细胞培养芯片、细胞培养装置及细胞培养方法与流程

1.本公开涉及细胞培养芯片、使用了该细胞培养芯片的细胞培养装置及细胞培养方法。


背景技术：

2.近年来，作为细胞培养芯片，正在积极开发活体功能芯片(organ on a chip：ooc)(例如参照专利文献1)。
3.现有技术文献
4.专利文献1：日本特开2018-189474号公报


技术实现要素：

5.发明要解决的技术问题
6.在上述的专利文献1等所公开的以往的ooc中，存在使用该ooc进行的细胞评价准确度不足这样的问题。
7.本公开是鉴于上述状况而完成的，目的在于提供能够进行更准确的细胞评价的细胞培养芯片等。
8.用于解决问题的技术方案
9.为了实现上述目的，在本公开涉及的细胞培养芯片的一个技术方案中，具备：主体部，其具有第1流路和第2流路，从预定方向来看，所述第2流路的至少一部分与所述第1流路重叠；细胞分离膜，其具有相互背向的第1主面和第2主面，以使得所述第1流路位于所述第1主面上、且所述第2流路位于所述第2主面上的方式配置在所述第1流路和所述第2流路之间；第1电极，其与所述第1流路相接，在所述第1流路内沿着所述第1流路延伸；以及第2电极，其与所述第2流路相接，在所述第2流路内沿着所述第2流路延伸。
10.另外，在本公开涉及的细胞培养装置的一个技术方案中，具备：上述记载的细胞培养芯片；和对所述第1电极和所述第2电极间的电阻进行计测的计测器。
11.另外，在本公开涉及的细胞培养方法的一个技术方案中，包括：使用上述记载的细胞培养芯片培养预定细胞的培养步骤；和使用所述第1电极和所述第2电极对所培养的所述细胞的电阻进行计测的计测步骤。
12.发明效果
13.根据本公开，能够进行更准确的细胞评价。
附图说明
14.图1a是示意性地表示比较例涉及的细胞培养芯片的图。
15.图1b是表示比较例涉及的电极间电位和电流密度的分布的图。
16.图1c是表示比较例涉及的电阻的理论值和测定值的模拟图。
17.图2a是实施方式涉及的细胞培养芯片的第1概念图。
18.图2b是实施方式涉及的细胞培养芯片的第2概念图。
19.图3是表示实施方式涉及的细胞培养装置的框图。
20.图4是表示实施方式中的细胞培养方法的流程图。
21.图5a是实施方式涉及的细胞培养芯片的立体图。
22.图5b是实施方式涉及的细胞培养芯片的分解立体图。
23.图6是从层叠方向观察图1所示的单点划线的区域a1而得到的俯视图。
24.图7a是表示实施方式的与电极的长度有关的模拟结果的第1图。
25.图7b是表示实施方式的与电极的长度有关的模拟结果的第2图。
26.图8是表示实施方式的与电极宽度有关的模拟结果的图。
27.图9是表示实施方式的与流路高度有关的模拟结果的图。
28.图10a是对实施方式的电极的结构进行说明的第1图。
29.图10b是对实施方式的电极的结构进行说明的第2图。
30.图10c是对实施方式的电极的结构进行说明的第3图。
31.图10d是对实施方式的电极的结构进行说明的第4图。
32.图11a是表示细胞培养芯片的制作中的第1工序的俯视图。
33.图11b是图11a中的xi-xi截面的剖视图。
34.图12a是表示细胞培养芯片的制作中的第2工序的俯视图。
35.图12b是图12a中的xii-xii截面的剖视图。
36.图13a是对实施方式涉及的第1绝缘膜和第2绝缘膜进行说明的剖视图。
37.图13b是对实施方式涉及的第1绝缘膜和第2绝缘膜进行说明的分解立体图。
38.图14a是表示细胞培养芯片的制作中的第3工序的俯视图。
39.图14b是图14a中的xiv-xiv截面的剖视图。
40.图15a是表示细胞培养芯片的制作中的第4工序的俯视图。
41.图15b是图15a中的xv-xv截面的剖视图。
42.图16a是表示细胞培养芯片的制作中的第5工序的俯视图。
43.图16b是图16a中的xvi-xvi截面的剖视图。
44.图17a是表示细胞培养芯片的制作中的第6工序的俯视图。
45.图17b是图17a中的xvii-xvii截面的剖视图。
具体实施方式
46.(公开的概要)
47.用于实现上述目的的、本公开涉及的细胞培养芯片的一个技术方案具备：主体部，其具有第1流路和第2流路，从预定方向来看，该第2流路的至少一部分与第1流路重叠；细胞分离膜，其具有相互背向的第1主面和第2主面，以使得第1流路位于第1主面上且第2流路位于第2主面上的方式配置在第1流路和第2流路之间；第1电极，其与第1流路相接，在第1流路内沿着第1流路延伸；以及第2电极，其与第2流路相接，在第2流路内沿着第2流路延伸。
48.由此，能够通过沿着第1流路和第2流路延伸的第1电极和第2电极对在配置于该第1流路和第2流路之间的细胞分离膜上培养的细胞片的电阻进行计测。在对细胞片的电阻进行计测时，对介于从第1电极到第2电极之间的第1流路和第2流路的内部的流体进行导电的
导电距离缩小。因此，能够降低对上述的流体进行导电时的电位下降的影响，能够更准确地对细胞片的电阻进行计测。由此，通过基于更准确的细胞片的电阻的细胞状态的推定，能够更准确地进行细胞评价。
49.另外，例如也可以为，在所述第1流路和所述第2流路包含电场区域，该电场区域是在从预定方向来看第1流路和第2流路重叠地延伸的位置跨第1流路和第2流路的区域，且是在区域内第1电极和第2电极延伸的区域，第1电极和第2电极的延伸方向上的长度为电场区域的延伸方向上的长度的25％以上。
