如人抗原。
[0162]
在一些实施方案中，第一结合部分和/或第二结合部分包含免疫球蛋白的恒定结构域，或其片段或变体。例如，在某些实施方案中，第一和/或第二结合部分包含免疫球蛋白的ch1、ch2、ch3、ch1ch3、ch2ch3、ch1ch2ch3和/或cl结构域，包括其片段和变体，及其组合。在某些情况下，轻链(cl)是λ或κ链。在一些实施方案中，本文提供的可活化前蛋白的掩蔽部分或结合部分中存在的恒定结构域是糖基化的。在一些实施方案中，糖基化是n
‑
糖基化。在一些实施方案中，糖基化是o
‑
糖基化。在某些实施方案中，掩蔽部分包含旋钮(knob)和孔(hole)结构以改善所需掩蔽部分对之间的特异性结合(参见图9a
‑
9b)。例如，在特定的实施方案中，掩蔽部分对的ch3结构域包含旋钮和孔结构(参见例如shatz等人，mabs.5(6):872
‑
881,2013)。
[0163]
在具体实施方案中，第一结合部分和/或第二结合部分在n
‑
至c
‑
末端方向包含：(1)免疫球蛋白的抗原结合结构域，包括其抗原结合片段和变体；(2)免疫球蛋白恒定结构域，包括其片段和变体，例如ch1、ch2、ch3、ch1ch3、ch2ch3，ch1ch2ch3和/或免疫球蛋白的cl结构域，包括其组合。
[0164]
本文使用的免疫球蛋白结构域(抗原结合结构域、恒定结构域)任选地包含igg结构域。然而，某些实施方案包括替代的免疫球蛋白，例如igm、iga、igd和ige。此外，各种免疫球蛋白的所有可能同种型也包括在当前实施方案中。因此，igg1、igg2、igg3、等，都是结合结构域中可能的分子。除了选择免疫球蛋白和同种型的类型的选择，某些实施方案包含各种铰链区(或其功能等价物)。此类铰链区提供本文所述的前蛋白的不同结构域之间的灵活性。在一些实施方案中，免疫球蛋白部分的结合结构域(或更大的掩蔽部分)来自选自iggl、igg2、igg3、igg4、igd、iga和igm的免疫球蛋白类别。
[0165]
如上所述，在一些实施方案中，第一结合部分和第二结合部分是不同的，例如，其中第一和第二掩蔽部分通过它们各自的第一和第二结合部分结合在一起作为异源二聚体。例如，在一些实施方案中，第一结合部分包含免疫球蛋白的vl和cl结构域，并且第二结合部分包含免疫球蛋白的vh和ch1结构域。在一些实施方案中，第一结合部分包含免疫球蛋白的vh和ch1结构域，并且第二结合部分包含免疫球蛋白的vl和cl结构域。这种类型的示例性结构在图3a
‑
3d中示出。
[0166]
在特定的实施方案中，第一结合部分和第二结合部分相同或基本相同，例如，其中第一和第二掩蔽部分通过它们各自的第一和第二结合部分结合在一起作为同源二聚体。作为一个例子，在一些实施方案中，第一和第二结合部分中的每一个都包含ch2结构域和ch3结构域(参见例如图9b中的最左侧结构)。
[0167]
示例性掩蔽部分的说明性实例在下表s3中提供。
[0168][0169]
如上所述，在某些实施方案中，掩蔽部分包含接头，即肽接头。在一些实施方案中，至少一个接头是可切割的接头，例如，包含蛋白酶切割位点的可切割接头。在一些实施方案中，接头的至少一种是不可切割接头，即生理稳定接头。
[0170]
在一些实施方案中，第一接头和/或第二接头的长度为约1
‑
50、1
‑
40、1
‑
30、1
‑
20、1
‑
10、1
‑
5、1
‑
4、1
‑
3个氨基酸，或长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、43、44、45、46、47、48、49、50个氨基酸。在特定实施方案中，第一接头是可切割接头，第二接头是
不可切割接头。在一些实施方案中，第一接头是不可切割接头，第二接头是可切割接头。
[0171]
在一些实施方案中，可切割接头包含至少一个蛋白酶切割位点。合适的蛋白酶切割位点和自切割肽是技术人员已知的(参见，例如，ryan等人，j.gener.virol.78:699
‑
722,1997；和scymczak等人，nature biotech.5:589
‑
594,2004)。在一些实施方案中，蛋白酶切割位点可被选自金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶中的一种或多种的蛋白酶切割。在特定实施方案中，蛋白酶切割位点可被选自以下中的一种或多种的蛋白酶切割：mmp1、mmp2、mmp3、mmp4、mmp5、mmp6、mmp7、mmp8、mmp9、mmp10、mmp11、mmp12、mmp13、mmp14、tev蛋白酶、matriptase、upa、fap、legumain、psa、激肽释放酶、组织蛋白酶a、和组织蛋白酶b。
[0172]
可切割接头的实例在下表s4中提供。
[0173]
[0174]
[0175][0176]
因此，在某些实施方案中，可切割接头选自表s4。可切割接头的其他实例包括被丝氨酸蛋白酶(例如凝血酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、激肽释放酶或枯草杆菌蛋白酶)切割的氨基酸序列。凝血酶可切割的氨基酸序列的说明性实例包括但不限于：
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
asp
‑
(seq id no:185)、
‑
gly
‑
gly
‑
arg
‑
、
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
asp
‑
asn
‑
pro
‑
(seq id no:186)、
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
asp
‑
ser
‑
(seq id no:187)、
‑
gly
‑
arg
‑
gly
‑
asp
‑
ser
‑
pro
‑
lys
‑
(seq id no:188)、
‑
gly
‑
pro
‑
arg
‑
、
‑
val
‑
pro
‑
arg
‑
和
‑
phe
‑
val
‑
arg
‑
。弹性蛋白酶可切割的氨基酸序列的说明性实例包括但不限于：
‑
ala
‑
ala
‑
ala
‑
、
‑
ala
‑
ala
‑
pro
‑
val
‑
(seq id no:189)、
‑
ala
‑
ala
‑
pro
‑
leu
‑
(seq id no:190)、
‑
ala
‑
ala
‑
pro
‑
phe
‑
(seq id no:191)、
‑
ala
‑
ala
‑
pro
‑
ala
‑
(seq id no:192)和
‑
ala
‑
tyr
‑
leu
‑
val
‑
(seq id no:193)。
[0177]
可切割接头还包括可被基质金属蛋白酶切割的氨基酸序列，例如胶原酶、溶基质素和明胶酶。基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列的说明性实例包括但不限于：
‑
gly
‑
pro
‑
y
‑
gly
‑
pro
‑
z
‑
(seq id no:194)、
‑
gly
‑
pro
‑
、leu
‑
gly
‑
pro
‑
z
‑
(seq id no:195)、
‑
gly
‑
pro
‑
ile
‑
gly
‑
pro
‑
z
‑
(seq id no:1960和
‑
ala
‑
pro
‑
gly
‑
leu
‑
z
‑
(seq id no:197)，其中y和z是氨基酸。胶原酶可切割的氨基酸序列的实例包括但不限于
‑
pro
‑
leu
‑
gly
‑
pro
‑
d
‑
arg
‑
z
‑
(seq id no：198)，
‑
pro
‑
leu
‑
gly
‑
leu
‑
leu
‑
gly
‑
z
‑
(seq id no：199)，
‑
pro
‑
gln
‑
gly
‑
ile
‑
ala
‑
gly
‑
trp
‑
(seq id no:200)、
‑
pro
‑
leu
‑
gly
‑
cys(me)
‑
his
‑
(seq id no:201)、
‑
pro
‑
leu
‑
gly
‑
leu
‑
tyr
‑
ala
‑
(seq id no:202)、
‑
pro
‑
leu
‑
ala
‑
leu
‑
trp
‑
ala
‑
arg
‑
(seq id no:203)和
‑
pro
‑
leu
‑
ala
‑
tyr
‑
trp
‑
ala
‑
arg
‑
(seq id no:204)，其中z是氨基酸。溶基质素可切割的氨基酸序列的说明性实例是
‑
pro
‑
tyr
‑
ala
‑
tyr
‑
tyr
‑
met
‑
arg
‑
(seq id no：205)；明胶酶可切割的氨基酸序列的一个例子是
‑
pro
‑
leu
‑
gly
‑
met
‑
tyr
‑
ser
‑
arg
‑
(seq id no：206)。
[0178]
可切割接头还包括可被血管紧张素转化酶切割的氨基酸序列，例如
‑
asp
‑
lys
‑
pro
‑
、
‑
gly
‑
asp
‑
lys
‑
pro
‑
(seq id no:207)，和
‑
gly
‑
ser
‑
asp
‑
lys
‑
pro
‑
(seq id no:208)。可切割接头还包括可被组织蛋白酶b降解的氨基酸序列，例如val
‑
cit、ala
‑
leu
‑
ala
‑
leu
‑
(seq id no:209)、gly
‑
phe
‑
leu
‑
gly
‑
(seq id no:210)和phe
‑
lys。
[0179]
在特定实施方案中，可切割接头在ph 7.4、25℃下，例如在生理ph、人体温度(例如，体内、血清中、给定组织中)，具有约或小于约30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时的半衰期，或任何中间的半衰期。
[0180]
通常，第一或第二接头中的至少一个是不可切割接头。示例性的不可切割接头包括在maratea等人，gene 40:39
‑
46,1985；murphy等人,pnas usa.83:8258
‑
8262,1986；美国专利号4,935,233和美国专利号4,751,180中公开的那些。特定不可切割接头序列包含gly、ser和/或asn残基。如果需要，其他接近中性的氨基酸，例如thr和ala也可以用于肽接头序列中。
[0181]
某些示例性不可切割接头包括含有gly、ser和/或asn的接头，如下所示：[g]
x
、[s]
x
、[n]
x
、[gs]
x
、[ggs]
x
、[gss]
x
、[gsgs]
x
(seq id no:211)、[ggsg]
x
(seq id no:212)、[gggs]
x
(seq id no:213)、[ggggs]
x
(seq id no:214)、[gn]
x
、[ggn]
x
、[gnn]
x
、[gngn]
x
(seq id no:215)、[ggng]
x
(seq id no:216)、[gggn]
