与结核病有关的方法

1.本发明涉及表征受试者的结核病(tb)状态的方法，使得可以鉴定患有初期tb、无症状或潜伏性tb感染(ltbi)的个体。本发明进一步涉及治疗方法、改善结核病预后的方法以及用于评估受试者的结核病状态的试剂盒。


背景技术：

2.据估计，世界上有三分之一的人口感染了结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)，其是导致结核病(tb)的有机体。据估计，2017年全球有1000万人患上tb病。所有国家和各年龄组均存在tb病的病例，但在印度、中国、印度尼西亚、菲律宾、巴基斯坦、尼日利亚、孟加拉国和南非的成年人中患病率最高。在同一年，预计hiv阴性群体中有130万人死于tb，并且hiv阳性群体中有另外300,000人死亡。tb是人类因单一感染源致死的主要原因。2017年，患有tb的群体患病死亡的比例为16％，低于2000年的23％，但距离满足世界卫生组织(who)终结tb策略的2020年目标所需的10％比率还有很长的路要走(2018年全球结核病报告，世界卫生组织；https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/)。
3.对tb病的传统理解是双面的；在一种状态下，潜伏性tb感染(ltbi)，被定义为对结核分枝杆菌的持续免疫应答状态，没有活动性tb病的临床表现证据，患者无症状，并且结核分枝杆菌的复制处于低水平并受免疫系统控制。潜伏性tb感染使结核分枝杆菌能够在群体中持续存在而未被检测到。个体可能患有潜伏性tb感染多年而未被检测到。目前估计全世界患有潜伏性tb感染的人数处于17亿到超过20亿之间的范围内(占世界人口的23-27％)。相比之下，在活动性tb病状态下，患者会由于结核分枝杆菌的复制不受控制导致的病理状态而出现症状。
4.只有一部分ltbi患者会继续患上活动性tb病。感染个体中终生患上活动性tb的风险为5-15％，其中感染后的前2年风险最高。临床潜伏性感染似乎表示了一系列结果，从可能已清除了感染到没有明显症状的亚临床疾病。最近的证据支持存在人类mtb感染的过渡状态，被称为初期tb，其在临床上是潜伏性的，但其特征在于，在不存在进一步干预的情况下，进展为活动性tb的风险增加，并且宿主血液转录谱与疾病重叠(cobelens f等人,从潜伏性到显性：对结核病预测的再思考(from latent to patent:rethinking prediction of tuberculosis).《柳叶刀呼吸医学(the lancet respiratory medicine)》2017；5(4):243-4；zak de等人,结核病风险的血液rna特征：一项前瞻性队列研究(a blood rna signature for tuberculosis disease risk:a prospective cohort study).《柳叶刀(lancet)》2016；387:2312
–
22)。患有初期tb的个体尚未发展出与活动性tb一致的诱导性临床症状、放射学异常或微生物学证据。
5.目前，ltbi治疗是主要的治疗干预措施，可用于预防已感染mtb的患者患上活动性tb病。正在扩展针对ltbi的tb预防性治疗，但是大多数可能从中受益的患者尚未获得治疗。造成这种情况的一个原因是对患有ltbi的群体的诊断不足，原因有很多，包含缺乏症状或
亚临床症状意味着人们没有寻求医疗保健，并且当人们找到健康专业人员就诊时未能准确检测出tb。
6.因此，需要一种快速简单准确的检测方法，使得在足够早的时间点检测出初期tb以进行有效的干预和治疗。正是在此背景下开发了本发明。


技术实现要素：

7.在本发明的第一方面中，提供了：
8.一种诊断无症状人类受试者的疾病的方法，所述方法包括：
9.获得从所述受试者中分离的外周血单核细胞(pbmc)样品；
10.将分枝杆菌特异性噬菌体d29与所述pbmc样品混合以产生混合物；
11.在允许分枝杆菌裂解的条件下温育所述混合物；
12.从所述混合物中分离dna；
13.通过以下中的一项或多项确定从所述混合物中分离的所述dna中是否存在分枝杆菌dna序列：使用对所述分枝杆菌dna序列具有特异性的正向引物和反向引物对从所述混合物中分离的所述dna执行pcr，和/或执行适于鉴定所述分枝杆菌dna序列的测序，以及任选地在存在所述分枝杆菌dna序列的情况下确定所述分枝杆菌dna序列与已知的分枝杆菌dna序列之间的同源性；
14.任选地，对从所述受试者中分离的样品执行分枝杆菌特异性细胞介导的免疫(cmi)应答测试，以生成阳性或阴性cmi应答测试结果；
15.其中当存在所述分枝杆菌dna序列，并且在进行cmi应答测试的情况下有阳性或阴性cmi应答测试结果时，所述无症状人类受试者被诊断为患有初期结核病(tb)；并且
16.其中当不存在所述分枝杆菌dna序列并且存在阳性cmi应答测试结果时，所述无症状人类受试者被诊断为患有潜伏性结核病感染(ltbi)。