50.由此，例如能够在计测对象的电阻为1000ω以上的情况下，以误差率为
±
20％以内的计测水准对该电阻进行计测。由此，能够实现能根据更准确的电阻的计测值进行更准确的细胞评价的细胞培养芯片。
51.另外，例如第1电极和第2电极的延伸方向上的长度也可以为电场区域的延伸方向上的长度的70％以上。
52.由此，例如能够在计测对象的电阻为100ω以上的情况下，以误差率为
±
20％以内的计测水准对该电阻进行计测。由此，能够实现能根据更准确的电阻的计测值进行更准确的细胞评价的细胞培养芯片。
53.另外，例如第1电极和第2电极的延伸方向上的长度也可以为电场区域的延伸方向上的长度的75％以上。
54.由此，例如能够在计测对象的电阻为50ω以上的情况下，以误差率为
±
20％以内的计测水准对该电阻进行计测。由此，能够实现能更准确地对作为培养细胞所设想的大致最小的50ω的电阻进行计测、能进行更准确的细胞评价的细胞培养芯片。
55.另外，例如在电场区域中，第1流路和第2流路各自的预定方向上的长度的合计也可以为0.2mm以上且1.5mm以下。
56.由此，能够实现能在预定条件下根据更准确的电阻的计测值进行更准确的细胞评价的细胞培养芯片。
57.另外，例如第1电极和第2电极也可以在与第1电极和第2电极的延伸方向交叉的方向上具有0.1mm的宽度。
58.由此，能够实现能在预定条件下根据更准确的电阻的计测值进行更准确的细胞评价的细胞培养芯片。
59.另外，例如也可以为，主体部具有在主面形成有第1电极的第1基板、第1隔壁层、第2隔壁层以及在主面形成有第2电极的第2基板沿着预定方向按该顺序层叠而得到的层叠构造，细胞分离膜由第1隔壁层和第2隔壁层夹着，第1隔壁层具有与形成于第1基板的第1电极对应地在厚度方向上将第1隔壁层贯通的第1贯通孔，第2隔壁层具有与形成于第2基板的第2电极对应地在厚度方向上将第2隔壁层贯通的第2贯通孔，第1流路具有由形成有第1电极的主面、第1贯通孔以及第1主面划定的第1主流路，第2流路具有由形成有第2电极的主面、第2贯通孔以及第2主面划定的第2主流路，从预定方向来看，第1主流路和第2主流路重叠。
60.由此，能够通过第1基板、第1隔壁层、细胞分离膜以及第2隔壁层的层叠构造形成第1流路，能够通过第2基板、第2隔壁层、细胞分离膜以及第1隔壁层的层叠构造形成第2流路。另外，第1流路中的由第1基板、第1隔壁层以及细胞分离膜划定的第1主流路和第2流路中的由第2基板、第2隔壁层以及细胞分离膜划定的第2主流路重叠。根据该结构，成为第1主
流路和第2主流路与细胞分离膜的两面相接的状态。能够通过该第1主流路侧的第1电极和第2主流路侧的第2电极对在细胞分离膜上培养的细胞片的电阻进行计测。细胞培养芯片具有微小的构造，因此，被要求加工容易性，因而，通过如上述那样作为层叠构造来形成细胞培养芯片，能够简单地形成微小且复杂的构造的细胞培养芯片。
61.另外，例如也可以还具备：第1绝缘膜，其是配置在第1基板与第1隔壁层之间的片状的第1绝缘膜，具有与第1电极对应地在厚度方向上将第1绝缘膜贯通的第1开口；和第2绝缘膜，其是配置在第2基板与第2隔壁层之间的片状的第2绝缘膜，具有与第2电极对应地在厚度方向上将第2绝缘膜贯通的第2开口。
62.在第1基板和第1隔壁层由硬质材料构成的情况下以及第2基板和第2隔壁层由硬质材料构成的情况下，在第1流路或者第2流路内流通的流体有可能从它们的间隙漏出。特别是在形成有从第1电极或者第2电极向外部延伸的导体图案等情况下，若无法吸收这样的导体图案的厚度，则流体会从间隙漏出。在从间隙漏出了流体的情况下，除了对细胞培养产生影响之外，也可能对由第1电极和第2电极计测的细胞的电阻产生影响。因此，通过将第1绝缘膜和第2绝缘膜配置为将这样的间隙填埋，来抑制从间隙漏出流体。由此，能够降低由流体从间隙漏出而导致的对细胞状态的推定的影响，能够更准确地进行细胞的评价。
63.另外，例如也可以为，第1流路具有第1主流路和与第1主流路相连的第1流入路以及第1流出路，第2流路具有第2主流路和与第2主流路相连的第2流入路以及第2流出路，从预定方向来看，第1流入路和第2流入路不重叠，并且，第1流出路和第2流出路不重叠。
64.由此，能够将用于向第1流路注入流体的注入口和用于向第2流路注入流体的注入口形成在从层叠方向进行观察的俯视下不同的位置。同样地，能够将用于从第1流路排出流体的排出口和用于从第2流路排出流体的排出口形成在从层叠方向进行观察的俯视下不同的位置。注入口和排出口优选在与重力方向相反的方向上开口。通过注入口在重力方向相反的方向上开口，能够沿着重力方向注入流体。另外，通过排出口在与重力方向相反的方向上开口，能够保持流路内的流体直至达到一定水位。通过如上述那样能够在从层叠方向进行观察的俯视下不同的位置形成开口，能够实现使第1流路和第2流路的注入口和排出口全部在与重力方向相反的方向上开口的结构。
65.另外，例如也可以为，在将从预定方向来看第1主流路和第2主流路重叠的区域作为了细胞培养区域的情况下，第1电极在沿着第1主流路的方向上延伸到细胞培养区域的外侧，第2电极在沿着第2主流路的方向上延伸到细胞培养区域的外侧。