x
(seq id no:217)、[ggggn]
x
(seq id no:218)接头，其中
x
是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20或更大。这些和相关氨基酸的其他组合对本领域技术人员来说将是显而易见的。
[0182]
不可切割接头的其他例子包括以下氨基酸序列：gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
(se q id no:219)；gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
(seq id no:220)；gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
gly
‑
ser
‑
(seq id no:221)；asp
‑
ala
‑
ala
‑
ala
‑
lys
‑
glu
‑
ala
‑
ala
‑
ala
‑
lys
‑
asp
‑
ala
‑
ala
‑
ala
‑
arg
‑
glu
‑
ala
‑
ala
‑
ala
‑
arg
‑
asp
‑
ala
‑
ala
‑
ala
‑
lys
‑
(seq id no:222)；和asn
‑
val
‑
asp
‑
his
‑
lys
‑
pro
‑
ser
‑
asn
‑
thr
‑
lys
‑
val
‑
asp
‑
lys
‑
arg
‑
(seq id no:223)。
[0183]
不可切割接头的其他非限制性实例包括dgggs(seq id no:224)；tgekp(seq id no:225)(参见，例如，liu等人,pnas.94:5525
‑
5530,1997)；ggrr(seq id no:226)(pomerantz等人，1995)；(ggggs)n(seq id no:214)(kim等人,pnas.93:1156
‑
1160,1996)；egkssgsgseskvd(seq id no:227)(chaudhary等人.,pnas.87:1066
‑
1070,1990)；kesgsvsseqlaqfrsld(seq id no:228)(bird等人.,science.242:423
‑
426,1988),ggrrgggs(seq id no:229)；lrqrdgerp(seq id no:230)；lrqkdgggserp(seq id no:231)；lrqkd(gggs)2erp(seq id no:232)。在具体实施方案中，接头包含gly3接头序列，其包含三
个甘氨酸残基。在特定实施方案中，可以使用能够建模dna结合位点和肽自身的计算机程序(desjarlais&berg,pnas.90:2256
‑
2260,1993；和pnas.91:11099
‑
11103,1994)或通过噬菌体展示方法来合理设计灵活的接头。
[0184]
在一些实施方案中，接头包含免疫球蛋白(ig)/抗体铰链区或其片段，例如，从igg1抗体获得或衍生的铰链区。在一些实施方案中，术语ig“铰链”区是指包含与天然存在的ig铰链区序列的一部分共享序列同一性或相似性的氨基酸序列的多肽，可选地包括半胱氨酸残基，二硫键在此连接免疫球蛋白的两条重链。本发明的铰链区接头与天然存在的免疫球蛋白铰链区氨基酸序列的序列相似性可以在至少50％至约75
‑
80％的范围，并且通常大于约90％。
[0185]
在一些实施方案中，接头包含间隔元件和可切割元件以便使可切割元件更容易接近负责切割的酶。
[0186]
任何一种或多种前述接头可与本文所述的任何一种或多种结合部分组合以形成掩蔽部分，其可与任何一种或多种本文所述的il
‑
2蛋白和/或il
‑
2结合蛋白组合，以形成本公开的可活化前蛋白。
[0187]
额外结构域。某些可活化前蛋白包含一种或多种额外的结构域，例如结合结构域(参见，例如，图2d和图9a
‑
9b)。在一些实施方案中，第一多肽进一步包含在第一掩蔽部分的游离末端的蛋白结构域a和/或在il
‑
2蛋白的游离末端的蛋白结构域b。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含在第二掩蔽部分的游离末端的蛋白结构域c和/或在il
‑
2结合蛋白游离末端的蛋白结构域d。
[0188]
在一些实施方案中，蛋白结构域a
‑
d相同或不同。在特定的实施方案中，蛋白结构域a
‑
d选自以下中的一种或多种：细胞受体靶向部分(任选地双特异性靶向部分)、抗原结合结构域(任选地双特异性抗原结合结构域)、细胞膜受体胞外结构域(ecd)、fc结构域、人血清白蛋白(hsa)、fc结合结构域、hsa结合结构域、细胞因子、趋化因子和可溶性蛋白配体。
[0189]
在一些实施方案中，一种或多种额外的蛋白结构域可用于形成两种、三种、四种、五种或更多种可活化的前蛋白的复合物，其通过一种或多种额外的结构域结合在一起。图9a
‑
9b中提供了此类复合物的实例。
[0190]
可活化前蛋白及其预期切割产物的说明性实例提供在下表s5中(也参见实施例)。
[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211][0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223][0224]
因此，在某些实施方案中，可活化前蛋白包含第一多肽，其包含、由或基本上由具有与seq id no:9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61、65、69、73、77、81、233、235、237、239、241、243或245至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成和第二多肽，其分别包含、由或基本上由具有与seq id no:85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、234、236、238、240、242、244或246至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成。
[0225]
在某些实施方案中，可活化前蛋白包含第一多肽，其包含、由或基本上由具有与seq id no:247、250、253、256、259、或262至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成，第二多肽，其分别包含、由或基本上由具有与seq id no:248、251、254、257或263至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成，和第三和第四多肽(例如，免疫球蛋白结构域，例如轻链可变区或重链可变区)，其分别包含、由或基本上由具有与seq id no:249、252、255、258、261或264至少80、85、90、95、98或100％同一性的氨基酸序列组成。在具体实施方案中，可活化的前蛋白包含轻链可变区和/或重链可变区(其与目的抗原例如成纤维细胞激活蛋白(fap)特异性结合)。
[0226]
在某些实施方案中，上述序列(来自表s5)的任一项或多项的tev蛋白酶切割位点序列被人蛋白酶切割位点(即，可被人蛋白酶例如在癌组织或癌细胞中表达的人蛋白酶切割的切割位点)替换。
[0227]
使用方法和药物组合物
[0228]
某些实施方案包括在有需要的受试者中治疗、改善疾病或病症的症状和/或减少其进展的方法，包括向受试者施用至少一种可活化的前蛋白，如本文所述。还包括在受试者中增强免疫应答的方法，包括向受试者施用至少一种可活化的前蛋白，如本文所述。在特定实施方案中，疾病选自癌症、病毒感染和免疫紊乱中的一种或多种。
[0229]
在一些实施方案中，施用后，可活化的前蛋白通过细胞或组织中的蛋白酶切割被活化，所述切割释放了包含蛋白酶切割位点的掩蔽部分，暴露结合存在于免疫细胞表面的il
‑
2rβ/γc链的il
‑
2蛋白的结合位点(体外或体内)，从而产生活化的蛋白质。在特定实施方案中，蛋白酶切割发生在癌细胞或癌组织中，或病毒感染的细胞或病毒感染的组织。通常，活化的蛋白质具有至少一种免疫刺激性il
‑
2活性，例如，通过结合存在于免疫细胞表面的il
‑
2rβ/γc链(体内)，从而刺激免疫细胞。在特定实施方案中，免疫细胞选自t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、和巨噬细胞中的一种或多种。
[0230]
在一些实施方案中，可活化前蛋白的施用和活化(以产生活化蛋白)，使受试者的免疫应答相对于对照增加约或至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000％或更多。在一些情况下，免疫应答是抗癌或抗病毒免疫应答。在一些实施方案中，可活化前蛋白的施用和活化(以产生活化的蛋白质)使受试者中的细胞杀伤相对于对照增加约或至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000％、2000％更多。在一些实施方案中，其中细胞杀伤是癌细胞杀伤或病毒感染的细胞杀伤。
[0231]
在一些实施方案中，可活化前蛋白的施用和活化(以产生活化蛋白质)不会显著增加活化的蛋白质与在调节性t细胞(t
reg
)上表达的il
‑
2rα/β/γc链的结合。例如，在某些活化的蛋白质中，il
‑
2蛋白和il
‑
2结合蛋白之间的结合(例如，il
‑
2蛋白和il
‑
2rα蛋白之间的二硫键结合)在接头切割后保持，掩蔽了结合在t
reg
上表达的il
‑
2rα/β/γc链的il
‑
2蛋白的结合位点，从而干扰了活化蛋白与t
reg
的结合。因此，在某些实施方案中，活化的蛋白质相对于可活化的前蛋白不显著刺激或增强(t
reg
)的增殖和/或活化。
[0232]
在一些实施方案中，疾病是癌症，即有需要的受试者患有或怀疑患有癌症。因此，某些实施方案包括在有需要的受试者中治疗、改善癌症的症状或抑制癌症的进展的方法，包括向受试者施用至少一种可活化的前蛋白，如本文所述。在特定实施方案中，癌症是原发性癌症或转移性癌症。在特定实施方案中，癌症选自黑色素瘤(任选地转移性黑色素瘤)、肾癌(任选肾细胞癌)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、间皮瘤、白血病(任选地淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性髓性白血病或复发急性髓性白血病)、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、b细胞恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原始神经外胚层肿瘤(髓母细胞瘤)、膀胱癌、子宫癌、食道癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。