17.在本发明的另一方面中，提供了：
18.一种诊断人类受试者的初期结核病(tb)的方法，所述方法包括：
19.获得从所述受试者中分离的外周血单核细胞(pbmc)样品；
20.将分枝杆菌特异性噬菌体与所述pbmc样品混合以产生混合物；
21.在允许分枝杆菌裂解的条件下温育所述混合物；
22.从所述混合物中分离dna；
23.确定从所述混合物中分离的dna中是否存在一个或多个分枝杆菌dna序列；
24.其中存在分枝杆菌dna序列表明所述受试者患有初期结核病。
25.在一个实施例中，所述人类受试者是无症状人类受试者，即所述受试者未表现出活动性结核病的任何症状。
26.在本发明的另一方面中，提供了：
27.一种预测受试者是否有风险患上或患有初期结核病(tb)的方法，所述方法包括：
28.获得从所述受试者中分离的外周血单核细胞(pbmc)样品；
29.将分枝杆菌特异性噬菌体与所述pbmc样品混合以产生混合物；
30.在允许分枝杆菌裂解的条件下温育所述混合物；
31.从所述混合物中分离dna；
32.鉴定所述dna中是否存在分枝杆菌dna序列；
33.其中存在分枝杆菌dna序列表明所述受试者有风险患上或患有初期tb。
34.在本发明的另一方面中，提供了：
35.一种预测受试者是否有风险患上活动性结核病(tb)的方法，所述方法包括：
36.获得从所述受试者中分离的外周血单核细胞(pbmc)样品；
37.将分枝杆菌特异性噬菌体与所述pbmc样品混合以产生混合物；
38.在允许分枝杆菌裂解的条件下温育所述混合物；
39.从所述混合物中分离dna；
40.鉴定所述dna中是否存在分枝杆菌dna序列；
41.其中存在分枝杆菌dna序列表明所述受试者有风险患上活动性tb。
42.在本发明的另一方面中，提供了：
43.一种评估受试者的结核病(tb)预后的方法，所述方法包括：
44.获得从所述受试者中分离的外周血单核细胞(pbmc)样品；
45.将分枝杆菌特异性噬菌体与所述pbmc样品混合以产生混合物；
46.在允许分枝杆菌裂解的条件下温育所述混合物；
47.从所述混合物中分离dna；
48.鉴定从所述混合物中分离的dna中是否存在分枝杆菌dna序列；
49.其中存在分枝杆菌dna序列表明所述受试者有风险患有初期tb和/或患上活动性tb病。
50.在本发明的另一方面中，提供了：
51.一种治疗有需要的受试者的结核病(tb)的方法，所述方法包括：
52.获得从所述受试者中分离的外周血单核细胞(pbmc)样品；
53.使用噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定来鉴定所述受试者中的初期tb的存在；以及在鉴定出初期tb的情况下，
54.向所述受试者施用一种或多种抗tb药物或疗法。
55.噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定意指如本文所描述的任何测定或方法，由此使用分枝杆菌特异性噬菌体(即，将使分枝杆菌或特定分枝杆菌物种或菌株选择性裂解的噬菌体)使样品中的分枝杆菌裂解，以便释放分枝杆菌dna，然后通过任何合适的方法，例如使用分枝杆菌特异性引物的pcr或通过下一代测序技术确认样品中存在分枝杆菌dna。
56.在本发明的另一方面中，提供了：
57.一种治疗有需要的受试者的初期结核病(tb)的方法，所述方法包括：
58.获得从所述受试者中分离的外周血单核细胞(pbmc)样品；
59.将分枝杆菌特异性噬菌体与所述pbmc样品混合以产生混合物；
60.在允许分枝杆菌裂解的条件下温育所述混合物；
61.从所述混合物中分离dna；
62.鉴定所述dna中的分枝杆菌序列的存在；以及
63.向所述受试者施用一种或多种抗初期tb药物或疗法。
64.在本发明的另一方面中，提供了：
65.一种改善受试者的结核病(tb)预后的方法，所述方法包括：
66.获得从所述受试者中分离的外周血单核细胞(pbmc)样品；
67.使用噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定来鉴定所述受试者中的初期tb的存在；以及在鉴定出初期tb的情况下，
68.向所述受试者施用一种或多种抗tb药物或疗法。
69.根据本发明的任何方面，合适的抗tb药物或疗法对于本领域技术人员将是已知的，并且可以基于临床或其它适应症进行选择。合适的抗tb药物或疗法可以包含利福平、盐酸乙胺丁醇、吡嗪酰胺和异烟肼(与盐酸吡哆醇联用)，其可以单独(一种抗tb药物或疗法)或以多于一种的抗tb药物或疗法的任何合适组合施用于受试者。
70.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，可以通过任何合适的方法，例如密度离心(例如，ficoll-paque)从受试者中分离外周血单核细胞(pbmc)样品，通过细胞制备管(cpt
tm
)进行分离、通过sepmate