66.第1电极形成在第1基板的主面上，第2电极形成在第2基板的主面上。即，第1电极和第2电极具有从主面突出的台阶差。在第1流路和第2流路内，当存在这样的突出构造时，会产生微小的紊流。特别是，在与流体的流通方向交叉地突出的台阶差的情况下，有时所产生的紊流的规模大、会影响到所计测的细胞的电阻。通过使第1电极和第2电极伸到细胞培养区域的外侧，能够至少在细胞培养区域内消除第1电极和第2电极与流体的流通方向交叉地突出的台阶差。由此，能抑制紊流的产生，能够根据更准确地计测到的电阻，更准确地进行细胞评价。
67.另外，例如也可以为，还具备：第1引出线，其在第1基板上将设置于第1基板的第1接点和延伸到了细胞培养区域的外侧的第1电极的一端部电连接；和第2引出线，其在第2基板上将设置于第2基板的第2接点和延伸到了细胞培养区域的外侧的第2电极的一端部电连
接。
68.由此，能够在细胞培养区域的外侧配置将第1电极和第1接点电连接的第1引出线和将第2电极连接于第2接点的第2引出线。如上所述，与流体的流通方向交叉地突出的台阶差有时会影响到所计测的细胞的电阻，但至少在细胞培养区域内能够消除第1引出线和第2引出线与流体的流通方向交叉地突出的台阶差。由此，能抑制紊流的产生，能够根据更准确地计测到的电阻，更准确地进行细胞评价。
69.另外，例如也可以为，还具备：第3电极，其与第1流路相接，在与第1电极离开了的状态下在第1流路内沿着第1流路延伸；和第4电极，其与第2流路相接，在与第2电极离开了的状态下在第2流路内沿着第2流路延伸。
70.由此，能够通过使用了第1电极～第4电极这4个电极的4端子方式对细胞的电阻进行计测。通过减去作为误差可能包含的电阻成分，能够计测更准确的电阻。由此，能够根据更准确地计测到的电阻，更准确地进行细胞评价。
71.另外，例如也可以为，第1电极和第3电极是具有与第1流路面接触的主面的平板状，第2电极和第4电极是具有与第2流路面接触的主面的平板状，第3电极的宽度比第1电极的宽度大，第4电极的宽度比第2电极的宽度大。
72.由此，能够在将第1电极和第3电极分担用于电流计测和电位计测的情况下，更准确地进行电流的计测。由此，能够更准确地对电阻进行计测，能够更准确地进行细胞评价。
73.另外，例如第1基板以及第1电极、和第2基板以及第2电极中的至少一方也可以是透明的。
74.由此，能够经由第1基板和第1电极或者经由第2基板和第2电极在视觉上观察所培养的细胞。能够在进行细胞评价时也一并对视觉上的变化进行评价，因此，能够更准确地进行细胞评价。
75.另外，本公开涉及的细胞培养装置的一个技术方案具备：上述记载的细胞培养芯片；和对第1电极和第2电极之间的电阻进行计测的计测器。
76.由此，能够通过沿着第1流路和第2流路延伸的第1电极和第2电极使用计测器来对在配置于该第1流路与第2流路之间的细胞分离膜上培养的细胞片的电阻进行计测。在对细胞片的电阻进行计测时，对介于从第1电极到第2电极之间的第1流路和第2流路的内部的流体进行导电的导电距离缩小。因此，能够降低对上述的流体进行导电时的电位下降的影响，能够更准确地对细胞片的电阻进行计测。由此，通过基于更准确的细胞片的电阻的细胞状态的推定，能够更准确地进行细胞评价。
77.另外，本公开涉及的细胞培养方法的一个技术方案包括：使用上述记载的细胞培养芯片培养预定细胞的培养步骤；和使用第1电极和第2电极对所培养的细胞的电阻进行计测的计测步骤。
78.由此，能够在计测步骤中，通过沿着第1流路和第2流路延伸的第1电极和第2电极，对在配置于该第1流路与第2流路之间的细胞分离膜上培养的细胞片的电阻进行计测。在对细胞片的电阻进行计测时，对介于从第1电极到第2电极之间的第1流路和第2流路的内部的流体进行导电的导电距离缩小。因此，能够降低对上述的流体进行导电时的电位下降的影响，能够更准确地对细胞片的电阻进行计测。由此，通过基于更准确的细胞片的电阻的细胞状态的推定，能够更准确地进行细胞评价。
79.此外，这些概括性的或者具体的技术方案既可以由系统、方法、集成电路、计算机程序或者计算机能够读取的cd-rom等记录介质来实现，也可以由系统、方法、集成电路、计算机程序以及记录介质的任意组合来实现。
80.(成为公开的基础的见解)
81.从医药品的开发成本降低和伦理上的观点出发，要求减少非临床试验以及临床试验，作为有助于这样的要求的新技术，例如正在积极开发如专利文献1所示那样的活体功能芯片(organ on a chip：ooc)。ooc是通过在组合了树脂、玻璃等的人工的极小空间内培养细胞而用微尺度再现了活体内的组织功能的设备。期待能够通过对使用这样的设备培养出的细胞添加药剂，而在人工的设备内对以该药剂的药效和毒性试验为代表的不得不通过吸收、分布、代谢、排泄等的以往的动物试验进行评价的试验进行评价。
82.如以上那样的评价系统，在将医药品作为对象的性质上被要求高的准确度。当前正在开发的ooc采取了以目视的方式对正在设备内培养的细胞的状态进行确认的方法，存在改善的余地。即，在以往的ooc中，药剂的评价试验等中的对象的细胞状态存在偏差，难以分离试验结果是由药剂导致的、还是由细胞状态的偏差导致的。换言之，在使用了以往的ooc的细胞试验中，存在准确度不足这样的问题。
83.使用图1a～图2进行更详细的说明。图1a是示意性地表示比较例涉及的细胞培养芯片的图。在ooc中，使得形成通过将细胞培养为片状来再现了细胞的组织功能的细胞片。
