用于具有pH5-12的制剂的甘露聚糖酶的制作方法

用于具有ph 5-12的制剂的甘露聚糖酶
1.发明描述
2.半纤维素和半乳甘露聚糖的主要作用是充当结构性多糖和/或充当储备能量。除作为植物中最广泛的储备多糖的直链淀粉和支链淀粉之外，各种植物的种子、根、鳞茎和块茎中存在多样的基于甘露聚糖的多糖类群。这些类群包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖。
3.甘露聚糖是具有β-1,4连接的d-吡喃甘露糖残基主链的多糖。在大多数情况下，甘露聚糖高度地不溶于水中。与未取代的甘露聚糖相反，半乳甘露聚糖为水溶性。归因于植物细胞壁的复杂结构性组成，依赖分解植物材料兴起的微生物必须拥有众多不同的能够水解这些高度聚合且大多不溶性物质的酶。两类参与半纤维素降解的主要内切作用酶是β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶。另外，需要外切作用酶β-甘露糖苷酶、α-半乳糖苷酶和β-葡糖苷酶以完全降解半乳葡甘露聚糖。
4.参与甘露聚糖主链降解的主要酶类型是水解甘露聚糖主链中内部糖苷键的内切-1,4-β-甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)。内切-1,4-β-甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)是本文中也称为内切-β-1,4-d-甘露聚糖酶、β-甘露聚糖酶或甘露聚糖酶的甘露聚糖降解酶。由于内切-1,4-β-甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)降解甘露聚糖主链，故甘露聚糖降解包括降解甘露聚糖、半乳甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。
5.甘露聚糖酶类广泛用于食物与饲料应用、洗涤剂和纸浆与造纸业：
6.·
已经显示使用甘露聚糖酶作为饲料添加剂提供若干有益作用，原因是对于单胃动物如家禽和猪而言，甘露聚糖是充当抗营养因子的主要不可消化饲料组分。
7.·
在食品业中，描述甘露聚糖酶用于速溶咖啡生产，其中酶降低咖啡提取物因水解咖啡甘露聚糖所致的粘度。另外，甘露聚糖酶用来产生作为功能性食品成分令人感兴趣的特定甘露糖低聚物，如具有益生元功能的甘露糖低聚物。在这类应用中，将植物衍生的甘露糖聚合物用甘露聚糖酶水解。
8.·
洗涤剂用途：甘露聚糖酶促进移除食物衍生和化妆品衍生的污渍/污垢，后者经常包括含有甘露聚糖的添加物如稳定剂、乳化剂和增稠剂。在更特殊的清洁应用中，应用甘露聚糖酶从需要无微生物的表面或管件(如制药设备)移除生物膜。在这样的应用中，甘露聚糖酶经常与洗涤剂和其他酶如糖酶和蛋白酶组合使用。
9.·
纸浆和纸：甘露聚糖酶用于纸浆的酶助漂白中。甘露聚糖酶据称弥补木聚糖酶的作用。
10.·
甘露聚糖酶应用于借助水力压裂的石油和天然气井增产过程中。甘露聚糖酶降低用于该过程中的瓜尔豆溶液的粘度。
11.·
甘露聚糖酶用于从交联型半乳甘露聚糖组成的基质中控释药物或其他材料。
12.在应用条件下的活性是许多工业用酶的关键参数，因为这些酶在应用条件下经常倾向于活性不足。
13.持续需要在洗涤剂制剂苛刻的环境下发挥作用的酶。已知不同类别的酶可用于洗涤剂制剂中，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酸盐裂合酶和核酸酶。
research，67(1)，213-221中描述那样，使用remazol亮蓝染色的角豆半乳甘露聚糖在液体测定法中测试甘露聚糖降解活性。另一种测试甘露聚糖降解活性的方法利用与底物(如瓜尔胶或刺槐豆胶)温育时对还原型糖的检测
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参考文献参见miller，g.l.use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars(使用二硝基水杨酸试剂测定还原型糖).analytical chemistry 1959；31，426
–
428。
24.酶是通常依据多肽序列(本文中也称为氨基酸序列)鉴定的多肽。通常用seq id no鉴定多肽序列。根据世界知识产权组织(wipo)标准st.25(1998)，使用三字母代码代表本文的氨基酸，其中首字母为大写或相应的一个字母。
25.在一个方面，多肽由多核苷酸编码。根据世界知识产权组织(wipo)标准st.25(1998)，通常依据多核苷酸序列和seq id no.鉴定多核苷酸。
[0026]“亲本”多肽氨基酸序列是起始序列，向该起始序列引入突变(例如通过引入一个或多个氨基酸置换、插入、缺失或其组合)，产生亲本多肽氨基酸序列之“变体”。亲本包括：作为引入(其他)变化的起始序列使用的野生型多肽氨基酸序列或合成生成的多肽氨基酸序列。
[0027]
本发明甘露聚糖酶的亲本多肽具有根据seq id no:1的多肽序列。在本发明的一个方面，亲本多肽具有根据seq id no:1的位置29-324的序列。
[0028]“变体多肽”指在氨基酸序列方面不同于其亲本的酶。
[0029]
在一个实施方案中，变体多肽序列依据与亲本序列相比时它们的“序列同一性”定义。“与seq id no:x至少x％同一”的酶或多肽意指与根据seq id no:x的多肽序列相比时具有x％同一的多肽序列的酶或多肽。
[0030]
在一个实施方案中，变体多肽序列定义为由特定多核苷酸(序列)编码。在一个方面，多核苷酸序列作为多核苷酸序列提供。“与seq id no:y至少y％同一”的多核苷酸意指与根据seq id no:y的多核苷酸序列相比时具有y％同一的多核苷酸序列的多核苷酸。
[0031]
序列同一性通常作为“％序列同一性”或“％同一性”提供。为了计算序列同一性，在第一步骤中必须生成序列比对结果。
[0032]
根据本发明，通过使用needleman和wunsch算法(j.mol.biol.(1979)48，第443-453页)生成比对结果。优选地，出于本发明目的，使用程序“needle”(欧洲分子生物学开放软件套件(the european molecular biology open software suite)(emboss))，同时使用程序的默认参数(多核苷酸：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5并且矩阵＝ednafull；多肽：空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5并且矩阵＝eblosum62)。
[0033]
在比对两个序列后，在第二步骤中，从产生的比对结果确定同一性值。
[0034]
本文中，通过相同残基数目除以在其整个长度范围内显示两个已对齐序列的比对区域的长度，乘以100来计算％同一性：％同一性＝(相同残基/在其整个长度范围内显示两个对齐序列的比对区域的长度)*100。
[0035]
本发明的甘露聚糖酶与seq id no:1至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一，优选地与seq id no:1的全长氨基酸序列相比时如此。在本发明的一个方面，本发明的甘露聚糖酶与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、
至少98％或至少99％同一，优选地与seq id no:1的位置29-324的全长氨基酸序列相比时如此。
[0036]
甘露聚糖酶可以进一步包含一个或多个保守性置换，这意指将一个氨基酸用相似的氨基酸置换。本发明的相似氨基酸如下定义：氨基酸a相似于氨基酸s；氨基酸d相似于氨基酸e和n；氨基酸e相似于氨基酸d、k和q；氨基酸f相似于氨基酸w和y；氨基酸h相似于氨基酸n和y；氨基酸i相似于氨基酸l、m和v；氨基酸k相似于氨基酸e、q和r；氨基酸l相似于氨基酸i、m和v；氨基酸m相似于氨基酸i、l和v；氨基酸n相似于氨基酸d、h和s；氨基酸q相似于氨基酸e、k和r；氨基酸r相似于氨基酸k和q；氨基酸s相似于氨基酸a、n和t；氨基酸t相似于氨基酸s；氨基酸v相似于氨基酸i、l和m；氨基酸w相似于氨基酸f和y；氨基酸y相似于氨基酸f、h和w。
[0037]