tm
管进行分离或使用红细胞聚集剂例如hetasep
tm
)进行分离。
71.在本发明的另一方面中，提供了：
72.一种噬菌体的用途，其用于在制造试剂盒时测量从人类受试者中分离的血液样品中的一种或多种分枝杆菌生物标志物的存在，所述试剂盒用于评估所述人类受试者是否有风险患上或患有初期结核病(tb)或活动性结核病。
73.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，确定所述dna中是否存在一个或多个分枝杆菌dna序列可以包括例如使用分枝杆菌特异性引物进行聚合酶链反应。
74.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，所述一个或多个分枝杆菌dna序列可以包括例如is6110元件和/或is900元件。
75.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，所述方法可以包括对所述一个或多个分枝杆菌dna序列进行测序，以及任选地确定所述分枝杆菌dna序列与已知的分枝杆菌dna序列之间的同源性。已知的分枝杆菌dna序列可以包括从公开的序列数据库中鉴定的序列，或者可以包括从受试者已知或疑似接触过的tb感染个体鉴定的dna序列。
76.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，所述受试者可以是人类受试者。在根据本发明的任何方面的一个实施例中，所述受试者可以是如但不限于非人灵长类动物、类人猿或人类等哺乳动物。在根据本发明的任何方面的一个实施例中，所述受试者可以选自以下中的至少一种：无症状受试者和/或tb接触受试者。在根据本发明的任何方面的一个实施例中，所述受试者可以选自以下中的至少一种：无症状人类受试者和/或tb接触人类受试者。无症状受试者意指未表现出通常用于确诊活动性结核病的任何症状的任何受试者。此类症状可以通过临床或放射学评估来确定。另外，所述受试者可以通过痰涂片显微镜检查和/或分枝杆菌培养给出阴性测试结果。tb接触受试者意指与另一已知或疑似患有结核病感染的个体接触的任何受试者。tb接触受试者可以通过tb接触追踪来确定。
77.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，所述受试者可能免疫功能低下和/或受到免疫抑制。可以将免疫功能低下和免疫抑制两者均视为免疫缺陷状态。受试者的免疫功能低下可能由直接或间接引起免疫抑制的疾病引起。此类疾病的实例包含特定癌症(例如，白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓癌、血细胞癌)；例如由人类免疫缺陷病毒(hiv)感染而引起的获得性免疫缺陷综合征(aids)等慢性感染；以及包含贫血、甲状腺功能减退症和高血糖症的各种激素和代谢紊乱。在一个实施例中，所述受试者可能感染了hiv。受试者
的免疫抑制也可能由以下引起：营养不良；衰老；免疫抑制剂、药物或免疫抑制剂(例如，化学疗法、疾病修饰抗风湿药物(dmard))的施用；施用于与器官移植相关的免疫抑制药物(抗排斥药物)；包含皮质类固醇(例如，糖皮质激素)的类固醇；暴露于环境毒素；或酒精、非法药物或尼古丁的滥用。在一个实施例中，所述受试者可能正在服用或已经服用免疫抑制药物，特别是选自由以下组成的组的一种或多种药物：化学疗法、dmard、抗排斥药物和糖皮质激素。
78.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，所述受试者可以是tb接触受试者，并且适当地所述方法是在所述受试者与tb感染个体接触12个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月或1个月内对从所述受试者体内获得的pbmc样品执行的。
79.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，噬菌体可以是(霉菌)噬菌体d29或tm4，优选地d29。适于使分枝杆菌裂解的其它噬菌体对于本领域技术人员将是已知的，例如参见hatfull gf.(2018)《分枝杆菌噬菌体微生物学光谱(mycobacteriophages.microbiol spectr.)》2018；6(5):10.1128/microbiolspec.gpp3-0026-2018.doi:10.1128/microbiolspec.gpp3-0026-2018。
80.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，在允许分枝杆菌裂解的条件下温育所述混合物可以包括在大约37℃下温育持续大约或少于6小时、5小时、4小时、3.5小时、3小时、2.5小时、2小时、1.5小时或1小时，优选地持续大约3.5小时。