[0233]
在一些实施方案中，如上所述，癌症是转移性癌症。除了上述癌症之外，示例性的转移性癌症包括但不限于已经转移到骨、肝和/或肺的膀胱癌；已经转移到骨、脑、肝和/或肺的乳腺癌；已转移至肝、肺和/或腹膜的结直肠癌；已经转移到肾上腺、骨、脑、肝和/或肺的肾癌；已经转移到肾上腺、骨、脑、肝和/或其他肺部部位的肺癌；已转移至骨、脑、肝、肺和/或皮肤/肌肉的黑色素瘤；已转移至肝、肺和/或腹膜的卵巢癌；已转移至肝、肺和/或腹膜的胰腺癌；已经转移到肾上腺、骨、肝和/或肺的前列腺癌；已转移至肝、肺和/或腹膜的胃癌；已经转移到骨、肝和/或肺的甲状腺癌；已经转移到骨、肝、肺、腹膜和/或阴道的子宫癌；其他。
[0234]
治疗癌症的方法可以与其他治疗方式相结合。例如，可以在其他治疗干预之前、期间或之后向受试者施用本文所述的联合疗法，所述其他治疗干预包括对症护理(symptomatic care)、放射疗法、手术、移植、激素疗法、光动力疗法、抗生素疗法或其任意组合。对症治疗包括施用皮质类固醇以减少脑水肿、头痛、认知功能障碍和呕吐，以及施用抗惊厥药以减少癫痫发作。放疗包括全脑辐照、分次放疗(fractionated radiotherapy)和放射手术，如立体定向放射手术，其可进一步与传统手术相结合。
[0235]
某些实施方案因此包括用于治疗癌症的联合疗法，包括在有需要的受试者中治疗、改善癌症的症状或抑制癌症进展的方法，包括向受试者施用至少一种本文所述的可活
化前蛋白与至少一种另外的药剂，例如化疗剂、激素治疗剂和/或激酶抑制剂的组合。在一些实施方案中，相对于单独的另外药剂，施用至少一种可活化的前蛋白增强了癌症对另外的药剂(例如，化疗剂、激素治疗剂和/或激酶抑制剂)的易感性约或至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000％或更多。
[0236]
某些联合疗法使用一种或多种化学治疗剂，例如，小分子化疗药物。化学治疗剂的非限制性实例包括烷化剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、拓扑异构酶抑制剂(1型或ii型)、抗微管剂等。
[0237]
烷化剂的实例包括氮芥(例如，甲氯乙胺、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和白消安)、亚硝基脲(例如，n
‑
亚硝基
‑
n
‑
甲基脲(mnu)、卡莫司汀(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)、司莫司汀(meccnu)、福替莫司汀和链脲佐菌素)、四嗪类(例如达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺)、氮丙啶类(例如噻替哌、丝裂霉素和二嗪醌(diaziquone，azq))、顺铂及其衍生物(例如，卡铂和奥沙利铂)和非经典烷化剂(任选地丙卡巴肼和六甲基三聚氰胺)。
[0238]
抗代谢物的实例包括抗叶酸剂(例如，甲氨蝶呤和培美曲塞)、氟嘧啶(例如，5
‑
氟尿嘧啶和卡培他滨)、脱氧核苷类似物(例如，安西他滨、依西他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、阿扎胞苷、氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨和喷司他丁)和硫嘌呤(例如，硫鸟嘌呤和巯嘌呤)
[0239]
细胞毒性抗生素的例子包括蒽环类抗生素(例如，多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、阿柔比星和米托蒽醌)、博来霉素、丝裂霉素c、米托蒽醌和放线菌素。拓扑异构酶抑制剂的例子包括喜树碱、伊立替康、托泊替康、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、美巴隆和阿柔比星。
[0240]
抗微管剂的实例包括紫杉烷类(例如紫杉醇和多西紫杉醇)和长春花生物碱(例如长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)。
[0241]
本文所述的各种化疗剂可以与任何一种或多种本文所述的可活化前蛋白组合，并根据本文所述的任何一种或多种方法或组合物使用。
[0242]
某些联合疗法使用至少一种激素治疗剂。激素治疗剂的一般实例包括激素激动剂和激素拮抗剂。激素激动剂的具体实例包括孕激素(孕激素)、皮质类固醇(例如，泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松)、胰岛素样生长因子、vegf衍生血管生成和淋巴管生成因子(例如，vegf
‑
a、vegf
‑
a145、vegf
‑
a165、vegf
‑
c、vegf
‑
d、pigf
‑
2)、成纤维细胞生长因子(fgf)、半乳糖凝集素、肝细胞生长因子(hgf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、转化生长因子(tgf)
‑
β、雄激素、雌激素和生长抑素类似物。激素拮抗剂的例子包括激素合成抑制剂，例如芳香酶抑制剂和促性腺激素释放激素(gnrh)激动剂(如亮丙瑞林、戈舍瑞林、曲普瑞林、组瑞林)，包括其类似物。还包括激素受体拮抗剂，例如选择性雌激素受体调节剂(serm；例如他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬)和抗雄激素(例如氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁他胺)。
[0243]
还包括激素途径抑制剂，例如针对激素受体的抗体。实例包括igf受体(例如igf
‑
ir1)抑制剂，例如西妥木单抗(cixutumumab)、dalotuzumab、figitumumab、ganitumab、istiratumab和robatumumab；血管内皮生长因子受体1、2或3(vegfr1、vegfr2或vegfr3)的抑制剂，例如alacizumab pegol、贝伐单抗、icrucumab、雷莫卢单抗；tgf
‑
β受体r1、r2和r3的抑制剂，例如fresolimumab和metelimumab；c
‑
met抑制剂，如naxitamab；egf抑制剂受体
如西妥昔单抗、depatuxizumab mafodotin、富妥昔单抗(futuximab)、imgatuzumab、laprituximab emtansine、matuzumab、modotuximab、奈西木单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗、tomuzotuximab(托木妥昔单抗)、和zalutumumab；fgf受体抑制剂，如aprutumab ixadotin和bemarituzumab；和pdgf受体抑制剂，如奥拉木单抗(olaratumab)和tovetumab。
[0244]
本文所述的各种激素治疗剂可以与任何一种或多种本文所述的可活化前蛋白组合，并根据本文所述的任何一种或多种方法或组合物使用。
[0245]
某些联合疗法使用至少一种激酶抑制剂，包括酪氨酸激酶抑制剂。激酶抑制剂的实例包括但不限于阿法替尼(afanitib)、阿柏西普(aflibercept)、阿西替尼、贝伐单抗、伯舒替尼、卡博替尼、西妥昔单抗、cobimetinib、克唑替尼、达沙替尼、恩曲替尼(entrectinib)、厄达替尼(erdafitinib)、埃罗替尼、福坦替尼(fostamitinib)、吉非替尼、依鲁替尼(ibrutinib)、伊马替尼、拉帕替尼、仑伐替尼、mubritinib、尼洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、帕唑帕尼、pegaptanib、泊那替尼、雷尼单抗、瑞戈非尼、芦可替尼、索拉非尼、舒尼替尼(sunitinib)、su6656、托法替尼、赫赛汀、凡德他尼和维莫非尼(vemuafenib)。
[0246]
本文所述的各种激酶抑制剂可以与任何一种或多种本文所述的可活化前蛋白组合，并根据本文所述的任何一种或多种方法或组合物使用。
[0247]
在一些实施方案中，本文所述的方法和药物组合物将受试者的中位生存时间增加4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、40周或更长。在某些实施方案中，本文所述的方法和药物组合物将受试者的中位存活时间增加1年、2年、3年或更长。在一些实施例中，所述方法和药物种组合物将无进展生存期延长2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间。在某些实施方案中，本文所述的方法和药物组合物将无进展生存期增加1年、2年、3年或更长时间。
[0248]
在某些实施方案中，本文所述的方法和治疗组合物足以导致肿瘤消退，如通过存活肿瘤量的统计学显著减少所指示，例如，肿瘤质量减少至少10％、20％、30％、40％、50％或更多，或通过改变(例如，具有统计显著性的降低)的扫描尺寸所指示。在某些实施方案中，本文所述的方法和治疗组合物足以导致疾病稳定。
[0249]
在一些实施方案中，疾病是病毒性疾病或病毒感染。在某些实施方案中，病毒感染选自以下中的一种或多种：人类免疫缺陷病毒(hiv)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、杯状病毒相关腹泻、轮状病毒腹泻、乙型流感嗜血杆菌肺炎和侵袭性疾病、流感、麻疹、腮腺炎、风疹、副流感相关肺炎、呼吸道合胞病毒(rsv)肺炎、严重急性呼吸综合征(sars)、人乳头瘤病毒、单纯疱疹2型生殖器溃疡、登革热发烧、日本脑炎、蜱传脑炎、西尼罗河病毒相关疾病、黄热病、爱泼斯坦
‑
巴尔病毒、拉沙热、克里米亚
‑
刚果出血热、埃博拉出血热、马尔堡出血热、狂犬病、裂谷热、天花、上下呼吸道感染和脊髓灰质炎。在具体的实施方案中，受试者是hiv阳性的。在一些实施方案中，本文所述的方法和药物组合物将抗病毒免疫应答提高约或至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000％或更多(相对于对照)。
[0250]
在一些实施方案中，免疫病症选自1型糖尿病、血管炎和免疫缺陷中的一种或多种。在一些实施方案中，本文所述的方法和药物组合物使受试者的免疫功能改善例如约或至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000％或更多(相对于对照)。
[0251]
在某些实施方案中，本文所述的方法和治疗组合物足以导致技术医师已知的特定疾病适应症的症状的临床相关减轻。
[0252]