本发明的甘露聚糖酶是“成熟多肽”，意指处于其最终形式的包含任何翻译后修饰、糖基化、磷酸化、截短作用、n端修饰、c端修饰、信号序列缺失的酶。成熟多肽可以取决于表达系统、载体、启动子和/或生产工艺变动。本发明的成熟甘露聚糖酶优选地与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一。
[0038]
本发明的甘露聚糖酶在5-12范围、优选地6-11范围、更优选地选自6-10、7-9、7-12、8-12、8-10和7.5-8.5范围的ph具有甘露聚糖降解活性。在一个实施方案中，本发明的甘露聚糖酶在具有5-12范围、优选地6-11范围、更优选地选自6-10、7-9、7-12、8-12、8-10和7.5-8.5范围ph的洗涤剂制剂中具有甘露聚糖降解活性。
[0039]
本发明的甘露聚糖酶在选自≤60℃、≤40℃和≤25℃的温度具有甘露聚糖降解活性。优选地，温度是洗涤或清洁温度。
[0040]
本发明涉及编码甘露聚糖酶的多核苷酸，所述甘露聚糖酶与seq id no:1至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一。在本发明的一个方面，该多核苷酸编码与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的甘露聚糖酶。本发明的多核苷酸优选地具有与seq id no:2至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的序列。
[0041]
本发明涉及一种制备本文中的本发明甘露聚糖酶的方法，所述方法包括：提供编码本文所述多肽的核酸序列，将核酸序列转化入宿主细胞，培育宿主细胞以产生甘露聚糖酶，并且任选地从宿主细胞分离甘露聚糖酶，并且任选地纯化甘露聚糖酶。
[0042]
可以“表达”编码多肽的多核苷酸。术语“表达”或“基因表达”意指一个特定基因或多个特定基因或特定核酸构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或多个基因或基因构建体转录成结构性rna(例如，rrna、trna)或mrna，所述mrna随后翻译成或不翻译成蛋白质。该过程包括dna的转录和所得mrna产物的加工。
[0043]
本文中“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子从天然存在的基因分离或经修饰以原本在自然界中不存在的方式含有核酸区段，或是合成的，包含一个或多个控制序列。术语“控制序列”意指为表达编码本发明甘露聚糖酶的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列可以相对于编码变体的多核苷酸是天然或外来的，或彼此是天然或
外来的。这类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少地，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。控制序列可以配有接头，目的在于引入促进控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特定限制性位点。
[0044]
通常通过使用表达系统进行酶的工业生产。本文中“表达系统”意指宿主微生物、表达宿主、宿主细胞、生产生物、或生产株并且这些术语各自可以互换使用。在一个实施方案中，表达宿主选自：细菌表达系统、酵母表达系统、真菌表达系统和合成性表达系统。表达宿主包括野生型细胞或重组细胞，它优选地是重组细胞。本文中“野生型细胞”意指在某些修饰之前的细胞。术语“重组(宿主)细胞”(本文中也称为“基因修饰细胞”)指这样的细胞，所述细胞已经被遗传改变、修饰或工程化，从而如相比衍生该细胞的野生型细胞，显示出改变、修饰或不同的基因型。重组(宿主)细胞包含编码某种蛋白质或酶并且因此优选地表达所述蛋白质或酶的外源多核苷酸。
[0045]
在一个实施方案中，本发明涉及包含多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸编码如本文所述的甘露聚糖酶。宿主细胞可以是可用于重组产生变体(包括原核生物和真核生物)的任何细胞。
[0046]
在又一个实施方案中，本发明涉及一种表达多核苷酸的方法，所述方法包括步骤：(a)通过向宿主细胞引入包含编码本发明甘露聚糖酶的多核苷酸，提供包含异源核酸构建体的宿主细胞，所述异源核酸构建体包含编码本发明甘露聚糖酶的多核苷酸；(b)在导致表达多核苷酸的条件下培育步骤(a)的重组宿主细胞；并且(c)任选地，回收由多核苷酸编码的目的蛋白。
[0047]
表达宿主的示例包括但不限于：黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillus oryzae)、多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)、疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、异孢镰刀菌(fusarium heterosporum)、大肠杆菌(escherichia coli)、芽孢杆菌属(bacillus)，优选地枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)或地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、假单胞菌属(pseudomonas)，优选地荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(也称为法夫驹形氏酵母(komagataella phaffii))、嗜热毁丝霉(myceliopthora thermophila)(c1)、喜热梭孢壳(themothelomyces thermophilus)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、木霉属(trichoderma)，优选地里氏木霉(trichoderma reesei)和酵母属(saccharomyces)，优选地酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。可以使用源自上文所列微生物的宿主细胞产生本发明的甘露聚糖酶。
[0048]
在一个实施方案中，细菌表达系统选自大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)和链霉菌属(streptomyces)。在一个实施方案中，酵母表达系统选自假丝酵母属(candida)、毕赤酵母属(pichia)、酵母属(saccharomyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)。在一个实施方案中，真菌表达系统选自青霉属(penicillium)、曲霉属(aspergillus)、镰刀菌属(fusarium)、毁丝霉属(myceliopthora)、根毛霉属(rhizomucor)、根霉属(rhizopus)、嗜热真菌属(thermomyces)和木霉属(trichoderma)。
[0049]
优选地，本发明的重组宿主细胞是包括但不限于以下属的革兰氏阳性菌：芽孢杆菌属(bacillus)、梭菌属(clostridium)、肠球菌属(enterococcus)、地芽孢杆菌属(geobacillus)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(oceanobacillus)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)和链霉菌属(streptomyces)。更优选地，宿主细胞是芽孢杆菌细胞，更优选地选自嗜碱芽孢杆菌(bacillus alkalophius)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefacins)、短芽孢杆菌(bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(bacillus clausii)、凝固芽孢杆菌(bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)、bacillus jautus、迟缓芽孢杆菌(bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(baccillus thuringiensis)。最优选地，芽孢杆菌细胞选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌。在一个实施方案中，芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