84.在图1a中图示了这样的细胞片(位于图中的中央上侧的内包椭圆的圆角矩形的列)、和以夹着该细胞片的方式形成的第1流路(细胞片上侧的空间)以及第2流路(细胞片下侧的空间)。在第1流路中填充了在细胞的培养中使用的液状的培养基的状态下，配置为第1电极和第3电极浸渍于该培养基。同样地，在第2流路中填充了在细胞的培养中使用的液状的培养基的状态下，配置为第2电极和第4电极浸渍于该培养基。此外，第1流路和第2流路被划定为能够通过位于图中的中央的、具有将第1流路和第2流路连通的多个贯通孔的细胞分离膜进行培养基成分的交换。此外，“划定”是指由形成在底面与顶面之间的壁面形成预定空间。
85.例如，如图1a所示，通过使用比较例涉及的细胞培养芯片，在ooc上形成的细胞片中，对第1电极和第2电极间的电阻进行计测。由此，能够在细胞培养芯片中，对通过贯通孔不呈现电阻的状态～作为由细胞片中的细胞间的紧密连接(tight junction)等的形成引起的电阻上升的细胞片的培养状态进行观测。
86.如上所述，在对第1电极和第2电极间的电阻进行计测的情况下，对从第1电极到第2电极之间除了细胞片之外还经由第1流路的培养基和第2流路的培养基而通电的路径的电阻进行计测。也即是，由于第1流路的培养基和第2流路的培养基的电阻，想要计测的细胞片的电阻会包含噪声。
87.另外，这样的培养基中的电阻根据细胞培养芯片的位置而不同。图1b是表示比较例涉及的电极间电位与电流密度的分布的图。在图1b中示出了从在图1a所示的细胞片的一端(第1电极侧端)到另一端(第2电极侧端)的流路内的电位下降。此外，在图1b中，对第1电极和第2电极间施加10mv的电位，将细胞片的电阻设定为310ω，将一端侧作为流路位置的原点(0mm)，将另一端侧作为流路位置的10mm来进行表示。
88.在第1流路内，在一端侧计测到大约7.0mv的电位，在另一端计测到大约4.3mv的电
位。在第2流路中，在一端侧计测到大约6.3mv的电位，在另一端计测到大约3.6mv的电位。另外，基于这些电位的分布算出的第1流路和第2流路间的电流密度的分布呈现了电流密度在一端和另一端大、而在中央部小的向下凸形状的分布。这样的分布，也就是说，表示了在一端和另一端容易进行通电而在中央部难以进行通电。
89.图1c是表示比较例涉及的电阻的理论值和测定值的模拟图。在图1c中描绘了细胞片的电阻的理论值和通过模拟算出了实际进行了测量的情况下的测定值的值。理论值和测定值希望如虚线所示那样描绘斜率成为1的直线，但实际上如实线所示那样描绘曲线。在细胞片呈现高电阻的情况下，理论值与实测值之间的差很小。另一方面，在细胞片呈现低电阻的情况下(例如呈现10kω以下的电阻等情况下)，由于在图1b中说明过的第1流路与第2流路之间的容易通电度和难以通电度的不均匀的分布，测定值呈现比理论值低的电阻。例如，作为细胞片的电阻设想为310ω等，但根据图1c，该值属于误差大的范围。这样，由于会计测到比应计测的电阻低的电阻，在比较例中的细胞培养芯片中，计测值有时会不准确。
90.于是，在本公开中提供一种能够解决上述问题的细胞培养芯片等。图2a是实施方式涉及的细胞培养芯片的第1概念图。本图示出与在图1中说明过的比较例中的细胞培养芯片的概念图对应的、实施方式中的细胞培养芯片。如图2a所示，相对于比较例涉及的细胞培养芯片，在本实施方式的细胞培养芯片中，各个电极沿着流路所延伸的方向延伸，第1电极和第2电极的电极间距离在流路上的任何点都保持为大致一定。通过这样，能够降低培养基具有的电阻的影响，能够进行更准确的细胞片的电阻的计测。
91.另外，图2b是实施方式涉及的细胞培养芯片的第2概念图。图2b所示的细胞培养芯片在与图2a的结构同样的结构之外还具备第3电极和第4电极。这些第3电极和第4电极的电极间距离在流路上的任何点都保持为大致一定。因此，在图2b所示的细胞培养芯片中，能够在第1电极与第2电极之间以及第3电极与第4电极之间降低培养基具有的电阻的影响，能够使用4端子方式进行更准确的细胞片的电阻的计测。
92.在以后说明的实施方式中，使用图2b所示的、具备第1电极～第4电极这4个电极的细胞培养芯片作为一个例子来进行说明，但本公开也能够使用图2a所示的具备第1电极和第2电极这两个电极的细胞培养芯片来实现。
93.以下，与附图一起对本公开的实施方式进行说明。
94.此外，以下说明的实施方式均表示概括性的或者具体的例子。以下的实施方式中所示的数值、形状、材料、构成要素、构成要素的配置位置以及连接方式、步骤、步骤的顺序等是一个例子，并不是意在限定要求保护的范围。另外，关于以下的实施方式的构成要素中的、没有记载于表示最上位概念的独立权利要求的构成要素，作为任意的构成要素来进行说明。
95.此外，各图并不是一定严格地进行了图示。在各图中，对实质上相同的结构赋予同一标号，省略或者简化重复的说明。另外，在以下的说明中，使用相互正交的x轴、y轴以及z轴进行说明，但并不是对细胞培养芯片等的使用时的方向进行规定。
96.另外，在本说明书中，平行等表示要素间的关系性的术语、矩形等表示要素的形状的术语、数值以及数值范围不是仅表示严格的含义的表达，而是意味着也包含实质上同等的范围、例如百分之几左右的误差等的差异的表达。
97.(实施方式)
98.[细胞培养装置]
[0099]
首先，对实施方式中的细胞培养装置进行说明。图3是表示实施方式涉及的细胞培养装置的框图。
[0100]
如图3所示，本实施方式中的细胞培养装置500具备计测器300、控制装置301、开关盒302以及细胞培养芯片100。
[0101]