81.在根据本发明的任何方面的一个实施例中，所述任选的cmi应答测试可以包括干扰素-γ释放测定(igra)测试。合适的igra测试的一个实例是quantiferon-tb gold plus((qft)凯杰公司(qiagen inc))测定。其它分枝杆菌特异性cmi应答测试是本领域技术人员已知的。
82.鉴于本公开，本发明的各个另外的方面和实施例对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
83.本说明书中所引用的所有文档以全文引用的方式并入本文中。
84.本文使用的“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下明确公开了两个指定特征或组分中的每一个。例如，“a和/或b”将被视为明确地公开了(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一种，就像本文单独列出的每一种情况一样。
85.除非上下文另外指出，否则以上列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施例并且同等地适用于所描述的所有方面和实施例。
86.本领域技术人员将进一步理解，虽然本发明已经参考若干实施例通过举例的方式进行了描述。但是不限于所公开的实施例，并且在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下可以构造替代性实施例。
87.除非特别说明，否则包括步骤的过程可以以任何合适的顺序执行。因此，可以以任何适当的顺序执行步骤。
88.可以使用已知的方法测量序列同源性。例如，uwgcg包提供了可以用于计算同源性(例如，根据其默认设置使用)的bestfit程序(devereux等人,(1984)《核酸研究(nucleic acids research)》12,387-395)。pileup和blast算法可以用于计算同源性或对序列进行排序(通常根据其默认设置)，例如，如altschul s.f.(1993)《分子演化杂志(j mol evol)》36:290-300；altschul,s,f等人(1990)《分子生物学杂志(j mol biol)》215:403-10中所
report:development of a target product profile(tpp)and a framework for evaluation for a test for predicting progression from tuberculosis infection to active disease).日内瓦：世界卫生组织；2017(who/htm/tb/2017.18))。
95.先前可用的诊断测试不够灵敏或不具有特异性，无法确保准确鉴定所有ltbi病例。此外，这些测试很难预测患有ltbi的个体将来是否会进展为活动性tb(即，所述个体是否患有初期tb)。这转化为需要治疗以预防一个活动性tb病例的大量个体，并且如此进一步阻碍了tb规划管理的扩大。
96.先前采用的如干扰素-γ(ifn-γ)释放测定(igra)或结核菌素皮肤测试(tst，例如，芒图测试)等ltbi诊断测试测量了t细胞对结核分枝杆菌的应答，并且因此间接证明了结核分枝杆菌暴露。根据定义，依赖于患者免疫应答的测试在诱导可测量的t细胞应答之前可能不会产生结果，这种应答需要时间来发展(感染后至少6周)。由此导致的诊断延迟使在诊断前的细菌复制时间更长，并且因此，在治疗可以开始之前，会导致患者预后下降，并增加社区内传播的可能性。另外，这种免疫记忆应答在衰老、免疫功能低下或受到免疫抑制的患者中会降低，由此导致测试结果不准确(假阴性或不确定)。例如，接受免疫抑制剂的受试者可能出现假阴性tst结果(agarwal s.等人,2014,类固醇在类风湿性关节炎中降低阳性结核菌素皮肤测试的患病率：对抗tnf疗法的影响(steroids decrease prevalence of positive tuberculin skin test in rheumatoid arthritis:implications on anti-tnf therapies).《传染病的跨学科观点(interdisciplinary perspectives on infectious diseases)》,2014(5759):430134)或假阴性或未确定的igra结果(belliere和blancher,2017,quantiferon测试解释接受免疫抑制剂的患者：警报(quantiferon test interpretation in patients receiving immunosuppressive agents:an alert).《欧洲呼吸杂志(european respiratory journal)》2017年4月,49(4)1602102；doi:10.1183/13993003.02102-2016)。基于对mtb的免疫应答的测试也存在将感染已被免疫系统有效清除的那些个体或先前已针对mtb进行疫苗接种的那些个体(假阳性)错误鉴定为有风险患上活动性tb病的可能性。已有研究表明，结核菌素皮肤测试和干扰素-γ释放测定预测两年内活动性tb病发生的阳性预测值分别为1.5％和2.7％(共识会议报告：针对用于预测从结核病感染到活动性疾病的进展的测试开发目标产物概况(tpp)和用于评估的框架.日内瓦：世界卫生组织；2017(who/htm/tb/2017.18))。