[0050]
本发明提供用于产生发酵产物的发酵方法，所述方法包括步骤
[0051]
a)提供本发明的重组宿主细胞，并且
[0052]
b)在允许表达编码本发明甘露聚糖酶的多核苷酸的条件下培养重组宿主细胞。
[0053]
在多核苷酸和多肽的语境下，术语“异源”(或外源或外来或重组)在本文中定义为：
[0054]
(a)不是宿主细胞天然的；或
[0055]
(b)是宿主细胞天然的，但因通过改变天然序列的重组dna技术操作宿主细胞dna而包含结构性修饰，例如，缺失、取代和/或插入。
[0056]
在一个实施方案中，本发明涉及包含多核苷酸的基因构建体，所述多核苷酸编码如本发明的甘露聚糖酶。如本文所用的“基因构建体”或“表达盒”或“表达构建体”是一种dna分子，其由至少一个待表达的与一个或多个如本文所述的控制序列(至少与启动子)有效连接的本发明多核苷酸序列组成。一般地，表达盒包含三种元件：启动子序列、可读框和3'非翻译区，所述非翻译区在真核生物中通常含有聚腺苷酸化位点。额外的调节元件包括转录增强子以及翻译增强子。也可以将内含子序列添加至5'非翻译区(utr)或添加于编码序列中，以增加胞质溶胶中积累的成熟信使的量。表达盒是载体的部分或整合入宿主细胞的基因组并且随其宿主细胞的基因组一起复制。表达盒通常能够增加或减少表达。
[0057]
指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的例子是从解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢杆菌xyla和xylb基因、苏云金芽胞杆菌(bacillus thurigiensis)cryiiia基因(agaisse和lereclus，1994，molecular biology 13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(egon等人，1988，gene 69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂糖基因(daga)和原核β-内酰胺酶基因中获得的启动子(villa-kamaroff等人，1978，proc.natl.acad.sci usa 75:3727-3731)，以及tac启动子(daboer等人，1983，proc.natl.acad.sci usa 80:21-25)。其他的有用启动子在gilbert等人，1980，
scientific american 242:74-94的“useful proteins from recombinant bacteria(来自重组细菌的有用蛋白质)”中以及在sambrook，j.等人，1989，molecular cloning:a laboratory manual，2nd ed.，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny中描述。
[0058]
如本文所用的术语“载体”包含任何种类适合于携带外来多核苷酸序列用于转移至另一个细胞或用于在给定细胞中稳定表达或瞬时表达的构建体。如本文所用的术语“载体”涵盖任何种类的克隆载体，如但不限于质粒、噬菌粒、病毒载体(例如，噬菌体)、噬菌体、杆状病毒、粘粒、fosmid、人工染色体、或和任何其他对具体目的宿主特异的载体。还包括低拷贝数载体或高拷贝数载体。外来多核苷酸序列通常包含在本文中称作“目的基因”的编码序列。取决于来源或目的宿主细胞的种类，目的基因可以包含内含子和外显子。
[0059]
如本文所用的载体提供在转化入宿主细胞或宿主细胞细胞器时用于转录和翻译外来多核苷酸的区段。这类额外的区段包括调节性核苷酸序列、一个或多个为其在特定细胞类型中维持和/或复制所必备的复制起点、一个或多个可选标志物、聚腺苷酸化信号、用于插入外来编码序列的合适位点如多克隆位点等。一个实例是当需要将载体作为附加体遗传元件(例如质粒或粘粒分子)维持在细菌细胞中时。合适复制起点的非限制性实例包括f1-ori和cole1。载体在不整合至宿主细胞基因组中的情况下复制，例如作为细菌宿主细胞中的质粒，或它将其部分或全部dna整合入宿主细胞的基因组并且因此导致其dna的复制和表达。
[0060]
外来核酸可以借助克隆被引入载体。克隆可以意味着，通过用合适的手段和方法(例如，限制性酶)切割载体(例如在多克隆位点内部)和外来核酸，通常在各个核酸内部产生能够实现所述外来核酸和载体受控融合的匹配性构造物。包含编码序列的外来核酸一旦引入至载体中，可向宿主细胞或宿主细胞细胞器引入(转化、转导、转染等)该包含编码序列的外来核酸。克隆载体优选地适合在宿主细胞或宿主细胞细胞器中表达外来多核苷酸序列。
[0061]
如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括将外源性多核苷酸转移入宿主细胞，无论用于转化的方法是什么。即，如本文所用的术语“转化”独立于载体、穿梭系统或宿主细胞，并且它不仅涉及如本领域已知的多核苷酸转化转移方法(参见，例如，sambrook，j.等人(1989)molecular cloning:a laboratory manual，第2版，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny)，而且它涵盖任何其他种类的多核苷酸转移方法，例如但不限于转导或转染。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用基因构建体转化并且可以由此再生完整植物。所选的具体组织根据可用于并且最适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统而变化。在本发明的一个实施方案中，载体用于转化宿主细胞。
[0062]
可以将本发明的多核苷酸瞬时或稳定地引入宿主细胞，优选地芽孢杆菌，并且可以例如作为质粒维持为非整合。“稳定转化”意指转化的细胞或细胞器将包含外来编码序列的核酸传递给下一代细胞或细胞器。通常，稳定转化因包含外来编码序列的核酸整合入染色体或作为附加体(独立的核dna片段)所致。“瞬时转化”意指一旦被转化，则细胞或细胞器就持续某个时间
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大多在一个世代内表达外来核酸序列。通常，瞬时转化因包含外来核酸序列的核酸未整合入染色体或未作为附加体所致。备选地，它整合入宿主基因组。
[0063]
酶通常作为液体浓缩物产生，往往衍生自发酵液。本文中的“液体酶浓缩物”意指任何包含至少一种酶的液体含酶产物。酶浓缩物的语境下“液体”与20℃和101.3kpa时的物理外观有关。
[0064]
液体酶浓缩物可以因溶剂中溶解固体酶而产生。溶剂可以选自水和有机溶剂。因溶剂中溶解固体酶而产生的液体酶浓缩物包含高达饱和浓度的酶量。
[0065]
本文中溶解意指固态化合物因与至少一种溶剂接触而液化。溶解意指指定溶剂中固态化合物完全溶解直至实现饱和浓度，其中无相分离发生。
[0066]
在本发明的一个方面，酶浓缩物可以不含水，这意味着无明显量的水存在。本文中无明显量的水意指酶浓缩物包含按重量计少于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于7％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％的水，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言，或不含水。在一个实施方案中，不含水的酶浓缩物意指酶浓缩物不包含明显量的水，但以按重量计约10％至90％、按重量计20％至85％、按重量计30％-80％、按重量计40％至75％、按重量计50％至70％的量包含有机溶剂，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言。
[0067]
包含水的液体酶浓缩物可以称作“含水酶浓缩物”。在一个实施方案中，含水酶浓缩物是含酶溶液，其中固体酶产物溶解于水中。在一个实施方案中，“含水酶浓缩物”意指因发酵产生酶所致的含酶产物。