对于体内用途，如上所述，用于治疗人类或非人类哺乳动物疾病或测试，通常在施用前将本文所述的药剂掺入一种或多种治疗或药物组合物中，包括兽用治疗组合物。
[0253]
因此，某些实施方案涉及包含至少一种如本文所述的可活化前蛋白的药物或治疗组合物。在一些情况下，药物或治疗组合物包含一种或多种本文所述的可活化前蛋白，其与药学或生理学上可接受的载体或赋形剂组合。某些药物或治疗组合物进一步包含至少一种另外的药剂，例如，如本文所述的化学治疗剂、激素治疗剂和/或激酶抑制剂。
[0254]
一些治疗组合物仅包含(并且某些方法利用)一种可活化的前蛋白。某些治疗组合物包含(并且某些方法利用)至少两种、三种、四种或五种不同的可活化前蛋白的混合物。
[0255]
在特定实施方案中，包含至少一种可活化前蛋白的药物或治疗组合物基本上是纯的(基于蛋白质或以基于重量
‑
重量)，例如，组合物具有至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％的纯度(基于蛋白质或以基于重量
‑
重量)。
[0256]
在一些实施方案中，如本领域已知的，本文所述的可活化前蛋白不形成聚集体、具有期望的溶解度和/或具有适用于人类的免疫原性特征。因此，在一些实施方案中，包含可活化前蛋白的治疗组合物基本上不含聚集体。例如，某些组合物包含少于约10％的(以蛋白质计)高分子量聚集蛋白，或低于约5％的高分子量聚集蛋白，或小于约4％的高分子量聚集蛋白，或小于约3％的高分子量聚集蛋白，或小于约2％的高分子量聚集蛋白，或小于约1％的高分子量聚集蛋白。一些组合物包含就其表观分子量而言至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％单分散的可活化前蛋白。
[0257]
在一些实施方案中，可活化前蛋白浓缩至约或至少约0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6、0.7、0.8、0.9、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、11、12、13、14或15mg/ml并配制用于生物治疗用途。
[0258]
为了制备治疗或药物组合物，有效或所需量的一种或多种药剂与本领域技术人员已知的适用于特定药剂和/或施用方式的任何药物载体或赋形剂混合。药物载体可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可包括例如无菌稀释剂(例如水)、盐水溶液(例如磷酸盐缓冲盐水；pbs)、固定油(fixed oil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂(如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)和螯合剂(如乙二胺四乙酸(edta))；缓冲液(如醋酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内施用(例如通过静脉输注)，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(pbs)，以及含有增稠剂和增溶剂的溶液，例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物。
[0259]
本文所述的药剂的施用(以纯形式或以合适的治疗或药物组合物的形式)，可以通过用于提供类似用途的药剂的任何可接受的施用模式进行。可以通过将含有药剂的组合物与合适的生理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备治疗或药物组合物，并可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球剂和气雾剂。此外，其他药物活性成分(包括本文别处描述的其他小分子)和/或合适的赋形剂例如盐、缓冲剂和稳定剂可以但不必需存在于组合物中。
[0260]
施用可通过多种不同途径实现，包括口服、肠胃外、鼻内、静脉内、皮内、肌内、皮下
或局部。优选的施用方式取决于待治疗或预防的病症的性质。具体实施方案包括通过静脉内输注施用。
[0261]
载体可以包括，例如，药学上或生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒。通常生理学上可接受的载体是ph缓冲水溶液。生理上可接受的载体的例子包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯20(tween
tm
)聚乙二醇(peg)和泊洛沙姆(pluronics
tm
)等。
[0262]
在一些实施方案中，一种或多种药剂可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此类技术在remington's pharmaceutical sciences，第16版，oslo,a.,ed.,(1980)中公开。颗粒或脂质体还可包含其他治疗剂或诊断剂。
[0263]
治疗的精确剂量和持续时间取决于所治疗的疾病并可以使用已知的测试方案或通过在本领域已知的模型系统中测试组合物并从中推断来凭经验确定。也可以进行对照临床试验。剂量也可以随着要减轻的病症的严重程度而变化。药物组合物通常被配制和施用以发挥治疗有用的作用，同时尽量减少不良副作用。所述组合物可以施用一次，或可以分成若干较小的剂量，以间隔时间施用。对于任何特定受试者，可根据个体需要随时间调整特定剂量方案。
[0264]
因此，施用这些和相关治疗或药物组合物的典型途径包括但不限于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道和鼻内。本文使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射(intrasternal injection)或输液技术。根据本公开的某些实施方案的治疗或药物组合物被配制以使得在向受试者或患者施用组合物时允许其中包含的活性成分是生物可利用的。将被施用于受试者或患者的组合物可以采取一种或多种剂量单位的形式，例如，片剂可以是单个剂量单位，而本文所述药剂(以气雾剂形式)的容器可容纳多个剂量单位。制备此类剂型的实际方法对本领域技术人员而言是已知的或将是显而易见的；例如，参见remington:the science and practice of pharmacy,20th edition(philadelphia college of pharmacy and science,2000)。待施用的组合物通常含有治疗有效量的本文所述的药剂，用于治疗目的疾病或病症。
[0265]
治疗或药物组合物可以是固体或液体的形式。在一个实施方案中，载体是颗粒状的，因此组合物是例如片剂或粉末形式。载体可以是液体，组合物是例如口服油、可注射液体或气雾剂，其可用于例如吸入施用。当旨在口服施用时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文视为固体或液体的形式中。某些实施方案包括无菌的可注射溶液。
[0266]
作为用于口服施用的固体组合物，所述药物组合物可以配制成粉剂、颗粒剂、压片、丸剂、胶囊剂、橡皮胶糖(chewing gum)、薄饼(wafer)等。这样的固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。此外，可以存在以下一种或多种：粘合剂，例如羧甲基
纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂，例如海藻酸、海藻酸钠、primogel、玉米淀粉等；润滑剂，如硬脂酸镁或sterotex；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味剂；和着色剂。当药物组合物为胶囊形式(例如，明胶胶囊)时，除上述类型的材料外，其还可以含有液体载体，例如聚乙二醇或油。
[0267]
治疗或药物组合物可以是液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳剂或悬浮液。作为两个示例，液体可以用于口服施用或用于通过注射递送。当用于口服施用时，优选的组合物除本发明化合物外还含有一种或多种甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和调味剂。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
[0268]
液体治疗或药物组合物，无论它们是溶液、悬浮液或其他类似形式，可包括一种或多种以下佐剂：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液(ringer’s solution)、等渗氯化钠、固定油，如合成甘油单酯或甘油二酯，其可作为溶剂或悬浮介质，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中(由玻璃或塑料制成)。生理盐水是优选的佐剂。注射剂组合物优选是无菌的。
[0269]
用于肠胃外施用或口服施用的液体治疗或药物组合物应含有一定量的药剂，以使获得合适的剂量。通常，该量是组合物中目标药剂的至少0.01％。当旨在用于口服施用时，该量可以在组合物重量的0.1％至约70％之间。某些口服治疗或药物组合物含有目标试剂的约4％至约75％。在某些实施方案中，制备治疗或药物组合物和制剂，使得肠胃外剂量单位包含目标试剂重量的0.01％至10％(稀释前)。
[0270]
治疗或药物组合物可旨在用于局部施用，在这种情况下，载体可以适当地包括溶液、乳液、软膏或凝胶基质。例如，基质可包含以下一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和醇、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的治疗或药物组合物中。如果旨在用于透皮施用，组合物可包括透皮贴剂或离子导入(iontophoresis)装置。
[0271]
治疗或药物组合物可以以例如栓剂的形式旨在用于直肠施用，其将在直肠中融化并释放药物。用于直肠施用的组合物可包含油质基质作为合适的无刺激性赋形剂。此类基质包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
[0272]
治疗组合物或药物组合物可以包括各种材料，其改变固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可包括在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶和其他肠溶包衣剂。或者，活性成分可被包封在明胶胶囊中。固体或液体形式的治疗或药物组合物可包括与药剂结合从而有助于化合物的递送的成分。可以以这种能力起作用的合适成分包括单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。