97.此外，当前的测试方法具有操作要求，这使得其在远程位置或那些因tb导致最大挑战的国家中的使用不切实际或成本过于高昂。另外，一些tb诊断测试需要受试者产生痰，这在无症状个体中通常是不可能的。
98.初期tb
99.初期tb描述了最近公认的个体无症状的结核病分类，但与ltbi个体相比，其特征在于在没有进一步干预的情况下进展为活动性tb的风险增加。患有初期tb的个体尚未患上与活动性tb一致的诱导性临床症状、放射学异常或微生物学证据(drain,p等人.2018.初期和亚临床结核病：感染早期和进展的临床评论(incipient and subclinical tuberculosis:a clinical review of early stages and progression of infection).《临床微生物学评论(clin microbio rev.)》,31(5):e00021-18)。早期疾病的无症状阶段可能会延长，而在此期间病理学在活动性疾病的临床表现之前发生变化，这一假设现在已
被广泛接受。这种状态鉴定了初期结核病。一些患有初期结核病的个体可能在12个月或更长的时间内不会进展为活动性疾病。
100.迄今为止，对初期结核病的诊断一直具有挑战性的，因为尚无令人满意的针对这种疾病状态的阳性测试可将其与潜伏性tb(ltbi；无症状tb，由于免疫系统的有效清除或遏制而不太可能患上活动性tb)区别。传统上，初期tb的诊断依赖于如igra等通常与ltbi相关的测试阳性，与以下组合来观察：最初不存在临床或放射学症状，然后替代为存在一种或多种临床或放射学症状，或随着患上活动性tb，微生物测试结果阳性。这意味着初期tb通常只能在活动性tb症状已经出现后，事后才能诊断出来。这种在患上活动性tb病症状之前无法区分初期tb和ltbi可能导致对不太可能患上活动性tb的个体(即，那些患有ltbi而非初期tb的个体)进行不必要的治疗，和/或可能延迟对患有初期tb的患者的治疗，这意味着增加了这些患者的传播可能性并降低了预后。
101.ltbi测试
102.干扰素-γ释放测定
103.干扰素-γ(干扰素-γ)释放测定(igra)是细胞介导的免疫(cmi)应答测试的实例，并且是用于诊断一些传染病，尤其是结核病的测试。干扰素-γ(ifn-γ)释放测定依赖于t淋巴细胞在暴露于特异性抗原时将释放ifn-γ的事实。
104.ifn-γ测定的一个实例是quantiferon-tb gold plus((qft)凯杰公司)测定，所述测定对响应于来自结核分枝杆菌的esat-6和cfp-10抗原而产生的ifn-γ量进行定量。结果报告为elisa吸光度或经计算的ifn-γ水平，单位为iu/ml。
105.igra的另一个实例是t-spot.tb测定(牛津免疫技术公司(oxford immunotec))，所述测定是对用esat-6和cfp-10肽温育的外周血单核细胞进行的酶联免疫吸附点(elispot)测定。结果报告为产生ifn-γ的t细胞的数量。如果tb抗原孔中的斑点计数超过相对于阴性对照孔的具体阈值，则个体被认为结核分枝杆菌感染呈阳性。
106.芒图结核菌素皮肤测试
107.芒图测试(结核菌素皮肤测试；ppd测试)是用于依赖于针对皮内注射结核菌素的免疫记忆应答筛查tb感染的工具，所述结核菌素是源自结核分枝杆菌培养物的甘油提取物。先前感染致敏的t细胞被募集到释放淋巴因子所在的皮肤位点，从而在48-72小时后诱导直径为6到10mm的硬结(不连续的发白的皮肤隆起)。
108.目前采用的针对结核分枝杆菌感染的ltbi测试(如干扰素-γ释放测定或结核菌素皮肤测试)作为初期tb测试(itt)是不完善的，有以下三个主要原因：
109.1.其间接测量结核分枝杆菌感染；即，其测量了t细胞对结核分枝杆菌的应答。这是mtb感染后的延迟应答(在人类中发展可能需要约6周)，这意味着在对最近感染的个体进行阳性测试时，细菌将有时间进行复制，由此降低对个体的预后并增加传播给其他人的可能性。此外，这些间接测试无法在接种疫苗、先前感染与当前感染的个体之间进行区分。
110.2.所述测试对群体中某些亚群不灵敏。免疫应答较弱的个体，如老年个体、免疫功能低下的个体(如hiv感染者)或服用免疫抑制药物的个体等产生t细胞应答的能力将降低，并且因此，即使其感染了结核分枝杆菌也不太可能产生阳性测试结果。
111.3.ltbi测试无法预测个体将来是否会进展为活动性tb。