[0068]
发酵意指在允许重组宿主细胞生长并表达所需蛋白质的合适营养培养基中培养表达所需酶的重组细胞的过程。在发酵结束时，通常收集并进一步加工发酵液，其中发酵液包含液体级分和固体级分。取决于酶已经是否分泌入液体级分，从发酵液的液体级分或从细胞裂解物回收所需的蛋白质或酶。使用本领域技术人员已知的方法回收所需的酶。从发酵液回收蛋白质或酶的适合方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取和沉淀。
[0069]
液体酶浓缩物包含按重量计0.1％至40％、或按重量计0.5％至30％、或按重量计1％至25％、或按重量计3％至25％、或按重量计5％至25％范围的酶量，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言。在一个实施方案中，液体酶浓缩物因发酵产生并且是含水的。
[0070]
因发酵产生的含水酶浓缩物以按重量计多于约50％、按重量计多于约60％、按重量计多于约70％、或按重量计多于约80重量％的量包含水，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言。在一个实施方案中，因发酵产生的含水酶浓缩物以按重量计约50％至80％、或按重量计约60％至70％范围的量包含水，前述百分数均相对于酶浓缩物的总重量而言。因发酵产生的含水酶浓缩物可以包含残余组分如源自发酵培养基的盐、源自生产宿主细胞的细胞残片、发酵期间生产宿主细胞产生的代谢物。在一个实施方案中，残余组分以按重量计少于30％、按重量计少于20％、按重量计少于10％或按重量计少于5％的量包含于液体酶浓缩物中，前述百分数均相对于含水酶浓缩物的总重量而言。
[0071]
如果留在含水环境，则酶倾向于丧失酶活性并且从而按常规惯例使其它转化成无水形式：可以将含水浓缩物(例如在载体材料存在下)冻干或喷雾干燥，以形成聚集物。通常，固体酶产物需要在使用之前“溶解”。为了使酶在液体产物中稳定，通常使用酶抑制剂，优选地可逆性酶抑制剂，来短暂抑制酶活性直至释放酶抑制剂。
[0072]
本发明的酶制品优选地为液体。酶制品的语境下“液体”与20℃和101.3kpa时的物理外观有关。
[0073]
本发明的酶制品包含这样的液体酶浓缩物，其包含至少一种本发明的甘露聚糖酶。本发明的酶制品仅包含有效使酶制品或其中所含酶稳定的组分，例如，所述组分选自至少一种酶稳定剂、至少一种稳定液体酶制品本身的化合物和至少一种溶剂。
[0074]
在一个方面，本发明提供一种液体酶制品，其包含与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶、优选地与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶、至少一种稳定液体酶制品本身的化合物、至少一种溶剂和任选地至少一种酶稳定剂。
[0075]
本发明的液体酶制品优选地不含表面活性剂。不含表面活性剂意指相对于液体酶制品的总重量，按重量计少于约10％、按重量计少于约7％、按重量计少于约5％、按重量计少于约3％、按重量计少于约2％或按重量计少于约1％的表面活性剂包含于液体酶制品中。
[0076]
本发明的液体酶制品优选地不含络合剂。不含络合剂意指相对于液体酶制品的总重量，按重量计少于约10％、按重量计少于约7％、按重量计少于约5％、按重量计少于约3％、按重量计少于约2％或按重量计少于约1％的络合剂、优选地氨基羧酸酯包含于液体酶制品中。
[0077]
在一个实施方案中，本发明的液体酶制品不含表面活性剂且不含络合剂。
[0078]
使液体酶制品本身稳定的化合物
[0079]
使液体酶制品本身稳定的化合物意指除了酶稳定剂之外的任何化合物，其中以有效确保储存稳定性的量需要所述化合物以建立液体制剂的储存稳定性。
[0080]
液体制剂语境下对本领域技术人员而言的储存稳定性通常包括产品外观方面和剂量一致性方面。
[0081]
产品的外观受产品的ph并且受化合物如防腐剂、抗氧化剂、粘度调节剂、乳化剂等的存在影响。
[0082]
剂量的一致性通常与产物的同质性有关。
[0083]
本发明的酶制品呈碱性或显示出中性或略微酸性的ph值。酶制品具有5-12范围、优选地6-11范围、更优选地选自6-10、7-9、7-12、8-12、8-10和7.5-8.5范围的ph。
[0084]
在一个实施方案中，本发明的液体酶制品包含至少一种防腐剂。以有效预防微生物污染液体酶制品(优选地含水酶制品)的量添加防腐剂。
[0085]
合适防腐剂的非限制性实例包括(季)铵化合物、异噻唑啉酮、有机酸和甲醛释放剂。合适的(季)铵化合物的非限制性实例包括苯扎氯铵、聚六亚甲基双胍(phmb)、双癸基二甲基氯化铵(ddac)和n-(3-氨丙基)-n-十二烷基丙烷-1,3-二胺(二胺)。合适异噻唑啉酮的非限制性实例包括1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(bit)、2-甲基-2h-异噻唑-3-酮(mit)、5-氯-2-甲基-2h-异噻唑-3-酮(cit)、2-辛基-2h-异噻唑-3-酮(oit)和2-丁基-苯并[d]异噻唑-3-酮(bbit)。合适有机酸的非限制性实例包括苯甲酸、山梨酸、l-(+)-乳酸、甲酸和水杨酸。合适甲醛释放剂的非限制性实例包括n,n
′‑
亚甲基双吗啉(mbm)、2.2
′
,2
″‑
(六氢-1,3,5-三嗪-1,3,5-三基)三乙醇(hht)、(乙烯二氧基)二甲醇、α,α
′
,α
″‑
三甲基-1,3,5-三嗪-1,3,5(2h,4h,6h)-三乙醇(hpt)、3,3
′‑
亚甲基双[5-甲基噁唑啉](mbo)和顺-1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物(ctac)。
[0086]
其他的有用防腐剂包括丁基氨基甲酸碘代丙炔酯(ipbc)、释卤素化合物如二氯-二甲基-乙内酰脲(dcdmh)、溴-氯-二甲基-乙内酰脲(bcdmh)和二溴-二甲基-乙内酰脲(dbdmh)；溴-硝基化合物如溴硝丙二醇(2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇)、2,2-二溴-2-氰基乙
酰胺(dbnpa)；醛类如戊二醛；苯氧乙醇；联苯基-2-醇；和2-巯基吡啶氧化锌或钠。
[0087]
本发明的液体酶制品优选地包含至少一种防腐剂，所述防腐剂选自2-苯氧乙醇、戊二醛、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇和处于酸形式或作为其盐的甲酸，和4,4
’‑
二氯2-羟二苯醚。通常，本发明的液体酶制品以范围从2ppm至相对于液体酶制品的总重量而言以重量计5％的量包含至少一种防腐剂。更优选地，液体酶制品不含防腐剂，这意指以小于1ppm包含防腐剂。
[0088]
溶剂
[0089]
在一个实施方案中，本发明的酶制品是含水的，以按重量计5％至95％范围、按重量计5％至30％范围、按重量计5％至25％范围、按重量计30％至80％范围、或按重量计20％至70％范围的量包含水，前述百分数均相对于酶制品的总重量而言。
[0090]
在一个实施方案中、本发明的酶制品包含至少一种选自以下的有机溶剂：乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、丁二醇、甘油、二甘醇、丙基二甘醇、丁基二乙二醇、亚己基二醇、乙二醇甲醚、乙二醇乙醚、乙二醇丙醚、和苯氧乙醇，优选乙醇、异丙醇或丙二醇。另外，本发明的酶制品可以包含至少一种选自化合物如2-丁氧基乙醇、异丙醇和d-苧烯的有机溶剂。
[0091]
在一个优选的实施方案中，本发明的酶制品包含至少一种水可溶混性有机溶剂。水可溶混性在这种语境下意指有机溶剂在水中以全部比例混合，形成均匀溶液的性能。优选地，至少一种水可溶混溶剂选自乙醇、异丙醇或1,2-丙二醇。
[0092]
在一个实施方案中，酶制品包含
[0093]
(a)范围约20％至50％的水量，以及
[0094]
(b)按重量计30％至60％范围或按重量计45％至55％范围的至少一种有机溶剂量，前述百分数均相对于酶制品的总重量而言。
[0095]
在一个实施方案中，酶制品以相对于酶制品的总重量而言，按重量计0％至20％范围的量包含有机溶剂。优选地，酶制品包含按重量计约30％至80％范围的水量并且以按重量计少于10％、按重量计少于5％、或按重量计少于1％的量包含至少一种有机溶剂，前述百分数均相对于酶制品的总重量而言。