[0273]
治疗或药物组合物可基本上由剂量单位组成，其可作为气雾剂施用。气雾剂一词用于表示各种系统，从胶体性质的系统到由加压包装组成的系统。递送可以是通过液化或
压缩气体或通过合适的泵系统，其分配活性成分。气雾剂可以在单相、双相或三相系统中递送以递送活性成分。气雾剂的递送包括必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，其一起可以形成套件。本领域普通技术人员无需过度的实验即可确定优选的气雾剂。
[0274]
本文所述的组合物可以与保护药剂免于从身体快速消除的载体一起制备，例如定时释放制剂或包衣。这样的载体包括控释制剂，例如但不限于植入物和微囊化递送系统、可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯(polyorthoester)、聚乳酸和其他(本领域普通技术人员已知)。
[0275]
治疗或药物组合物可以通过制药领域中已知的方法学制备。例如，旨在通过注射施用的治疗或药物组合物可包含盐、缓冲剂和/或稳定剂中的一种或多种，与无菌蒸馏水以形成溶液。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与药剂非共价相互作用以促进药剂在水相递送系统中的溶解或均匀悬浮的化合物。
[0276]
治疗或药物组合物可以治疗有效量施用，这将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间长度；受试者的年龄，体重、一般健康状况、性别和饮食；施用方式和时间；排泄比率；药物组合；特定疾病或病症的严重程度；和受试者接受治疗。在一些情况下，治疗有效的日剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.001mg/kg(即，约0.07mg)至约100mg/kg(即，约7.0克)；优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.01mg/kg(即，约0.7mg)至约50mg/kg(即，～3.5g)；更优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约1mg/kg(即约70mg)至约25mg/kg(即约1.75g)。在一些实施方案中，每周、每两周或每月施用治疗有效剂量。在具体实施方案中，每周、每两周或每月施用治疗有效剂量，例如以约1
‑
10或1
‑
5mg/kg，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg的剂量。
[0277]
本文所述的联合疗法可包括施用单一药物剂型，其包含可活化的前蛋白和额外的治疗剂(例如，化疗剂、激素治疗剂、激酶抑制剂)，以及施用包括可活化的前蛋白和额外的治疗剂(以其自身单独的药物剂型)的组合物。例如，可活化的前蛋白和另外的治疗剂可以以单一口服剂量组合物一起施用于受试者，例如片剂或胶囊，或每种药剂以单独的口服剂型施用。类似地，可活化的前蛋白和另外的治疗剂可以在单一胃肠外剂量组合物中一起施用于受试者，例如在盐水溶液或其他生理学可接受的溶液中，或者每种药剂在单独的肠胃外剂型中施用。作为另一个例子，对于基于细胞的疗法，可活化的前蛋白可以在施用前与细胞混合，可以作为单独组合物一部分施用，或两者兼具。当使用单独的剂量制剂时，可以基本上在相同时间，即同时，或在分开的交错时间，即依次和以任何顺序施用组合物；联合治疗被理解为包括所有这些方案。
[0278]
还包括患者护理套件，其包含(a)至少一种可活化的前蛋白，如本文所述；和任选地(b)至少一种额外的治疗剂(例如，化学治疗剂，激素治疗剂、激酶抑制剂)。在某些套件中，(a)和(b)在分开的治疗组合物中。在一些套件中，(a)和(b)在相同的治疗组合物中。
[0279]
本文的套件还可包括一种或多种额外的治疗剂或其他适合或期望用于治疗的适应症或期望的诊断应用的成分。本文的套件还可包括一个或多个注射器或其他必需或期望促进预期的递送模式的成分(例如，支架(stent)、可植入贮库等)。
[0280]
在一些实施方案中，患者护理套件包含组合物和信息材料的单独容器、分隔件或隔室。例如，组合物可以包含在瓶子、小瓶或注射器中，并且信息材料可以与容器结合而被包含。在一些实施方案中，套件的单独元件包含在一个单一的、未分开的容器中。例如，组合
物包含在瓶子、小瓶或注射器中(以标签形式附有信息材料)。在一些实施方案中，套件包括多个(例如，一包)单独的容器，每个容器包含一个或多个单位剂型(例如，本文所述的剂型)的可活化前蛋白和任选地至少一种额外的治疗剂。例如，所述套件包括多个注射器、安瓿瓶、铝箔包或泡罩包装，每个包含单个单位剂量的可活化前蛋白和任选地至少一种额外的治疗剂。套件的容器可以是气密的、防水的(例如，不透水分或蒸发的变化)和/或不透光的。
[0281]
患者护理套件任选地包括适合于施用组合物的装置，例如注射器、吸入剂、滴管(例如滴眼器)、拭子(例如，棉签或木签)，或任何此类递送装置。在一些实施方案中，所述装置是可植入装置，其分配药剂的计量剂量。还包括提供套件的方法，例如，通过组合本文所述的组分。
[0282]
表达和纯化系统
[0283]
某些实施方案包括用于表达和纯化本文所述的可活化前蛋白的方法和相关组合物。可以使用例如sambrook等人，(1989，同上)，特别是第16和17节；ausubel等人.,(1994,supra)，特别是第10章和第16章；和coligan等人，current protocols in protein science(john wiley&sons,inc.1995
‑
1997)，特别是第1、5和6章中描述的标准方案方便地制备这样的重组可活化前蛋白。作为一个一般示例，可以通过包括以下步骤的一个或多个的程序制备可活化的前蛋白：(a)制备一个或多个载体或构建体，所述载体或构建体包含一个或多个多核苷酸序列，其编码第一多肽(即包含il
‑
2蛋白和掩蔽部分的第一多肽链)和第二多肽(即包含il
‑
2结合蛋白和掩蔽部分的第二多肽链)，其与一个或多个调控元件可操作地连接；(b)将一种或多种载体或构建体引入一种或多种宿主细胞；(c)培养一种或多种宿主细胞以表达第一和第二多肽，其结合在一起以形成可活化的前蛋白；(d)从宿主细胞分离可活化前蛋白。或者，第一和第二多肽可以在单独的宿主细胞中产生，单独分离，然后组合以形成可活化的前蛋白。
[0284]
为了表达所需的多肽，编码第一和/或第二可活化前蛋白的多肽链核苷酸序列可以插入到合适的表达载体，即含有转录和翻译插入的编码序列所需元件的载体中。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建包含编码感兴趣多肽的序列和合适的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、合成技术和体内基因重组。此类技术在sambrook等人，molecular cloning，a laboratory manual(1989)和ausubel等人，current protocols in molecular biology(1989)中描述。
[0285]
多种表达载体/宿主系统是已知的并且可用于包含和表达多核苷酸序列。这些包括但不限于微生物，例如用重组噬菌体、质粒或粘粒dna表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，camv；烟草花叶病毒，tmv)或细菌表达载体(例如，ti或pbr322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统，包括哺乳动物细胞，更特别地是人类细胞系统。
[0286]
表达载体中存在的“控制元件”或“调控序列”是载体的那些非翻译区——增强子、启动子、5'和3'非翻译区——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。此类元素的强度和特异性可能会有所不同。取决于使用的载体系统和宿主，可以使用任意数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，例如pbluescript噬菌粒(stratagene，la jolla，ca)或psport1质粒(gibco brl，gaithersburg，md)的杂合lacz启动子等。在哺乳动物细胞系统中，通常优选来自哺乳
动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果需要生成包含多拷贝的编码多肽的序列的细胞系，则可以有利地使用基于sv40或ebv的载体(与适当的选择标记一起使用)。
[0287]
在细菌系统中，可以根据表达多肽的用途选择多种表达载体。例如，当需要大量时，可以使用指导易于纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。此类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如bluescript(stratagene)，其中编码目标多肽的序列可与氨基末端met和随后的7个β
‑
半乳糖苷酶残基的序列按阅读框连接到载体中，从而产生杂交蛋白；pin载体(van heeke&schuster,j.biol.chem.264:5503 5509(1989))；等。pgex载体(promega,madison,wis)也可用于表达外源多肽作为与谷胱甘肽s
‑
转移酶(gst)的融合蛋白。一般来说，这种融合蛋白是可溶的，很容易通过吸附到谷胱甘肽
‑
琼脂糖珠上，然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而从裂解的细胞中纯化出来。在此类系统中制备的蛋白质可以设计为包括肝素、凝血酶或因子xa蛋白酶切割位点(以便可以从gst部分释放目的克隆多肽)。
[0288]
某些实施方案采用基于大肠杆菌的表达系统(参见，例如，structural genomics consortium等，nature methods。5:135
‑
146,2008)。这些和相关的实施方案可以部分或完全依赖于不依赖连接的克隆(lic)来产生合适的表达载体。在特定实施方案中，蛋白质表达可以由t7 rna聚合酶(例如，pet载体系列)控制。这些和相关的实施方案可以利用表达宿主菌株bl21(de3)，其是bl21的λde3溶原菌，支持t7介导的表达，缺乏lon和ompt蛋白酶用于提高目标蛋白的稳定性。还包括携带编码在大肠杆菌中很少使用的trna的质粒的表达宿主菌株，例如rosetta
tm