112.who已经提出了对临床上有用的初期tb测试(itt)共识会议报告：针对用于预测从
结核病感染到活动性疾病的进展的测试开发目标产物概况(tpp)和用于评估的框架.日内瓦：世界卫生组织；2017(who/htm/tb/2017.18)。这些表明，此类测试应被认为是现行测试，其中阴性结果提供的信息有限，但阳性结果表明可能患上活动性tb病。itt将理想地用于筛选近期暴露于mtb，如感染性结核病患者的接触者(tb接触者)的那些人。tb接触追踪是用于阻止tb在社区传播的过程。其涉及发现并告知感染者曾接触过(tb接触者)的人，使得其可以在必要时接受咨询、测试和治疗。理想的itt应具有可扩大接触追踪策略以促进大规模测试和治疗活动的特性。
113.理想的初期tb测试的特性：
114.●
在从未暴露于tb的个体中呈阴性，包含可能有其它(呼吸道)疾病症状但有替代性诊断的个体。
115.●
在感染mtb但未患初期tb的个体中呈阴性。其可能患有持续性tb感染，即，ltbi测试(tst或igra)呈阳性，但在接下来的2年内不会患上tb病。
116.●
在已经接受ltbi治疗的个体中呈阴性。
117.●
在完成测试后的短时间段(例如，2年)内患上tb并且在执行测试后没有任何再次暴露迹象的个体中呈阳性。
118.●
在有症状的tb病患者中呈阳性。
119.●
在完成tb治疗并被认为痊愈的个体中呈阴性。
120.who定义了初期tb测试的操作特性：
[0121][0122][0123]
本发明人开发了一种使用噬菌体与dna扩增的组合(噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定)检测体液中的活分枝杆菌的方法，所述方法先前已经在wo2015049516中描述，并且已证明了其显示出感染的牛的血液中的低级别牛分枝杆菌菌血症(每毫升少于102个细胞)的效用(swift bm等人,使用噬菌体-rpa检测到皮内皮肤测试阳性牛中的结核分枝杆菌复合群菌血症的证据(evidence of mycobacterium tuberculosis complex bacteraemia in intradermal skin test positive cattle detected using phage-rpa).《病毒性(virulence)》2016；7(7):779-88)。
[0124]
噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定方法(actiphage
tm
)目前已适用于检测人类mtb感染。本文描述了将高度灵敏的噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定actiphage
tm
方法应用于充分表征的临床队列的概念验证研究的结果。与目前采用的ltbi测试相比，本文所描述的初期tb检测方法具有多种优势，包含增加了针对可能患上活动性tb病的患者的特异性(当疾病不存在时测试结果为阴性的可能性)和灵敏度(当疾病不存在时测试结果将为阳性的可能性)，改进了假阳性报告，提高了获得结果的速度(少于24小时)，并且不需要冷链运输。根据who为理想的初期tb测试定义的特性，这些都是极为有利的属性。
[0125]
描述了在检测患有初期tb的人类受试者时公开的方法的早期诊断潜力，所述受试者即那些有风险患上活动性tb病的无症状个体(包含那些先前可能已经被鉴定为患有ltbi的个体)。已证明，在早期感染期间初期人类tb与血液中的活分枝杆菌(例如，mtb菌血症)相关并且可以通过检测其来鉴定。
[0126]
tb相关mtb菌血症的证据尚不清楚，即使在检测活动性tb期间也是如此。先前对患有活动性tb的患者的血液样品应用培养和核酸扩增测试(naat)的研究结果令人失望(shenai s.等人,使用genexpert mtb/rif测定探索用于诊断hiv阴性患者的结核病的替代性生物材料(exploring alternative biomaterials for diagnosis of pulmonary tuberculosis in hiv-negative patients by use of the genexpert mtb/rif assay).《临床微生物学杂志(j clin microbiol)》2013；51(12):4161-6)。据报道，针对严重程度更高的活动性tb病和以下对更高血量的分析，mtb检测得到了改进，这表明这些方法受限于不足的灵敏度。与结核病感染的早期无症状阶段期间(即，在与感染的个体接触/感染后不久)相比，活动性tb病期间的mtb血滴度预期显著较高，因此，出乎意料的是，对血液中的活mtb的测试应该是初期tb的有效决定因素或继发活动性tb病的预后因素。不希望受任何特定理论的束缚，本发明人假设循环pbmc内的胞内mtb dna的相对不可接近性是其它mtb检测方法灵敏度不足的重要促成因素。本文所描述的方法通过噬菌体介导的胞内mtb裂解克服了这一点，由此在第二步中高效地释放细菌dna以进行灵敏的naat。本文所描述的方法提供了惊人的优势，即，即使受试者在tb感染早期，其中，在血液中循环分枝杆菌滴度可能非常低，也可以被有效地鉴定。在没有痰的情况下，提供阳性微生物诊断的快速低成本测定具有显而易见的优势。