[0096]
在一个实施方案中，酶制品以按重量计5％至15％范围的量包含水并且包含不明显量(例如按重量计1％或更少)的有机溶剂，前述百分数均相对于酶制品的总重量而言。
[0097]
酶稳定剂
[0098]
使酶稳定涉及随时间推移的稳定性(例如储存稳定性)、热稳定性、ph稳定性和化学稳定性。本文中术语“酶稳定性”优选地涉及酶活性例如在储存或操作期间随时间函数的变化而保留。酶稳定剂使酶在液体、优选地含水环境中稳定，这意指随时间推移它减少或避免酶活性丧失。
[0099]
在一个实施方案中，本发明的至少一种酶、优选地至少一种甘露聚糖酶因酶制品中存在水溶性钙离子源和/或镁离子源而稳定。在一个实施方案中，至少一种酶稳定剂选自多元醇或水溶性盐。
[0100]
多元醇包括含有2至6个羟基的多元醇。合适的实例包括二醇、1,2-丙二醇、1,2-丁二醇、1,2-戊二醇、乙二醇、己二醇、甘油、山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、葡萄糖、果糖、和乳糖。
[0101]
在一个实施方案中，水溶性盐选自盐如nacl或kcl，以及乳酸和甲酸的碱金属盐。
[0102]
在本发明的一个实施方案中，至少一种水溶性盐选自成品组合物中的水溶性锌(ii)离子源、钙(ii)离子源和/或镁(ii)离子源，所述来源向酶提供这类离子，以及其他金属离子(例如钡(ii)、钪(ii)、铁(ii)、锰(ii)、铝(iii)、锡(ii)、钴(ii)、铜(ii)、镍(ii)和氧钒(iv))。优选地，水溶性盐选自cacl2和mgcl2。
[0103]
在本发明的一个方面，酶制品还包含蛋白酶、优选地丝氨酸蛋白酶(ec3.4.21)，更优选地枯草杆菌蛋白酶ec 3.4.21.62；和/或脂肪酶，优选地三酰甘油脂肪酶(ec 3.1.1.3)，更优选地疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginose)脂肪酶。在本上下文中，酶稳定剂可以选自含硼化合物、多元醇、肽醛、其他稳定剂及其混合物。
[0104]
含硼化合物选自硼酸或其衍生物、选自亚硼酸(boronic acid)或其衍生物如芳基亚硼酸(aryl boronic acid)或其衍生物，选自其盐，和选自其混合物。本文中硼酸也称为正硼酸。
[0105]
在一个实施方案中，至少一种含硼化合物选自芳基亚硼酸及其衍生物。在一个实施方案中，含硼化合物选自苯亚硼酸(bba)(也称为苯基亚硼酸(pba))、其衍生物及其混合物。
[0106]
在一个实施方案中，苯基亚硼酸衍生物选自4-甲酰基苯基亚硼酸(4-fpba)、4-羧基苯基亚硼酸(4-cpba)、4-(羟甲基)苯基亚硼酸(4-hmpba)和对-甲苯亚硼酸(p-tba)。
[0107]
其他合适的衍生物包括：2-噻吩基亚硼酸、3-噻吩基亚硼酸、(2-乙酰氨基苯基)亚硼酸、2-苯并呋喃基亚硼酸、1-萘基亚硼酸、2-萘基亚硼酸、2-fpba、3-fbpa、1-噻蒽基亚硼酸、4-二苯并呋喃亚硼酸、5-甲基-2-噻吩基亚硼酸、1-苯并噻吩-2亚硼酸、2-呋喃基亚硼酸、3-呋喃基亚硼酸、4,4联苯基-二亚硼酸、6-羟基-2-萘亚硼酸、4-(甲基硫代)苯基亚硼酸、4-(三甲基甲硅烷基)苯基亚硼酸、3-溴噻吩亚硼酸、4-甲基噻吩亚硼酸、2-萘基亚硼酸、5-溴噻吩亚硼酸、5-氯噻吩亚硼酸、二甲基噻吩亚硼酸、2-溴苯基亚硼酸、3-氯苯基亚硼酸、3-甲氧基-2-噻吩亚硼酸、对甲基-苯乙基亚硼酸、2-噻蒽基亚硼酸、二苯并噻吩亚硼酸、9-蒽亚硼酸、3,5二氯苯基亚硼酸、联苯基亚硼酸酐、邻氯苯基亚硼酸、对氯苯基亚硼酸、间溴苯基亚硼酸、对-溴苯基亚硼酸、对-氟苯基亚硼酸、辛基亚硼酸、1,3,5三甲基苯基亚硼酸、3-氯-4-氟苯基亚硼酸、3-氨基苯基亚硼酸、3,5-双-(三氟甲基)苯基亚硼酸、2,4二氯苯基亚硼酸、4-甲氧苯基亚硼酸及其混合物。
[0108]
在一个实施方案中，至少一种酶稳定剂选自肽醛。肽醛选自二、三或四肽醛和醛类似物(式b1-bo-r，其中r是h、ch3、cx3、chx2或ch2x(x＝卤素)，bo是单个氨基酸残基(在一个实施方案中具有任选取代的脂族或芳族侧链)；并且b1由一个或多个氨基酸残基组成(在一个实施方案中一个、二或三个氨基酸残基组成)，任选地包含n末端保护基团，或如wo 09/118375和wo98/13459中所述，或蛋白质型蛋白酶抑制剂如rasi、basi、wasi(稻、大麦和小麦的双官能α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂)或ci2或ssi。优选地，肽醛是三肽醛。
[0109]
甘露聚糖酶应用
[0110]
在一个方面，本发明涉及优选具有5-12范围ph的制剂，所述制剂包含至少一种与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶，优选地包含至少一种与seq id no:1的位置29-324至少75％同一的甘露聚糖酶。
[0111]
本发明在一个方面涉及本发明液体酶制品配制成洗涤剂制剂如衣物和硬表面清洁用i&i制剂和家用制剂的用途，其中将组分(a)和(b)与一种或多种洗涤剂组分按非特定
的顺序在一个或多个步骤中混合。
[0112]
在一个实施方案中，制剂具有6-11范围、更优选地选自6-10、7-9、7-12、8-12、8-10和7.5-8.5范围的ph。在一个实施方案中，制剂为洗涤剂制剂、优选地液体洗涤剂制剂。
[0113]
本发明的洗涤剂制剂包含一种或多种洗涤剂组分。选择的组分取决于洗涤剂制剂的所需洗涤或清洁应用和/或物理形式。
[0114]
术语“洗涤剂组分”本文定义为意指适于洗涤剂制剂的任何类型成分，如表面活性剂、助洗剂、聚合物、漂白体系。认识到其已知特征的任何本领域已知组分是本发明的合适洗涤剂组分。在一个实施方案中，洗涤剂组分意指以有效量存在时提供洗涤或清洁性能或有效辅助加工(在加工、储存和使用期间维持物理特征；例如流变改性剂、水溶助长剂、干燥剂)的组分。
[0115]
通常，洗涤剂制剂是多于二种洗涤剂组分的复合制剂。
[0116]
洗涤剂组分可以在洗涤剂制剂的最终应用中具有多于一种功能，因此在本文中具体功能语境下提到的任何洗涤剂组分还可以在洗涤剂制剂的最终应用中具有另一种功能。特定洗涤剂组分在洗涤剂制剂的最终应用中的功能通常取决于其在洗涤剂制剂中的量，即洗涤剂组分的有效量。
[0117]
术语“有效量”包括各种组分提供有效污渍移除和有效清洁条件的量(例如ph、起泡量)、有效提供光学益处(例如光学增白、抑制染料转移)的某些组分的量和有效辅助加工(在加工、储存和使用期间维持物理特征；例如流变改性剂、水溶助长剂、干燥剂)的某些组分的量。
[0118]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂是多于两种洗涤剂组分的制剂，其中至少一种组分有效移除污渍，至少一种组分有效提供最佳清洁条件，并且至少一种有效的维持洗涤剂的物理特征。
[0119]
本领域技术人员已知各个洗涤剂组分和在洗涤剂制剂中的使用。合适的洗涤剂组分尤其包含表面活性剂、助洗剂、聚合物、碱、漂白系统、荧光净白剂、抑泡剂和稳定剂、水溶助长剂和腐蚀抑制剂。其他实例例如在“洗涤剂及制剂完全技术手册(洗涤块、餐具洗涤剂、液态与膏状洗涤剂、酶洗涤剂、清洁粉及喷雾剂干燥的洗衣粉(detergent cake,dishwashing detergents,liquid&paste detergents,enzyme detergents,cleaning powder&spray dried washing powder))”，印度工程师研究所(engineers india research institute)(eiri)，第6版(2015)中描述。面向本领域技术人员的另一本参考书可以是“洗涤剂制剂百科全书(detergent formulations encyclopedia)”，solverchem publications，2016。
[0120]
取决于目的应用如洗涤白色纺织品、有色纺织品和羊毛，洗涤剂组分在类型和/或洗涤剂制剂中的量方面变动。选择的组分进一步取决于洗涤剂制剂的物理形式(袋中提供的液体、固体、凝胶或作为小块等)。针对例如洗衣制剂选择的组分进一步取决于地区惯例，所述地区惯例本身涉及诸多方面，如所用的洗涤温度、洗衣机的机械学(垂直轴机器vs.水平轴机器)、耗水量/洗涤周期等和地理特征如水平均硬度。