(de3)和rosetta 2(de3)菌株。使用以商标核酸酶和蛋白质提取试剂销售的试剂也可以改善细胞裂解和样品处理。对于细胞培养，自诱导培养基可以提高许多表达系统的效率，包括高通量表达系统。这种类型的培养基(例如，overnight express
tm
自诱导系统)通过代谢转变逐渐引发蛋白质表达，而无需添加人工诱导剂例如iptg。特定实施方案使用六组氨酸标签(例如以商标融合出售的那些)，然后是固定化金属亲和层析(imac)纯化或相关技术。然而，在某些方面，临床级蛋白质可以从大肠杆菌包涵体中分离，没有或不使用亲和标签(参见，例如shimp等，protein expr purif。50:58
‑
67,2006)。作为进一步的例子，某些实施方案可以采用冷激诱导的大肠杆菌高产生产系统，因为在低温下蛋白质在大肠杆菌中的过表达提高了它们的溶解度和稳定性(参见，例如，qing等人，nature biotechnology.22:877
‑
882,2004)。
[0289]
还包括高密度细菌发酵系统。例如，高细胞密度培养真养产碱菌允许以超过150g/l的细胞密度生产蛋白质，并以超过10g/l的滴度表达重组蛋白。
[0290]
在酵母酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)中，可以使用许多含有组成型或诱导型启动子，例如α因子、醇氧化酶和pgh的载体。关于综述，请参阅ausubel等人。(同上)和grant等人，methods enzymol.153:516
‑
544(1987)。还包括毕赤酵母pandoris表达系统(参见，例如，li等人,nature biotechnology.24,210
–
215,2006；和hamilton等人,science,301:1244,2003)。某些实施方案包括被工程化以选择性糖基化蛋白质的酵母系统，包括具有人源化n
‑
糖基化途径的酵母等(参见，例如hamilton等人，science.313:1441
‑
1443,2006；wildt等人，nature reviews microbiol。3:119
‑
28,2005；和gerngross等人，nature
‑
biotechnology。22:1409
‑
1414,2004；美国专利号7,629,163；7,326,681；和7,029,872)。仅
作为举例，重组酵母培养物可以在fernbach烧瓶或15l、50l、100l和200l发酵罐等中生长。
[0291]
在使用植物表达载体的情况下，编码多肽的序列的表达可由许多启动子中的任一个驱动。例如，可以单独使用病毒启动子如camv的35s和19s启动子或与来自tmv的ω前导序列组合使用(takamatsu,embo j.6:307
‑
311(1987))。或者，可以使用植物启动子，例如rubisco的小亚基或热休克启动子(coruzzi等人，embo j.3:1671
‑
1680(1984)；broglie等，science 224:838
‑
843(1984)；和winter等人，results probl.cell differ.17:85
‑
105(1991))。可以通过直接dna转化或病原体介导的转染将这些构建体引入植物细胞。此类技术在许多普遍可获得的综述中进行了描述(参见，例如，hobbs in mcgraw hill，yearbook of science and technology，pp.191
‑
196(1992))。
[0292]
昆虫系统也可用于表达目的多肽。例如，在一个在这样的系统中，autographa加利福尼亚核多角体病毒(acnpv)被用作载体，在草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞中表达外源基因。可以将编码多肽的序列克隆到病毒的非必需区，例如多角体基因，并置于多角体启动子的控制之下。编码多肽的序列的成功插入将使多角体基因失活并产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。然后可以使用重组病毒来感染例如在其中可以表达目的多肽的草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾细胞(engelhard等人,proc.natl.acad.sci.美国91:3224
‑
3227(1994))。还包括杆状病毒表达系统，包括利用sf9、sf21和t.ni细胞的那些系统(参见，例如murphy和piwnica
‑
worms，curr protoc protein sci.第5章：unit5.4，2001)。昆虫系统可以提供类似于哺乳动物系统的翻译后修饰。
[0293]
在哺乳动物宿主细胞中，通常可用许多基于病毒的表达系统。例如，在腺病毒用作表达载体的情况下，可以将编码目标多肽的序列连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。插入病毒基因组非必需的e1或e3区可用于获得能够在感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(logan&shenk,proc.natl.acad.sci.usa81:3655
‑
3659(1984))。此外，转录增强子，例如劳斯肉瘤病毒(rsv)增强子，可用于增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
[0294]
有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括用由sv40转化的猴肾cv1细胞系(cos
‑
7，atcc crl 1651)；人胚胎肾细胞系(293或293细胞亚克隆，用于在悬浮培养中生长，graham等，j.gen virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk，atcc ccl 10)；小鼠支持细胞(sertoli cell)(tm4,mather,biol.reprod.23:243
‑
251(1980))；猴肾细胞(cv1 atcc ccl 70)；非洲绿猴肾细胞(vero
‑
76，atcc crl
‑
1587)；人宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾细胞(mdck，atcc ccl 34)；水牛大鼠肝细胞(brl 3a，atcc crl 1442)；人肺细胞(w138，atccccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tr1细胞(mather等人，annals ny acad.sci.383:44
‑
68(1982))；mrc 5细胞；fs4细胞；和人类肝癌细胞系(hep g2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr
‑
cho细胞(urlaub等人，pnas usa 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如nso和sp2/0。对于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如yazaki和wu，methods in molecular biology，vol.248(b.kc lo,ed.,humana press,totowa,nj,2003)，pp.255
‑
268。某些优选的哺乳动物细胞表达系统包括基于cho和hek293细胞的表达系统。哺乳动物表达系统可以利用附着的细胞系，例如，在t瓶、滚瓶或细胞工厂中，或悬浮培养，例如，在1l和5l旋转器、5l、14l、40l、100l和200l搅拌罐中生物反应器、或20/50l和
100/200l wave生物反应器中，以及本领域已知的其他。
[0295]
还包括蛋白质的无细胞表达。这些和相关的实施方案通常利用纯化的rna聚合酶、核糖体、trna和核糖核苷酸；这些试剂可以通过从细胞或基于细胞的表达系统中提取来产生。
[0296]
也可以使用特定的起始信号来实现更有效的编码目的多肽的序列的翻译。此类信号包括atg起始密码子和相邻序列。在将编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入适当的表达载体的情况下，可不需要额外的转录或翻译控制信号。但是，在只插入了编码序列或其部分的情况下，应该提供包括atg起始密码子在内的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应该在正确的阅读框中，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是各种来源，天然的和合成的。可以通过包含适用于所使用的特定细胞系统的增强子来增强表达效率，例如文献中描述的那些(scharf.等人，results probl.cell differ.20:125
‑
162(1994))。
[0297]
此外，可以就其调节插入序列的表达或以所需的方式加工表达的蛋白质的能力选择宿主细胞株。多肽的此类修饰包括但不限于翻译后修饰，例如乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割“前原”形式的蛋白质的翻译后加工也可用于促进正确的插入、折叠和/或功能。可以选择具有或甚至缺乏特定的细胞机制和特征机制(用于此类翻译后活性)的不同的宿主细胞，如酵母、cho、hela、mdck、hek293和w138(除细菌细胞外)，以确保外源蛋白质的正确修饰和加工。
[0298]
对于重组蛋白的长期、高产生产，稳定表达通常是首选。例如，可使用可包含病毒复制起点和/或内源表达元件和选择标记基因(位于同一载体或不同载体上)的表达载体转化稳定表达目的多核苷酸的细胞系。引入载体后，可让细胞在富集培养基中生长约1
‑
2天，然后再转换为选择性培养基。选择标记的目的是赋予选择抗性，其存在允许成功表达引入的序列的细胞生长和恢复。可使用适合细胞类型的组织培养技术使稳定转化细胞的抗性克隆增殖。也可以采用瞬时生产，例如通过瞬时转染或感染。适用于瞬时生产的示例性哺乳动物表达系统包括hek293和基于cho的系统。
[0299]
可以使用任意数量的选择系统来回收转化或转导的细胞系。这些包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(wigler等，cell 11：223
‑
232(1977))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(lowy等，cell 22：817
‑
823(1990))基因，其可分别用于tk
‑
或aprt
‑