[0127]
实例
[0128]
实例1：
[0129]
根据以下标准将hiv血清阴性成年患者(年龄≥18岁)募集到4个组中(另外的数据参见表1)：
[0130]
1.活动性tb病(肺tb；ptb)——在支持临床和放射学疾病特性的患者中，基于阳性xpert-ultra(xpert mtb/rif ultra，cepheid公司)或来自呼吸道样品的mtb培养物(n＝15)
[0131]
2.在接触追踪时鉴定的近期无症状ptb接触者，其中quantiferon-tb免疫加强((qft)凯杰公司)测试呈阳性，并且胸部x光片检查正常(n＝18)
[0132]
3.非tb急性呼吸道疾病对照组——最初转诊到tb服务机构的患者，其症状表明疑似ptb，但随后被确诊为非tb病，并通过mtb微生物检测确认为阴性(n＝5)
[0133]
4.健康对照组—先前无tb接触史的无症状和qft阴性参与者(n＝28)
[0134]
所有参与者均提供了进行actiphage
tm
噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定的血液样品，所述测定在招募时检测活分枝杆菌菌血症，并且所述参与者均接受了12个月的前瞻性临床随访。另外，第2组在8-12周后重复进行qft和actiphage
tm
测试以捕获igra(qft)血清转化事件(那些通过qft在第一时间点时测试为阴性但在第二时间点时为阳性的参与者，推测是因为延迟的t细胞应答/延迟的ifn-γ可检测性)。如果在第二时间点时呈qft阳性，则第2组参与者将保留在研究中；这些参与者均没有接受化学预防。在开始抗结核治疗之前，对活动性ptb患者(第1组)进行采样。
[0135]
在研究结束之前，临床和实验室团队分别对actiphage
tm
噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定测试的结果和样品来源的研究组不知情。伦理批准由区域研究和伦理委员会(rec 15/em/0109)提供，并且所有参与者在纳入时均提供了书面知情同意书。
[0136]
根据制造商说明书进行qft和xpert-ultra测试，并根据标准方法进行mtb培养。阴性mtb培养结果意指在8周温育期后没有发生细菌生长。
[0137]
图1和2(分别在基线时和3个月时)展示了被确定为近期无症状ptb接触者(第2组)的参与者的qft elisa数据。
[0138]
对于噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定(actiphage
tm
)测试，将血液(5ml)收集到肝素钠管(sarstedt)中并在室温下储存直至处理。根据制造商的说明书，通过以下两种替代性方法中的一种从2ml血液试样中分离pbmc：i.使用leucosep管(西格玛公司(sigma))的ficoll-paque plus(通用电气医疗集团(ge healthcare))以及ii.hetasep(干细胞技术)。
[0139]
将pbmc重悬于200μl actiphage
tm
培养基中并且然后将样品转移到actiphage
tm
快速管(pbd生物科技有限公司)并添加噬菌体d29(20μl；约107pfu)。将样品在37℃下温育3.5小时，并且然后离心(13,000xg；3分钟，室温)。将来自快速管的含有释放的分枝杆菌dna的流通进一步浓缩(zymo dna清洁和浓缩器-5；齐莫研究公司(zymo research)/坎布里奇生物科学公司(cambridge bioscience))，并且使用生成123bp pcr产物的正向引物5'-cctgcgagcgtaggcgtcgg-3'和反向引物5'-ctcgtccagcgccgcttcgg-3'使用对is6110元件具有的pcr测定来检测mtb dna(eisenach等人,使用聚合酶链反应检测痰样品中的结核分枝杆菌(detection of mycobacterium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction).《美国呼吸疾病评论(am rev respir dis.)》1991年11月；144(5):1160-3)。
[0140]
这项研究招募了六十六名参与者(表1)。在患有活动性ptb的15名参与者(第1组)中，一名有粟粒状疾病的证据，并伴有单个脑结核瘤。对于第1组的其余参与者，均无多器官受累的放射学或临床特征。在第2组的18名参与者中，有一人进行了qft血清转化并进行了一系列测试。其余人在两个时间点时均呈qft阳性，并且胸部放射科医师报告所有胸部x光片均正常。患有非tb急性呼吸道疾病的对照组(第3组)的所有五名参与者均通过支气管镜检查排除了ptb，并使用抗生素有效治疗了社区获得性肺炎。