[0121]
例如：低洗涤剂浓度系统包括洗涤水中存在少于约800ppm洗涤剂组分的洗衣用制剂。中等洗涤剂浓度包括洗涤水中存在约800ppm和约2,000ppm之间洗涤剂组分的洗衣用制剂。高洗涤剂浓度包括洗涤水中存在多于约2,000ppm洗涤剂组分的洗衣用制剂。
[0122]
对各种洗涤剂组分列举的数值范围提供洗涤剂制剂中所包含的量。这类范围须理解成包括限定这个范围的数值并且包括所限定范围中的每个整数。
[0123]
如果不另行描述，“按重量计％”或“％w/w”意指与总洗涤剂制剂有关。在这种情况下，“按重量计％”或“％w/w”如下计算：一种物质的浓度计算为该物质的重量除以制剂总重量乘以100。
[0124]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含一种或多种表面活性剂。“表面活性剂”(本文中与“表面活性物质”同义使用)意指当添加至某液体时改变该液体在界面处特性的有机化学品。根据其离子电荷，表面活性剂称作非离子型、阴离子型、阳离子型或两性型。
[0125]
表面活性剂的非限制性实例公开于《mccutcheon's 2016年洗涤剂和乳化剂(mccutcheon's 2016detergents and emulsifiers)》he《mccutcheon's 2016年功能性材料(mccutcheon's 2016functional materials)》，北美洲版和国际版，mc publishing co，2016年版。在相同出版物的较早版本中公开了本领域技术人员已知的其他有用实例。
[0126]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂包含按重量计1％至30％范围、按重量计3％至25％范围、按重量计5％至20％范围、或按重量计8％至15％范围的阴离子型表面活性剂总量，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含相对于洗涤剂制剂的总重量而言，按重量计约11％的阴离子型表面活性剂总量。
[0127]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含至少一种选自通式(i)化合物的阴离子型表面活性剂：
[0128][0129]
通式(i)中的变量如下定义：
[0130]
r1选自c
1-c
23-烷基(如1-、2-、3-、4-c
1-c
23-烷基)和c
2-c
23-链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的，并且其中2-、3-、或4-烷基；实例是n-c7h
15
、n-c9h
19
、n-c
11h23
、n-c
13h27
、n-c
15h31
、n-c
17h35
、i-c9h
19
、i-c
12h25
。
[0131]
r2选自h、c
1-c
20-烷基和c
2-c
20-链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
[0132]
r3和r4各自独立地选自c
1-c
16-烷基，其中烷基是直链或支链的；实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、异癸基。
[0133]
a-选自-rcoo-、-so
3-和rso
3-，其中r选自直链或支链的c
1-c
8-烷基和c
1-c4羟烷基，其中烷基如上定义。化合物在a-是so
3-时可称作(脂肪)醇/烷基(乙氧基/醚)硫酸盐[(f)a(e)s]，在a-是-rcoo-时可称作(脂肪)醇/烷基(乙氧基/醚)羧酸盐[(f)a(e)c]。
[0134]m+
选自h和成盐阳离子。成盐阳离子可以为单价或多价；因此m
+
等于1/v m
v+
。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵和单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的铵盐。
[0135]
通式(i)的整数如下定义：
[0136]
m是0至200、优选地1-80、更优选地3-20的范围；n和o各自独立地是0至100的范围；
n优选地是1至10、更优选地1至6的范围；o优选地是1至50、更优选地4至25的范围。m、n和o的总和至少是1，m、n和o的总和优选地是5至100的范围，更优选地9至50的范围。
[0137]
通式(i)的阴离子型表面活性剂可以具有任何结构、属于嵌段共聚物或无规共聚物。
[0138]
其他合适的阴离子型表面活性剂包括以下者的盐(m
+
)：c
12-c
18
磺基脂肪酸烷基酯(如c
12-c
18
磺基脂肪酸甲酯)、c
10-c
18-烷基芳基磺酸(如n-c
10-c
18-烷基苯磺酸)和c
10-c
18
烷基烷氧基羧酸酯。
[0139]m+
在全部情况下均选自成盐阳离子。成盐阳离子可以为单价或多价；因此m
+
等于1/v m
v+
。实例包括但不限于钠、钾、镁、钙、铵盐和单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的铵盐。
[0140]
在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少两种选自通式(i)化合物的阴离子型表面活性剂，其中所述阴离子型表面活性剂之一的特征在于r1是c
11
，r2是h，m是2，n和o＝0，a-是so
3-，m
+
是na
+
并且另一表面活性剂的特征在于r1是c
13
，r2是h，m是2，n和o＝0，a-是so
3-，m
+
是na
+
。
[0141]
在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少一种选自通式(ii)化合物的阴离子型表面活性剂：
[0142][0143]
其中式(ii)的r1是c
10-c
13
烷基。在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少两种选自通式(ii)化合物的阴离子型表面活性剂，其中所述阴离子型表面活性剂之一的特征在于r1是c
10
，并且另一表面活性剂的特征在于r1是c
13
。本文中的如此化合物也称为las(直链烷基苯磺酸酯)。
[0144]
本发明的洗涤剂制剂包含按重量计约1％至约15％范围、按重量计约3％至约12％范围、或按重量计约4％至约8％范围的非离子型表面活性剂总量，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含相对于洗涤剂制剂的总重量而言，按重量计约5.5％的非离子型表面活性剂总量。
[0145]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含至少一种根据通式(iii)的非离子型表面活性剂：
[0146][0147]
通式(iii)的变量如下定义：
[0148]
r1选自c
1-c
23
烷基和c
2-c
23
链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的；实例是n-c7h
15
、n-c9h
19
、n-c
11h23
、n-c
13h27
、n-c
15h31
、n-c
17h35
、i-c9h
19
、i-c
12h25
。
[0149]
r2选自h、c
1-c
20
烷基和c
2-c
20
链烯基，其中烷基和/或链烯基是直链或支链的。
[0150]
r3和r4各自独立地选自c
1-c
16
烷基，其中烷基是直链或支链的；实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基、正己基、异己基、仲己基、正庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、异癸基。
[0151]
r5选自h和c
1-c
18
烷基，其中烷基是直链或支链的。
[0152]
通式(iii)的整数如下定义：
[0153]
m是0至200、优选地1-80、更优选地3-20的范围；n和o各自独立地是0至100的范围；n优选地是1至10、更优选地1至6的范围；o优选地是1至50、更优选地4至25的范围。m、n和o的总和至少是1，m、n和o的总和优选地是5至100的范围，更优选地9至50的范围。
[0154]