细胞。此外，抗代谢物、抗生素或除草剂抗性可用作选择的基础；例如，赋予对甲氨蝶呤抗性的dhfr(wigler等人,proc.natl.acad.sci.usa 77:3567
‑
70(1980))；赋予对氨基糖苷类、新霉素和g
‑
418的抗性的npt(colbere
‑
garapin等，j.mol.biol.150:1
‑
14(1981))；分别赋予对氯磺隆和膦丝菌素(phosphinotricin)乙酰转移酶的抗性的als或pat(murry，同上)。已描述了其他可选择的基因，例如，trpb，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸，或hisd，其允许细胞利用histinol代替组氨酸(hartman&mulligan,proc.natl.acad.sci.usa 85:8047
‑
51(1988))。可见标记的使用广泛见于此类标记如绿色荧光蛋白(gfp)和其他荧光蛋白(如rfp、yfp)、花青素、β
‑
葡萄糖醛酸酶及其底物gus、荧光素酶及其底物荧光素，其不仅被广泛用于鉴定转化体，还用于量化可归因于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白质表达的量(参见，例如，rhodes等人，methods mol.biol.55:121
‑
131(1995))。
[0300]
还包括高通量蛋白质生产系统或微型生产系统。某些方面可以利用，例如，六组氨
酸融合标签用于蛋白质表达和在金属螯合物修饰的载玻片表面或magnehis ni
‑
particle上进行的纯化(参见，例如，kwon等人，bmc biotechnol.9:72,2009；and lin et al.,methods mol biol.498:129
‑
41,2009))。还包括高通量无细胞蛋白表达系统(参见，例如，sitaraman等，methods mol biol.498:229
‑
44,2009)。
[0301]
用于检测和测量多核苷酸编码产物的表达的多种方案，使用结合剂或抗体(例如对产物特异的多克隆或单克隆抗体)，是本领域已知的。例子包括酶联免疫吸附测定(elisa)、蛋白质免疫印迹、放射免疫测定(ria)和荧光激活细胞分选(facs)。这些和其他分析在hampton等人，serological methods，a laboratory manual(1990)和maddox等人，j.exp.med.158:1211
‑
1216(1983)和其他地方描述。
[0302]
多种标记和缀合技术本领域技术人员已知，并且可用于各种核酸和氨基酸测定。产生用于检测与多核苷酸相关的序列的标记杂交或pcr探针的方法包括寡标记、切口平移、末端标记或使用标记核苷酸的pcr扩增。或者，可以将序列或其任何部分克隆到载体中用于产生mrna探针。此类载体是本领域已知的，可商购获得，并可通过添加适当的rna聚合酶(如t7、t3或sp6)和标记的核苷酸用于体外合成rna探针。这些程序可以使用多种市售试剂盒进行。可以使用的合适的报告分子或标记包括放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂或显色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等。
[0303]
可以在适合表达和回收蛋白质(从细胞培养物中)的条件下培养用一种或多种目的多核苷酸序列转化的宿主细胞。某些特定实施方案利用无血清细胞表达系统。例子包括hek293细胞和cho细胞，其可以在无血清培养基上生长(参见，例如，rosser等人，protein expr.purif.40:237
–
43,2005；和美国专利号6,210,922)。
[0304]
取决于序列和/或所用载体，重组细胞产生的可活化前蛋白可以是分泌的或包含在细胞内。如本领域技术人员将理解的，含有多核苷酸的表达载体可以被设计为含有信号序列，该信号序列指导编码的多肽通过原核或真核细胞的膜分泌。其他重组构建体可用于连接编码目的多肽的序列与编码多肽结构域的核苷酸序列，其将有助于可溶性蛋白质的纯化和/或检测。此类结构域的例子包括可切割和不可切割的亲和纯化和表位标签，例如亲和素、flag标签、多组氨酸标签(例如6xhis)、cmyc标签、v5标签、谷胱甘肽s
‑
转移酶(gst)标签等。
[0305]
重组细胞产生的蛋白质可以根据本领域已知的多种技术进行纯化和表征。用于进行蛋白质纯化和分析蛋白质纯度的示例性系统包括快速蛋白质液相色谱(fplc)(例如，akta和bio
‑
rad fplc系统)、高压液相色谱(hplc)(例如，beckman和waters hplc)。用于纯化的示例性化学法包括离子交换层析(例如q、s)、尺寸排阻层析、盐梯度、亲和纯化(例如ni、co、flag、麦芽糖、谷胱甘肽、蛋白a/g)、凝胶过滤、反相、陶瓷离子交换色谱柱和疏水相互作用柱(hic)，以及本领域已知的其他。还包括分析方法，例如sds
‑
page(例如，考马斯、银染)、免疫印迹、bradford和elisa，其可以在生产或纯化过程的任何步骤中使用，通常用于测量蛋白质组合物的纯度。
[0306]
还包括浓缩可活化前蛋白的方法和包含浓缩的可溶性可活化前蛋白的组合物。在一些方面，至少一种可活化前蛋白的这种浓缩溶液包含蛋白浓度为约或至少约5mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、或更高。
[0307]
在一些方面，此类组合物可以基本上是单分散的，这意味着当例如通过尺寸排阻
色谱、动态光散射、或分析超速离心测定时可活化的前蛋白主要(即，至少约90％或更多)以一个明显分子量形式存在。
[0308]
在一些方面，此类组合物具有至少约90％的纯度(基于蛋白质)，或在一些方面，至少约95％的纯度，或在一些实施方案中，至少98％的纯度。纯度可以通过本领域已知的任何常规分析方法确定。
[0309]
在一些方面，此类组合物的高分子量聚集体含量小于约10％(与存在的蛋白质总量相比)，或在一些实施方案中，此类组合物高分子量聚集体含量小于约5％，或在一些方面，此类组合物的高分子量聚集体含量小于约3％，或在一些实施方案中此类高分子量聚集体含量小于约1％。可通过多种分析技术测定高分子量聚集体含量，包括例如尺寸排阻色谱法、动态光散射法或分析超速离心法。
[0310]
本文中考虑的浓缩方法的例子包括冻干，当溶液含有很少的不是目的蛋白的可溶性组分时常用。冻干通常在hplc运行后进行，可以从混合物中去除大部分或全部挥发成分。还包括超滤技术，其通常使用一个或多个选择性渗透膜来浓缩蛋白质溶液。膜允许水和小分子通过并保留蛋白质；可以通过机械泵、气压或离心等技术将溶液压在膜上。
[0311]
在某些实施方案中，如根据本领域的常规技术测量的，组合物中的可活化前蛋白具有至少约90％的纯度。在某些实施方案中，例如诊断组合物或某些药物或治疗组合物，可活化的前蛋白组合物具有至少约95％，或至少约97％或98％或99％的纯度。在一些实施方案中，例如当用作参考或研究试剂时，可活化的前蛋白可以具有较低纯度，并且可以具有至少约50％、60％、70％或80％的纯度。纯度可以整体测量或与所选成分相关，例如其他蛋白质，例如，基于蛋白质的纯度。
[0312]
纯化的可活化前蛋白也可以根据其生物学特性进行表征。结合亲和力和结合动力学可以根据本领域已知的多种技术进行测量，例如和利用表面等离子体共振(spr)(一种能够实时检测未标记相互作用物的光学现象)的相关技术。基于spr的生物传感器可用于测定活性浓度、筛选和在亲和力和动力学方面进行表征。一种或多种生物活性的存在或水平可以根据基于细胞的测定进行测量，包括利用至少一种il
‑
2受体的那些，其任选地与读数或指示剂(例如生物活性的荧光或发光指示剂)功能性偶联，如本文所述。
[0313]
在某些实施方案中，如上所述，可活化的前蛋白组合物基本上无内毒素，包括例如约95％无内毒素，优选约99％无内毒素，更优选约99.99％无内毒素。如本文所述，可以根据本领域的常规技术检测内毒素的存在。在具体的实施方案中，可活化的前蛋白组合物由真核细胞如哺乳动物或人类细胞(在基本上无血清的培养基中)制成。在某些实施方案中，如本文所述，可活化的前蛋白组合物的内毒素含量小于约10eu/mg可活化前蛋白，或小于约5eu/mg可活化前蛋白，或小于约3eu/mg可活化前蛋白，或小于约1eu/mg可活化前蛋白。
[0314]
在某些实施方案中，可活化的前蛋白组合物包含小于约10％wt/wt高分子量聚集体，或小于约5％wt/wt高分子量聚集体，或小于约2％wt/wt高分子量聚集体，或小于约1％wt/wt高分子量聚集体。
[0315]
还包括基于蛋白质的分析测定和方法，可用于评估例如蛋白质纯度、大小、溶解度和聚集程度等特征。可以通过多种方式评估蛋白质纯度。例如，可以根据一级结构、高级结构、大小、电荷、疏水性和糖基化来评估纯度。评估一级结构的方法的例子包括n端和c端测序和肽作图(peptide
‑
mapping)(参见，例如，allen等人，biologicals.24:255
‑
275,
biophys acta.1752:6
‑
10,2005)，使用遗传标记蛋白的结构互补来监测和测量体内蛋白质折叠和溶解度(参见，例如，wigley等人，nature biotechnology.19:131
‑
136,2001)，以及使用扫描电化学显微镜(secm)来进行大肠杆菌中重组蛋白质溶解度的电化学筛选(参见，例如nagamine等，biotechnology and bioengineering。25 96:1008
‑
1013,2006)等。可以根据本领域的常规技术，包括用于蛋白质溶解度的简单体内测定来鉴定或选择具有增加的溶解度(或减少的聚集)的可活化前蛋白(参见例如maxwell等人，protein sci.8：1908
‑
11，1999)。
[0319]
也可以通过动态光散射技术来测量蛋白质溶解度和聚集。聚集是一个通用术语，包含多种类型的相互作用或特性，包括可溶/不溶、共价/非共价、可逆/不可逆和天然/变性的相互作用和特征。对于蛋白质治疗剂，聚集的存在通常被认为是不希望的，因为担心聚集可能引起免疫原性反应(例如，小聚集)，或可能在施用时引起不良事件(例如，微粒)。动态光散射是指一种可用于确定悬浮液中的小颗粒或溶液中的聚合物如蛋白质的尺寸分布谱的技术。这种技术(也称为光子相关光谱(pcs)或准弹性光散射(qels))使用散射光来测量蛋白质颗粒的扩散速率。由于溶液中分子和粒子的布朗运动，可以观察到散射强度的波动。可以常规地处理该运动数据以获得样品的尺寸分布，其中尺寸由蛋白质颗粒的斯托克斯半径或流体动力学半径给出。流体动力学尺寸取决于质量和形状(构象)。动态散射可以检测到极少量的聚集蛋白(<0.01％重量)的存在，即使是在含有很大范围质量的样品中。其还可以用于比较不同制剂的稳定性，包括，例如，依赖于在升高的温度下实时监测变化的应用。因此，某些实施方案包括使用动态光散射来分析含有本公开的可活化前蛋白的样品中的溶解度和/或聚集的存在。