[0141]
表1显示，15名(73％)活动性ptb队列(第1组)中的11名和18名无症状tb接触参与者(第2组)中的3名给出了阳性actiphage
tm
噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定测试结果(这些人的参与者编号为455、493和494)。其余4名第1组参与者、15名第2组参与者以及两个对照组(第3组和第4组)的所有参与者均给出了阴性actiphage
tm
噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定测试结果。
[0142]
图3示出了当使用对分枝杆菌is6110元件具有特异性的引物时，其中一名第2组参与者(分配的参与者编号为455)的预期大小(123bp)的阳性pcr带。
[0143]
所有研究参与者还进行了c反应蛋白(crp)水平测试，以确定炎症的存在。另外，通过痰涂片显微镜检查、通过xpert-ultra测试以及通过测量来自呼吸道样品的分枝杆菌培养物呈阳性的天数，还对第1组、第3组的所有参与者和第2组的actiphage-阳性参与者进行了测试。
[0144]
在ptb队列(第1组，活动性tb病)中，阳性actiphage
tm
噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定结果与痰涂片阳性、较高的基线crp和较短的分枝杆菌培养时间相关。在无症状tb接触组(第2组)中，参与者的基线crp正常(处于与健康对照组的范围类似的范围内)，并且在基线时无法形成分枝杆菌培养物(即，在温育8周后未检测到细菌生长)。在第2组中的在基线时鉴定的3名actiphage
tm-阳性参与者中，两名在7个月后患上活动性培养物呈阳性的ptb病。在就诊时缺乏tb的临床、放射学和微生物学证据与在稍后时间点时患上活动性疾病的组合与初期tb的诊断一致。这证明了噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定在初期tb诊断中的效用，以及其区分初期tb患者与ltbi患者的能力。来自后来患上活动性tb的两名第2组病例的mtb分离菌的全基因组序列分析从其相应的索引病例中确认了细菌来源。三名actiphage
tm-阳性第2组受试者出现qft血清转化(即，在第一次测试中qft结果为阴性，然后在3个月后为阳性)，但在研究时间范围内(12个月)没有患上活动性tb。在12个月的随访后，第2组中没有actiphage
tm-阴性参与者患上活动性tb。因此，噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定似乎不会在第2组队列中产生任何假阴性活动性tb结果，证明其对初期tb是有效的测试。另外，使用噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定(actiphage
tm
)检测呈阴性并通过qft测试呈阳性的那些无症状病例可以被认为具有潜伏性tb感染(即，患上活动性tb病的风险低)，这比单独进行qft测试的置信度更高。
[0145]
作为在基线时对疑似活动性ptb的有症状患者(即，第1组和第3组)的临床诊断，噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定(actiphage
tm
快速测试)的灵敏度和特异性(95％ci)分别为73.3％(48.1-89.1)和100％(56.6-100)。
[0146]
作为在基线时对无症状患者(即，第2组和第4组)中的初期tb(患上活动性tb的风险较高)的临床诊断，噬菌体介导的分枝杆菌dna释放测定(actiphage
tm
快速测试)的灵敏度和特异性(95％ci)分别为100.0％(15.8-100.0)和97.3％(88.0-99.9)。
[0147]
当在基线时应用于整个队列(所有组)时，针对检测活动性ptb的灵敏度和特异性(95％ci)分别为73.3％(48.1-89.1)和94.2％(84.1-98.4)。
[0148][0149][0150]
表1这项研究中所有受试者的人口统计学特性和临床特性。(bcg，卡介苗(bacillus calmette-gu
é
rin)；tb，结核病；bmi，身体质量指数；crp，c反应蛋白；s.aureus，金黄色葡萄球菌；m.avium，鸟分枝杆菌)。
*
所展示的数据是就诊时(即，基线后7个月时)，两个接触者中患有活动性(培养物呈阳性)tb，
^
crp值是指在基线时收集的与其它组的数据一致的数据，
$
由已知bcg状态的亚组计算得出的百分比。