通式(iii)的非离子型表面活性剂可以具有任何结构，具有嵌段结构或无规结构，并且不局限于展示的式(iii)顺序。
[0155]
本文中式(iii)的化合物也称为烷基聚乙二醇醚(aeo)。
[0156]
在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少一种选自通式(iii)的非离子型表面活性剂，其中m是3至11的范围，优选地不大于7；n和o是0，r1是c
12-c
14
，r5是h。在一个实施方案中，洗涤剂制剂包含至少两种选自通式(iii)化合物的非离子型表面活性剂，其中所述非离子型表面活性剂之一的特征在于r1是c
12
，r5是h，m是7，n和o＝0，并且另一表面活性剂的特征在于r1是c
14
，r5是h，m是7，n和o＝0。
[0157]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含一种或多种选自络合剂(螯合剂、多价螯合剂)、沉淀剂和离子交换化合物的化合物，所述化合物与钙和镁形成水溶性复合物。这类化合物在本文中也称为“助洗剂”或“助洗物质”，同时不意图将这类化合物在洗涤剂制剂的最终应用中限于这个功能。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含至少一种助洗剂，其选自基于非磷酸酯的助洗剂，如葡糖酸钠、柠檬酸盐(类)、硅酸酯(类)、碳酸盐(类)、膦酸盐(类)、氨基羧酸酯(类)、聚羧酸酯(类)、聚磺酸酯(类)和聚膦酸酯(类)。
[0158]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含至少一种“柠檬酸盐”，选自柠檬酸单金属盐和二金属盐，且尤其是檬酸单钠盐及优选地三钠盐、柠檬酸铵盐或取代的铵盐以及柠檬酸本身。柠檬酸盐可以作为无水化合物或作为水合物，例如作为柠檬酸钠二水合物使用。以按重量计0％至约20％范围、按重量计0.5％至约10％范围或按重量计1％-5％范围的总量包含柠檬酸盐，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含相对于洗涤剂制剂的总重量而言约1-3％范围的柠檬酸盐总量。
[0159]
本发明的洗涤剂制剂可以包含一种或多种水溶助长剂。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含一种或多种水溶助长剂，其选自有机溶剂如乙醇、异丙醇、乙二醇、1,2-丙二醇和本领域已知在正常条件下水可溶混的其他有机溶剂。在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含按重量计5％-10％范围、优选地按重量计约6％的1,2-丙二醇总量，前述百分数均相对于洗涤剂制剂的总重量而言。
[0160]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂不包含除本发明甘露聚糖酶之外的任何其他酶。
[0161]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂包含除本发明甘露聚糖酶之外的至少一种选自以下的其他酶：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、甘露聚糖酶和本领域已知可用于洗涤剂制剂中的任何其他酶。
[0162]
相对于本发明洗涤剂制剂中所包含的甘露聚糖酶为额外的至少一种酶本身可以用酶稳定剂稳定。至少一种酶稳定剂选自含硼化合物如硼酸或其衍生物和烃基亚硼酸或其衍生物，选自其盐及选自其混合物，它们均如本文所公开。至少一种酶稳定剂可以选自如本文中公开的肽醛。
[0163]
在一个实施方案中，至少一种酶稳定剂选自使蛋白酶稳定的包含2至6个羟基的多元醇。合适的实例包括二醇、1,2-丙二醇、1,2-丁二醇、1,2-戊二醇、乙二醇、己二醇、甘油、山梨醇、甘露醇、赤藓糖醇、葡萄糖、果糖和乳糖。
[0164]
在一个实施方案中，本发明的洗涤剂制剂是洗衣用洗涤剂。
[0165]
术语“洗涤”指家用洗涤和工业洗涤二者，并且意指用包含本发明洗涤剂制剂的溶液处理纺织品的过程。在一个实施方案中，可以通过使用技术性装置如家用或工业洗衣机实施洗涤过程。洗衣机(washing machine)本文中也称为衣物洗涤机(laundry machine)。备选地，可以手工进行洗涤过程。
[0166]
术语“纺织品”意指任何纺织材料，包括纱线(用于针织或织造的天然纤维或合成纤维制成的线)、纱线中间体、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料，以及由这些材料制成的织物(通过纤维织造、针织或制毡产生的纺织品)如服装(由纺织品制成的衣着制品)、布匹和其他制品。
[0167]
术语“纤维”包括天然纤维、合成纤维及其混合物。天然纤维的实例为植物源(如亚麻、黄麻和棉花)或动物源，包括蛋白质如胶原蛋白、角蛋白和丝心蛋白(例如蚕丝、绵羊毛、安哥拉毛、马海毛、羊绒)。合成来源纤维的实例是聚氨酯纤维如或聚酯纤维、聚烯烃如弹性聚烯烃(elastofin)或聚酰胺纤维如尼龙。纤维意指纺织品如针织品、织造品或非织造品的单一纤维或部分。
[0168]
本发明涉及一种提供含甘露聚糖酶的液体制剂、优选地液体洗涤剂制剂、更优选地液体洗衣用洗涤剂制剂的方法，所述方法包括在一个或多个步骤中混合以下者的步骤：
[0169]
(a)至少一种与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶、优选地至少一种与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶，和
[0170]
(b)至少一种以有效清洁和/或有效维持洗涤剂物理特征的量存在的选自表面活性剂、助洗剂和水溶助长剂的洗涤剂组分。
[0171]
在一个实施方案中，本发明涉及一种提供液体含甘露聚糖含酶的制剂的方法，所述方法包括在一个或多个步骤中按任何顺序混合以下者的步骤：
[0172]
(a)本发明的酶制品包含至少一种与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶、优选地至少一种与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶，和
[0173]
(b)至少一种以有效清洁和/或有效维持洗涤剂物理特征的量存在的选自表面活性剂、助洗剂和水溶助长剂的洗涤剂组分。
[0174]
在一个实施方案中，制剂具有5-12或6-11范围、更优选地选自6-10、7-9、7-12、8-12、8-10和7.5-8.5范围的ph。在一个实施方案中，制剂为洗涤剂制剂、优选地液体洗涤剂制剂、更优选地液体洗衣用洗涤剂制剂。
[0175]
本发明的洗衣用洗涤剂展示在有关洗涤条件下评价的洗涤性能。本文中术语“相关洗涤/清洁条件”指洗衣机中或手洗过程中实际使用的条件，特别地是温度、时间、清洁用机械、肥皂泡沫浓度、洗涤剂类型和水硬度。在一个实施方案中，洗涤性能本文中涉及移除
包含甘露聚糖的污渍；优选地包含甘露聚糖的污渍选自包含半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖的那些污渍。在一个实施方案中，洗涤性能涉及移除包含刺槐豆胶和/或瓜耳胶的污渍。
[0176]
在一个方面，本发明提供一种通过使至少一种包含甘露聚糖的污渍接触与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶、优选地至少一种与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶的步骤，移除包含甘露聚糖的污渍的方法。甘露聚糖酶在5-12或6-11范围的ph、更优选地6-10或7-9或7-12或8-12或8-10范围的ph和最优选地7.5-8.5范围的ph具有甘露聚糖降解活性。在所述ph，甘露聚糖酶对包含甘露聚糖的污渍显示洗涤性能。优选地，该方法是一种在≤60℃、优选地约5-60℃范围、优选地约5-40℃范围、更优地选约10-40℃范围的温度移除包含甘露聚糖的污渍的方法。
[0177]
在一个方面，本发明涉及一种通过以下步骤，在≤60℃、优选地约5-60℃范围、优选地约5-40℃范围、更优地选约10-40℃范围的温度移除包含甘露聚糖的污渍的方法
[0178]
(a)提供一种液体制剂，其包含至少一种与seq id no:1至少80％同一的甘露聚糖酶，
[0179]