细胞培养芯片100是相当于使用细胞培养装置500培养细胞时的培养槽的设备。细胞培养装置500通过使用电极计测电阻来算出在细胞培养芯片100中培养的细胞的电阻，根据所算出的细胞的电阻推定该细胞的状态。因此，在细胞培养芯片100设置有用于算出培养中的细胞的电阻的计测用的电极。具体而言，细胞培养芯片100具备第1电极21、第2电极22、第3电极23以及第4电极24来作为电极。关于细胞培养芯片100的详细结构，将在后面进行描述。
[0102]
计测器300是用于算出所培养的细胞的电阻的计测装置。具体而言，计测器300为如下电阻计：具有供成为电阻的计测对象的两个电极连接的端子t1和端子t2，对与该端子t1和端子t2电连接的两个电极间的电阻进行计测。计测器300例如测定端子t1和端子t2间的交流阻抗和相位差，基于测定结果算出端子t1和端子t2间的电阻。在该情况下，所算出的电阻为所计测到的电阻。
[0103]
控制装置301是基于所计测到的电极间的电阻来算出细胞的电阻的处理装置。另外，控制装置301也是向开关盒302发送对计测器300与设置于细胞培养芯片的电极的电连接进行切换的控制信号的处理装置。作为一个例子，控制装置301通过处理器和与该处理器连接的存储器作为执行用于实施上述功能的程序的计算机来实现。此外，控制装置301也可以是能够执行上述处理的专用电路。
[0104]
开关盒302接收从控制装置301发送来的控制信号，基于该控制信号，对端子t1与连接了第1电极21的连接端子s1或者连接了第3电极23的连接端子s3的连接进行切换。另外，控制装置301对端子t2与连接了第2电极22的连接端子s2或者连接了第4电极24的连接端子s4的连接进行切换。也即是，开关盒302具备分别与端子t1以及端子t2对应的开关，基于控制信号进行各个开关的切换。这样，在本实施方式中，一边对成为计测对象的电极的组合进行切换，一边实施电阻的计测。
[0105]
此外，虽未图示，但细胞培养装置500也可以还具备在培养中使用的培养基的储存罐以及泵等流体控制装置、使细胞培养芯片符合预定培养条件的气体腔室以及调温设备等环境控制装置等。或者，也可以使用与细胞培养装置500分开地准备的这些装置来进行细胞的培养。
[0106]
另外，使用了上述细胞培养装置500的细胞培养如以下那样进行。图4是表示实施方式中的细胞培养方法的流程图。如图4所示，首先使用细胞培养芯片100实施预定细胞的培养(培养步骤s11)。在此，使用细胞培养芯片100所培养的预定细胞也可以是任何细胞。另外，详细将在后面进行描述，但在细胞培养芯片100具有第1流路和第2流路这两个流路，能够在各个流路中分别培养细胞。例如，也可以通过在第1流路中培养肺细胞，在第2流路中培养血管细胞，从而合并第1流路和第2流路来构建呼吸系统的脏器模型。另外，例如也可以通过在第1流路中培养血脑屏障系统的细胞，在第2流路中培养脑神经细胞，从而构建血脑屏障通过试验模型。
[0107]
另外，在各流路中培养的细胞既可以不是一种，也可以是多种的组合。对于在各流路中培养的细胞，也可以按照希望在流路内再现的脏器等的细胞结构，以适当的比率混合培养不同种类的细胞。所培养出的细胞通过紧密连接(tight junction)等细胞间结合来形成片状构造。通过这样的片状构造，所培养出的细胞从片的一方的主面到另一方的主面具有电阻性(即膜电阻)。此外，在第1流路和第2流路中也可以流通培养基等流体。在活体内总是循环有血液、淋巴液等流体，反复进行依赖于循环的细胞的生长以及衰退。因此，通过使这样的流路内流通流体，能够再现更接近活体内的条件来进行细胞培养以及细胞评价。
[0108]
接着，计测器300基于控制装置301的控制信号切换开关盒302的开关，结果，对处于电连接的状态的组合的电极间的电阻进行计测(步骤s12)。所计测出的电阻的数据通过控制装置301被保存于存储器等存储装置。
[0109]
控制装置301在存储装置中保存有为了算出细胞片的膜电阻所需要的电阻的数据时，实施该细胞片的膜电阻的算出(步骤s13)。例如，本实施方式中的、为了算出细胞片的膜电阻所需要的电阻的数据是第1电极与第2电极间的电阻(r
12
)、第1电极与第3电极间的电阻(r
13
)、第2电极与第4电极间的电阻(r
24
)以及第3电极与第4电极间的电阻(r
34
)的数据。在本实施方式中，使用以上4个数据，基于以下的式(1)进行细胞片的电阻的算出。
[0110][0111]
在上述式1中，通过减去可能作为误差而包含在电极间的电阻中的电阻成分，来进行更准确的细胞片的电阻的算出。此外，根据细胞培养装置500的使用者要求的电阻的准确度，不必须通过上述式1算出细胞片的电阻。在这样的情况下，细胞片的电阻也可以直接使用在第1电极和第2电极间计测到的电阻。即，在本实施方式中，细胞培养芯片100仅具备第1电极和第2电极即可，也可以仅在要求更准确的细胞片的电阻的情况下具备第3电极和第4电极。
[0112]
如上所述，通过算出所培养的细胞形成的细胞片的电阻，能够推定该细胞的状态。根据本公开，所算出的细胞的电阻成为更准确的电阻，因此，能够更准确地推定细胞的状态。此外，将步骤s12和步骤s13也一并称为对细胞的电阻进行计测的计测步骤。
[0113]
[细胞培养芯片]
[0114]
以下，进一步对本实施方式中的细胞培养芯片100进行更详细的说明。图5a是实施方式涉及的细胞培养芯片的立体图。另外，图5b是实施方式涉及的细胞培养芯片的分解立体图。
[0115]