[0320]
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和示例的方式对前述实施方案进行了一些详细描述，但是根据本公开的教导，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。提供以下实施例仅作为说明而非限制。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生基本相似的结果的各种非关键参数。
实施例
[0321]
实施例1
[0322]
lc
‑
il
‑
2/fd
‑
il
‑
2rα融合蛋白的工程化
[0323]
为了降低il
‑
2相关治疗药物的毒性，产生了lc
‑
接头
‑
il
‑
2/fd
‑
接头
‑
il
‑
2rα融合蛋白作为前药(即，作为可活化的前白，如本文别处所述)。前药的活性非常低。为了恢复il
‑
2的活性，使用tev蛋白酶切割位点来证明此概念并将其引入到fd和il
‑
2rα之间的接头中。在前药内设计的蛋白酶特异性接头序列被蛋白酶切割后，全部活性得以恢复。下表e1中提供了每种可活化前蛋白的命名和相应的序列标识符。
[0324][0325]
为了确认il
‑
2和il
‑
2rα之间的二硫键形成，通过将轻链上的c端半胱氨酸突变为丝氨酸并排除铰链区中的半胱氨酸来消除赫赛汀fab中的二硫键。将c125s点突变引入il
‑
2以避免不想要的il
‑
2链间二硫键形成。示例性蛋白质是p13541362。
[0326]
为了形成更紧密的il
‑
2/il
‑
2rα复合物，将单个半胱氨酸突变分别引入il
‑
2或il
‑
2rα中以迫使il
‑
2和il
‑
2rα之间形成二硫键。il
‑
2中设计的半胱氨酸突变如下：k35c、r38c、t41c、f42c、e61c和v69c。il
‑
2rα中设计的半胱氨酸突变如下：d4c、d6c、n27c、k38c、s39c、l42c、y43c、i118c和h120c。示例性蛋白质是p13551363、p13561364、p13561371、p13571370、p13581365、p13581369、p13591366、p13591367和p13601368。
[0327]
测试了对il
‑
2rα具有更高结合亲和力的il
‑
2三重突变蛋白(v69a、q74p和i128t取代)(以前药形式)。示例性蛋白质是p13611362、p16841362和p16851363。
[0328]
还设计了lc和il
‑
2之间不同的接头长度来评估对il
‑
2活性的影响(在蛋白酶切割后)。示例性蛋白质是p15071366、p15081366和p15091366。
[0329]
il
‑
2超级因子(d10)也以前药形式制备。示例性蛋白质是p15101366。
[0330]
将il
‑
2rα中潜在的n
‑
糖基化位点突变为丙氨酸以消除糖基化。示例性蛋白质是
p13591627、p13591628和p13591629。
[0331]
还测试了lc
‑
接头
‑
il
‑
2/fd
‑
接头
‑
il
‑
2rα
‑
fc形式。示例性蛋白质是p16841687。
[0332]
通过标准基因合成构建编码赫赛汀
‑
lc
‑
接头
‑
il
‑
2(或变体)和赫赛汀
‑
fd
‑
tev
‑
il
‑
2rα(或变体)的质粒，然后亚克隆到ptt5表达载体中。
[0333]
生产、纯化和物理表征。fab
‑
il
‑
2/il
‑
2rα融合蛋白是通过在expi293细胞中瞬时转染产生的，并通过包括captureselect
tm
igg
‑
ch1亲和基质(thermofisher)和尺寸排阻色谱(superdex 200,ge healthcare)的两步纯化过程进行纯化。
[0334]
纯化的蛋白质通过用于纯度评估的sds
‑
page进行表征，并显示出良好的纯度(见图4a
‑
4b和图10a
‑
10b)。在p13541362和p13611362中il
‑
2和il
‑
2rα之间没有形成二硫键。在蛋白质：p13561364、p13571370、p13581365、p13581369和p13601368中il
‑
2和il
‑
2rα之间部分形成二硫键。在蛋白质：p13551363、p13561371、p13591366、p13591367、p15071366、p15081366、p15091366、p15101366、p13591627、p13591628、p13591629中il
‑
2和il
‑
2rα之间完全形成二硫键。纯化的蛋白质可以被tev完全或部分切割，如图4c和图10c所示。
[0335]
纯化的蛋白质还通过高效液相色谱(hplc)进行表征，以进行均匀性评估。根据制造商的说明，使用nanofilm sec
‑
250柱(sepax)和agilent 1260进行hplc分析。代表性的hplc结果如图5a
‑
5e和图11a
‑
11f所示。一些融合蛋白是二聚体和单体的混合物，如图5a
‑
5c所示。一些融合蛋白显示出单体的主峰和二聚体的低左肩峰，如图5d
‑
5e所示。
[0336]
功能增殖测定。在tev切割之前和之后对纯化的蛋白质进行增殖测定。m
‑
07e细胞(il
‑
2rβ/γc)在添加了20％胎牛血清(fbs)、1％非必需氨基酸(neaa)和10％的5637细胞培养上清的rpmi 1640中培养。为了测量细胞因子依赖性细胞增殖，在对数生长期收获m
‑
07e细胞，并用pbs洗涤两次。将90μl细胞悬液(2
×
104个细胞/孔)接种到96孔板中，并在测定培养基(rpmi 1640，添加了10％fbs和1％neaa)中孵育4小时，在37℃和5％co2条件下用于细胞因子饥饿。用于测定的il
‑
2和纯化的蛋白质样品在测定培养基中制备至初始浓度为300nm，随后进行1/3系列稀释。将10μl稀释的蛋白质加入相应的孔中并在37℃和5％co2下孵育72小时。使用cell counting kit
‑
8(cck
‑
8,dojindo,ck04)进行比色测定以测量活细胞的数量。结果显示在图6a
‑
6r和图12a
‑
12f中。fab
‑
il
‑
2/il
‑
2rα可活化前蛋白在tev切割前表现出非常低的功能活性或没有功能活性，而在tev切割后显示出显著增加的活性。
[0337]
实施例2
[0338]
lc
‑
il
‑
2rα/fd
‑
il
‑
2融合蛋白的工程化
[0339]
设计并测试了具有lc
‑
il
‑
2rα/fd
‑
il
‑
2形式的可活化前蛋白。tev蛋白酶切割位点用于证明此概念，并被引入到lc和il
‑
2rα之间的接头中。为了在il
‑
2和il
‑
2rα之间形成二硫键，将e61c突变引入il
‑
2，k38c引入il
‑
2rα。示例性蛋白质是p16121613。
[0340]
通过标准基因合成构建编码赫赛汀
‑
lc
‑
接头
‑
il
‑
2rα(或变体)和赫赛汀
‑
fd
‑
tev
‑
il
‑
2(或变体)的质粒，然后亚克隆到ptt5表达载体中。
[0341]
生产、纯化和物理表征。可活化的前蛋白如实施例1中产生和表征。纯化的p16121613在sds
‑
page上显示出良好的纯度(图7a
‑
7b)并且可以被tev切割(图7c)。p16121613显示出单体的一个主峰和二聚体的低左肩峰(图7d)。
[0342]
功能增殖测定。如实施例1中所述，在tev切割之前和之后对纯化的p16121613进行增殖测定。结果总结于图8a
‑
8b，包括与p13591366的比较(8b)。p16121613在tev切割前表现
出低活性，在tev切割后表现出几乎完全活性(与野生型il
‑
2相比)。与p13591366相比，p16121613在tev切割前表现出更高的背景活性，在切割后表现出更高的活性。
[0343]
实施例3
[0344]
il
‑
2和抗il
‑
2抗体融合蛋白的工程化
[0345]
设计并测试了具有lc
‑
il
‑
2/fd
‑
抗
‑
il
‑2‑
scfv形式的可活化前蛋白。tev蛋白酶切割位点用于证明此概念，并被引入到fd和抗il
‑2‑
scfv之间的接头中。示例性蛋白质是p16931694和p16931695(fc位于抗il
‑2‑
scfv的c端)。
[0346]
设计并测试了在抗il
‑
2抗体的轻链的n端具有il
‑
2的可活化前蛋白。蛋白酶切割位点被引入到il
‑
2和轻链之间的接头中。示例性蛋白质是p17081710和p17091710。
[0347]
通过标准基因合成，然后亚克隆到ptt5表达载体中来构建编码lc
‑
il
‑
2/fd
‑
抗
‑
il
‑2‑
scfv形式和il
‑2‑
抗
‑
il
‑2‑
抗体形式的质粒。
[0348]
生产、纯化和物理表征。可活化的前蛋白如实施例1中产生和表征。纯化的蛋白质在sds
‑
page上显示出良好的纯度(图10a
‑
10b)并且可以被蛋白酶切割(图10c
‑
10d)。p16931694和p16931695显示出良好的同一性(图11g
‑
11h)。p17081710和p17091710显示出一个主要单体峰和二聚体的低左肩峰(图11i
‑
11j)。
[0349]
功能增殖测定。如实施例1中所述，在蛋白酶切割之前和之后对纯化的蛋白质进行增殖测定。结果总结于图12g
‑
12j。p16931694和p16931695在tev切割前表现出低活性，在tev切割后表现出部分活性。p17081710和p17091710作为前药显示出低活性。
[0350]
实施例4
[0351]
hc1
‑
il
‑
2/hc2
‑
il
‑
2rα融合蛋白的工程化
[0352]
设计并测试了具有hc1
‑
il
‑
2/hc2
‑
il
‑
2rα形式的可活化前蛋白。蛋白酶切割位点被引入到重链和il
‑
2rα之间的接头中。示例性蛋白质是p1453182124、p1453182730、p2492962158、p2492972158、p2492982158和p2493962158。
[0353]
通过标准基因合成，然后亚克隆到ptt5表达载体中来构建编码hc1
‑
il
‑
2/hc2
‑
il
‑
2rα融合蛋白的质粒。
[0354]
生产、纯化和物理表征。可活化的前蛋白如实施例1中产生和表征。纯化的蛋白质在sds
‑
page上显示出良好的纯度(图10a
‑
10b)并且可以被蛋白酶部分或完全切割(图10d)。纯化的蛋白质显示出一个主要单体峰和二聚体的低左肩峰(图11k
‑
11p)。
[0355]
功能增殖测定。如实施例1中所述，在蛋白酶切割之前和之后对纯化的蛋白质进行增殖测定。结果总结在图12k
‑
12p中。纯化的蛋白质在蛋白酶切割前显示出低活性，在蛋白酶切割后显示出更高的活性。
[0356]
本说明书中引用的所有出版物、专利申请和已授权专利均通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利申请或已授权专利都被明确地和单独地指示为通过引用并入。