(b)使包含甘露聚糖的污渍与(a)的液体制剂接触
[0180]
(c)使酶对污渍发挥其催化活性，持续约10-90分钟、优选地20-80分钟、更优选地30-70分钟或甚至更优选地40-60分钟范围的时间。
[0181]
在一个实施方案中，移除包含甘露聚糖的污渍的方法特征在于一种洗涤方法，所述方法优选地在洗衣机中机械搅拌下进行。液体制剂优选地是液体洗涤剂制剂。
[0182]
本发明涉及使用至少一种与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶、优选地至少一种与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶增加洗涤剂制剂对包含甘露聚糖的污渍、优选地包含刺槐豆胶和/或瓜耳胶的污渍的洗涤或清洁性能。
[0183]
在一个实施方案中，洗涤剂制剂具有5-12或6-11范围、更优选地选自6-10、7-9、7-12、8-12、8-10和7.5-8.5范围的ph。在一个实施方案中，制剂为液体洗涤剂制剂、优选地液体洗衣用洗涤剂制剂。
[0184]
在一个方面，本发明涉及一种优选地具有ph范围5-12的制剂，所述制剂包含至少一种与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶、优选地至少一种与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶，其中该制剂对包含甘露聚糖的污渍、优选地包含刺槐豆胶和/或瓜耳胶的污渍具有增加的洗涤或清洁性能。对包含甘露聚糖的污渍的洗涤或清洁性能增加意指与缺少本发明甘露聚糖酶或缺少任何甘露聚糖酶的制剂相比时，洗涤或清洁性能增加。
[0185]
在一个实施方案中，洗涤或清洁性能在≤60℃、优选地约5-60℃范围、优选地约5-40℃范围、更优地选约10-40℃范围的洗涤或清洁温度增加。
[0186]
在一个方面，本发明涉及一种洗涤或清洁方法，所述方法包括步骤
[0187]
(a)提供至少一种包含甘露聚糖的污渍；
[0188]
(b)提供本发明的洗涤剂制剂
[0189]
(c)使包含甘露聚糖的污渍与(b)的洗涤剂接触。
[0190]
在一个实施方案中，在步骤(a)中提供纺织品，其为含有包含甘露聚糖的污渍的纺织品。
[0191]
在一个实施方案中，本发明洗涤剂中所包含的甘露聚糖酶通过(c)的使包含甘露
聚糖的污渍与(b)的洗涤剂接触，从(a)的纺织品移除包含甘露聚糖的污渍。
[0192]
在一个方面，本发明涉及一种洗涤方法，所述方法包括步骤
[0193]
(a)提供本发明的洗涤剂制剂，
[0194]
(b)使含有包含甘露聚糖的污渍的纺织品与(a)的洗涤剂在10-40℃范围的洗涤温度接触，
[0195]
(c)优选地在洗衣机中机械搅拌下接触。
[0196]
本发明涉及以下实施方案：
[0197]
1.与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶，优选地与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶。
[0198]
2.编码实施方案1的甘露聚糖酶的多核苷酸，优选地与seq id no:2至少75％同一的多核苷酸。
[0199]
3.一种表达构建体，包含根据实施方案2的多核苷酸。
[0200]
4.一种宿主细胞，其包含根据实施方案2的多核苷酸或根据实施方案3的表达构建体。
[0201]
5.一种液体酶制品，其包含与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶、优选地与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶、至少一种稳定液体酶制品本身的化合物、至少一种溶剂和任选地至少一种酶稳定剂。
[0202]
6.制剂，优选地液体制剂，包含至少一种与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶，其中该制剂优选地具有5-12范围的ph。
[0203]
7.一种提供洗涤剂制剂的方法，所述方法包括在一个或多个步骤中混合以下者的步骤：
[0204]
(a)至少一种与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶，优选地其中在根据实施方案5的酶制品中提供该甘露聚糖酶
[0205]
和
[0206]
(b)至少一种选自表面活性剂、助洗剂和水溶助长剂的组分；所述组分均处于有效清洁和/或有效维持洗涤剂物理特征的量。
[0207]
8.洗涤或清洁方法，包括步骤
[0208]
(a)提供至少一种包含甘露聚糖的污渍；
[0209]
(b)提供根据实施方案6的制剂
[0210]
(c)使(a)的包含甘露聚糖的污渍与(b)的制剂接触，优选地在5-60℃范围的洗涤或清洁温度接触。
[0211]
9.根据实施方案8的方法，其中在纺织品(a)上提供包含甘露聚糖的污渍；并且其中洗涤剂(b)中所包含的多肽从纺织品(a)移除包含甘露聚糖的污渍。
[0212]
10.至少一种与seq id no:1至少75％同一的甘露聚糖酶、优选地与根据seq id no:1的位置29-324的序列至少75％同一的甘露聚糖酶的用途，用于增加、优选地在5-60℃范围的洗涤或清洁温度增加洗涤剂制剂对包含甘露聚糖的污渍的洗涤性能。
[0213]
11.实施方案10的用途，其中至少一种包含甘露聚糖的污渍包含刺槐豆胶和/或瓜耳胶。
[0214]
实施例1：甘露聚糖酶表达
[0215]
使用geneious软件以计算机方式设计甘露聚糖酶基因。基因由genscript(新泽西州，usa)合成并克隆入芽孢杆菌表达载体。构建体从genscript作为经序列验证的质粒dna收到并转化入枯草芽孢杆菌。将5μl质粒dna(20-200ng/μl)添加至500μl新鲜制备的枯草芽孢杆菌感受态细胞并且在37℃温育3.5小时。随后将细胞铺种在lb+50ug/ml卡那霉素琼脂平板上并且在37℃培育过夜。为了确认枯草芽孢杆菌中的甘露聚糖酶，通过菌落pcr和测序筛选所产生的菌落。在pcr之前，将每个菌落在含有20mm dtt和0.5mg/ml蛋白酶k的缓冲液中于55℃裂解5分钟，随后在95℃裂解6分钟。使用1μl裂解的细胞和takara ex taq(takara目录号rr001)聚合酶如下进行20μl pcr反应：在98℃初始变性3分钟，30次以下循环：分别在95℃变性10秒、在55℃复性30秒并且在72℃延伸2.5分钟。在72℃终末延伸5分钟完成pcr反应。以96深孔板样式进行甘露聚糖酶表达。在30℃和平叶片叶轮提供的1000转/分钟搅拌时实施发酵20-28小时。将最终发酵液在4℃以2500xg离心15分钟以获得无细胞上清液。用sds-page或毛细管电泳法定量甘露聚糖酶并且测试洗涤性能。
[0216]
实施例2：在rotawash中评价甘露聚糖酶
[0217]
可以在模式制剂如es1_c或市售洗涤剂制剂如persil non-bio中测试甘露聚糖酶的洗涤性能。
[0218][0219][0220]
在persil non-bio(ph 7.2)洗涤剂中于40℃洗涤温度测试以下甘露聚糖酶：
[0221]
man01：根据seq id no:1的位置29-324的序列
[0222]
man02：根据seq id no:3的甘露聚糖酶
[0223]
在以下洗涤条件下于rotawash(rotawash m228,sdl atlas inc.,usa)中使用persil non-bio的洗涤液洗涤cft c-s-43/瓜尔胶污渍指示物或cft c-s-73/刺槐豆胶污渍指示物(cft，vlaardingen，nl)连同棉质压载织物和钢球：
[0224][0225]
在洗涤后，将织物淋洗并晾干。通过用来自epson的平台彩色图像扫描仪(flatbed color image scanner)(expression 11000xl)测量玷污织物洗涤后的平均颜色强度确定对单一污渍的洗涤性能。总体上，平均强度值越高，性能越好。下文在表ex2中也概述了结果。
[0226]
表ex2a：man01在persil non-bio洗涤剂中40℃时对瓜尔胶污渍(c-s-43)的洗涤性能；以平均强度(rgb)计的值
[0227][0228][0229]
表ex2b：man01在persil non-bio洗涤剂中40℃时对刺槐豆胶污渍(c-s-73)的洗涤性能；以平均强度(rgb)计的值
[0230]