本实施方式中的细胞培养芯片100具备主体部、细胞分离膜13、第1电极21、第2电极22、第3电极23以及第4电极24。另外，主体部具有层叠构造，该层叠构造是分别具有与xy平面平行的主面的、在z轴负侧的主面形成了第1电极21和第3电极23的第1基板11、第1隔壁层12、第2隔壁层14、在z轴正侧的主面形成了第2电极22和第4电极24的第2基板15沿着预定方向(图中的z轴方向)按该顺序层叠而得到的。另外，细胞分离膜13由主体部的第1隔壁层12和第2隔壁层14夹着。
[0116]
第1基板11是使用玻璃等材料来形成的板状的构件。此外，第1基板11的材料不限于玻璃，也可以使用树脂、陶瓷等任意材料。另外，第1基板11由于在培养细胞时与该细胞接触，因而由没有细胞毒性的材料形成。这在以后的构成细胞培养芯片100的各构成要素的全
部中是同样的。第1基板11在实施方式中为具有矩形的主面的板状，在该主面上形成有第1电极21和第3电极23。
[0117]
进一步，在第1基板11上例如形成有用于与上述的开关盒302连接的第1接点21b，一并形成有用于将第1电极21与第1接点21b电连接的第1引出线21a。第1电极21、第1引出线21a以及第1接点21b通过光刻对利用溅射形成在第1基板11上的氧化铟锡(ito)膜进行图案加工来以一体的方式形成。此外，第1电极21、第1引出线21a以及第1接点21b的形成也可以使用其它公知的技术来进行。另外，第1电极21、第1引出线21a以及第1接点21b也可以使用金、铂等的导电性薄膜，而不是ito膜。此外，第1电极21和第3电极23为通过图案加工形成的、具有主面的平板状，但也可以是配置在第1基板11上的金属丝状的布线材料。
[0118]
进一步，在第1基板11上例如形成有用于与上述的开关盒302连接的第3接点23b，一并形成有将第3电极23与第3接点23b电连接的第3引出线23a。第3电极23、第3引出线23a以及第3接点23b通过光刻对利用溅射形成在第1基板11上的氧化铟锡(ito)膜进行图案加工来以一体的方式形成。此外，第3电极23、第3引出线23a以及第3接点23b的形成也可以使用其它公知的技术来进行。另外，第3电极23、第3引出线23a以及第3接点23b也可以使用金、铂等的导电性薄膜，而不是ito膜。
[0119]
第1电极21、第1引出线21a以及第1接点21b、和第3电极23、第3引出线23a以及第3接点23b将在y轴方向上对第1基板11进行二等分的中心线作为对称线，在相互离开了的状态下形成为大致线对称。另外，第1接点21b和第3接点23b配置在比在x轴方向上对第1基板11进行二等分的中心线靠x轴方向负侧。
[0120]
第1基板11由绝缘性材料来形成以使得与上述的导电性的电极等不发生短路即可。另外，在第1基板11设置有沿着预定方向将第1基板11贯通以与所层叠的第1隔壁层12相通的孔31。在本实施方式中，孔31设置有4个，但不限于此。在第1隔壁层12的一部分与第1基板11不重叠地露出等情况下，也可以是不经由第1基板11的孔31而直接与第1隔壁层12相通的结构。
[0121]
第1隔壁层12是由硅树脂形成的板状的构件。第1隔壁层12具有至少一部分与形成于第1基板11的第1电极21和第3电极23对应地在厚度方向(z轴方向)上将第1隔壁层12贯通的第1贯通孔。详细将在后面进行描述，第1贯通孔与第1流路33对应。第1贯通孔的两端与形成于第1基板11的孔31中的两个对应。另外，在第1隔壁层12设置有与孔31中的除了与第1贯通孔对应的两个孔之外的其余两个孔31对应的、在厚度方向上将第1隔壁层12贯通以使得与所层叠的第2隔壁层14相通的孔32。孔32也可以与孔31同样地少于2个。
[0122]
细胞分离膜13一般也被称为膜(membrane)，是具有第1隔壁层12侧的第1主面13a和第2隔壁层14侧的第2主面13b的膜状构件。细胞分离膜13由多孔质性的树脂材料形成，形成有大量的将相互背向的第1主面13a和第2主面13b贯通的预定孔径的贯通孔。在此，预定孔径是指具有不均匀的孔径的大量的贯通孔的孔径的平均值。另外，预定孔径被设定为比使用细胞培养芯片100所培养的细胞的细胞径足够小。
[0123]
因此，细胞分离膜13是抑制比预定孔径足够大的细胞从第1主面13a向第2主面13b或者从第2主面13b向第1主面13a通过而使比预定孔径小的溶液成分(例如培养基成分等)通过的半通过性膜。另外，细胞分离膜13在细胞培养芯片100中培养的细胞为粘附细胞的情况下也具有作为该细胞的立足点的功能。因此，细胞分离膜13选定所培养的细胞能够粘附
的材料使用即可。细胞分离膜13配置在与第1贯通孔以及后述的第2贯通孔对应的部位，在从层叠方向进行了观察的俯视下的第1贯通孔以及第2贯通孔的外侧被夹在第1隔壁层12与第2隔壁层14之间。
[0124]
通过这样，在第1贯通孔与第2贯通孔重叠的部位，由细胞分离膜13分别区划第1贯通孔和第2贯通孔。
[0125]
这样，形成具有第1主流路36的第1流路33，该第1主流路36是由形成了第1电极21和第3电极23的第1基板11的主面、第1贯通孔以及第1主面13a划定的。换言之，在第1基板11与细胞分离膜13之间通过第1贯通孔形成第1主流路36。第1主流路36是由第1贯通孔形成的第1流路33的一部分。第1电极21和第3电极23与这样划定的第1流路33的、特别是第1主流路36相接，在第1主流路36内沿着第1主流路36延伸。另外，在第1流路33，在与孔31对应的一端形成有第1流入口34，在另一端形成有第1流出口38，分别经由孔31与细胞培养芯片100的外部连通。另外，第1流路33具有从第1流入口34连接到第1主流路36的第1流入路35、和从第1流出口38连接到第1主流路36的第1流出路37。第1流入路35和第1流出路37相对于第1主流路36，取代由细胞分离膜13划定，而由第2隔壁层14划定。
[0126]
第2隔壁层14是由硅树脂形成的板状的构件。第2隔壁层14具有至少一部分与形成于第2基板15的第2电极22和第4电极24对应地在厚度方向(z轴方向)将第2隔壁层14贯通的第2贯通孔。详细将在后面进行描述，第2贯通孔与第2流路41对应。第2贯通孔的两端与形成于第1基板11的孔31和形成于第1隔壁层12的孔32对应。
[0127]
第2基板15是使用玻璃等材料来形成的板状的构件。此外，第2基板15的材料不限于玻璃，也可以使用树脂、陶瓷等任意材料。第2基板15在实施方式中为具有矩形的主面的板状，在该主面上形成有第2电极22和第4电极24。
[0128]
进一步，在第2基板15上例如形成有用于与上述的开关盒302连接的第2接点22b，一并形成有将第2电极22与第2接点22b电连接的第2引出线22a。第2电极22、第2引出线22a以及第2接点22b通过光刻对利用溅射形成在第2基板15上的氧化铟锡(ito)膜进行图案加工来以一体的方式形成。此外，第2电极22、第2引出线22a以及第2接点22b的形成也可以使用其它公知的技术来进行。另外，第2电极22、第2引出线22a以及第2接点22b也可以使用金、铂等的导电性薄膜，而不是ito膜。此外，第2电极22和第4电极24为通过图案加工形成的、具有主面的平板状，但也可以是配置在第2基板15上的金属丝状的布线材料。
[0129]
进一步，在第2基板15上例如形成有用于与上述的开关盒302连接的第4接点24b，一并形成有将第4电极24与第4接点24b电连接的第4引出线24a。第4电极24、第4引出线24a以及第4接点24b通过光刻对利用溅射形成在第2基板15上的氧化铟锡(ito)膜进行图案加工来以一体的方式形成。此外，第4电极24、第4引出线24a以及第4接点24b的形成也可以使用其它公知的技术来进行。另外，第4电极24、第4引出线24a以及第4接点24b也可以使用金、铂等的导电性薄膜，而不是ito膜。
[0130]
第2电极22、第2引出线22a以及第2接点22b、和第4电极24、第4引出线24a以及第4接点24b将在y轴方向上对第2基板15进行二等分的中心线作为对称线，在相互离开了的状态下形成为大致线对称。另外，第2接点22b和第4接点24b配置在比在x轴方向上对第2基板15进行二等分的中心线靠x轴方向正侧。由此，第1接点21b和第4接点24b在从层叠方向进行了观察的俯视下不重叠，第2接点22b和第3接点23b在从层叠方向进行了观察的俯视下不重
叠。
[0131]
第2基板15由绝缘性材料形成以使得与上述的导电性的电极等不发生短路即可。
[0132]
这样，形成具有第2主流路44的第2流路41，该第2主流路44是由形成了第2电极22和第4电极24的第2基板15的主面、第2贯通孔以及第2主面13b划定的。换言之，在第2基板15与细胞分离膜13之间通过第2贯通孔形成第2主流路44。第2主流路44是由第2贯通孔形成的第2流路41的一部分。第2电极22以及第4电极24与这样划定的第2流路41的、特别是第2主流路44相接，在第2主流路44内沿着第2主流路44延伸。另外，第1主流路36和第2主流路44在从层叠方向进行了观察的俯视下相互重叠，隔着细胞分离膜13划定了各个流路。
[0133]
换言之，细胞分离膜13配置在第1流路33和第2流路41之间，以使得第1流路33中的第1主流路36位于第1主面13a上、且第2流路41中的第2主流路44位于第2主面13b上。因此，经由细胞分离膜13，第1主流路36和第2主流路44能够对在各自的流路中流通的培养基成分等的比预定孔径小的成分进行交换。另外，与培养基成分同样地，在第1主流路36和第2主流路44中也能够交换电解质，因此，第1主流路36和第2主流路44通过在各自的流路中流通的培养基成分等而电连接。
[0134]
另外，在第2流路41，在与孔31以及孔32对应的一端形成有第2流入口42，在另一端形成有第2流出口46，分别经由孔31以及孔32与细胞培养芯片100的外部连通。另外，第2流路41具有从第2流入口42连接到第2主流路44的第2流入路43、和从第2流出口46连接到第2主流路44的第2流出路45。第2流入路43和第2流出路45相对于第2主流路44，取代由细胞分离膜13划定，而由第1隔壁层12划定。
[0135]
也即是，在从层叠方向进行了观察的俯视下，第1流入路35与第2流入路43不重叠，并且，第1流出路37与第2流出路45不重叠。由此，在第1流入路35和第1流出路37中，由第2隔壁层14的没有形成第2贯通孔的主面形成第1流路33的一部分。另外，在第2流入路43和第2流出路45中，由第1隔壁层12的没有形成第1贯通孔的主面形成第2流路41的一部分。
[0136]
图6是从层叠方向观察图1所示的单点划线的区域a1而得到的俯视图。在图6中，通过用虚线表示透视地看到第1电极21～第4电极24、第1引出线21a～第4引出线24a、第1接点21b～第4接点24b、第1流路33、第2流路41以及细胞分离膜13的情况下的位置，示出了各个位置关系。
[0137]
如图中所示，第1流路33和第2流路41在上述的第1主流路36以及第2主流路44处相互重叠。细胞分离膜13具有比第1主流路36整体或者第2主流路44整体大的第1主面13a和第2主面13b，从预定方向来看，扩展到第1主流路36和第2主流路44的外侧。由此，在第1主流路36和第2主流路44重叠的区域中，细胞分离膜13抑制第1主流路36和第2主流路44彼此的接触而使之相互分离。通过该细胞分离膜13的结构实现了如上述那样的各个流路的划定。在此，培养通过细胞分离膜13分离到各流路的细胞。这样，将从层叠方向来看，第1主流路36与第2主流路44重叠的区域(也即是，第1流路33与第2流路41重叠的区域)定义为细胞培养区域50。
[0138]
第1电极21～第4电极24在细胞培养区域50内沿着该细胞培养区域50延伸。第1电极21～第4电极24分别在比细胞培养区域50长度的50％长、比75％长、比90％长的范围内沿着该细胞培养区域50延伸。此外，细胞培养区域50的长度是指图中的扁平的六边形中的最长的顶点间的长度。另外，第1电极21～第4电极24在细胞培养区域50内分别仅配置有1条。
另外，在图中配置为第1电极21与第4电极24重叠、第2电极22与第3电极23重叠。
[0139]
此外，第1电极21和第3电极23如前述的那样由氧化铟锡(ito)形成，是透明的。另外，第1基板11也由玻璃等透明材料形成。通过这样的结构，第1基板11、第1电极21以及第3电极23是透明的，可透视地看到第1隔壁层12。由此，在目视下也能够观察在第1流路33内培养的细胞。这样的第1基板11、第1电极21以及第3电极23的由透明材料形成的结构不是必须的，这些也可以由不透明材料构成。另外，同样地，第2基板15、第2电极22以及第4电极24既可以是透明的，也可以是不透明的。
[0140]
在此，关于包括相对于细胞培养区域50的第1电极21～第4电极24的长度在内的第1电极21～第4电极24的配置以及大小等，与图7a～图9所示的各种模拟的结果一起进一步详细进行说明。此外，在以下的说明中，在不特别区别地对第1电极21～第4电极24的各个电极进行呼称时，有时仅表达为“电极”。
[0141]
例如在使用了如上述那样的细胞培养装置500的培养细胞的电阻的计测中，要求预定的计测水准。例如，基于一般的计测值的可靠性等，计测水准被设定为误差率为
±
20％以内等的误差条件。如首先说明的那样，在本实施方式中，通过沿着流路延伸的方向形成的电极进行计测，但特别地关于满足如上述那样的计测水准的细胞培养芯片100的结构，对从进行了模拟的结果导出的各种条件进行说明。此外，在此作为一个例子，作为计测水准，将误差率为
±
20％以内使用为基准。因此，在以后的说明中使用的数值等为一个例子，在由细胞培养芯片100或者细胞培养装置500的用户要求的计测水准不同的情况下，也可以设定与该计测水准相应的数值等。
[0142]
图7a是表示实施方式的与电极的长度有关的模拟结果的第1图。另外，图7b是表示实施方式的与电极的长度有关的模拟结果的第2图。在图7a中示出模拟上的计测值(或者模拟值)相对于作为计测对象的培养细胞的电阻的理论值的误差率。另外，在图7a中，关于该理论值与误差率的关系，示出对多个长度的电极分别进行了模拟的结果。
[0143]
此外，对在此的电极的长度进行说明。在此，相对于第1流路33和第2流路41中的、由电极比较均匀地形成电场的区域(以下也称为电场区域)，以百分率(以下也称为覆盖率)表示作为相对的大小的电极的长度。具体而言，电场区域是在第1流路33与第2流路41重叠地延伸的位置处具有跨第1流路33和第2流路41的空间的区域。在电场区域配置有沿着第1流路33延伸的第1电极21和第3电极23，并且，配置有沿着第2流路41延伸的第2电极22和第4电极24。另外，第1电极21、第2电极22、第3电极23以及第4电极24在电场区域内沿着第1流路33或者第2流路41延伸。在此的电场区域例如简化为以如下切断面进行了切断的情况下的截面形状均匀(例如，同一面积的矩形截面持续)的区域来进行处理，该切断面是相对于与在电场形成中使用的第1电极21～第4电极24的延伸方向一致的第1主流路36和第2主流路44延伸的方向正交的切断面。
[0144]
也即是，为由将在上述的图6中说明过的六边形的细胞培养区域50中的最长的两边彼此作为对边来包括的四边形成的、从主体部10的层叠方向的俯视下为矩形形状的区域。另外，电场区域是如上所述那样具有遍及第1流路33和第2流路41的高度的四棱柱形状。也即是，该高度相当于第1隔壁层12、第2隔壁层14以及细胞分离膜13的厚度的合计，但细胞分离膜13的厚度足够小，因此，也可以说实质上相当于第1隔壁层12和第2隔壁层14的厚度。
[0145]
在本实施方式中，这样通过对简化了的电场区域进行模拟，在简化计算的同时，导
出适当的电极的长度。此外，实际上，关于第1流路33和第2流路41的整个区域形成有电场。因此，既可以将第1流路33和第2流路41的整个区域作为电场区域，也可以将与细胞培养区域50的六边形形状对应的区域作为电场区域，还可以对细胞培养芯片100的流路形状进行设计，以使得能够由简单的形状的电场区域覆盖第1流路33和第2流路41的主要部分。
[0146]
这样，基于模拟值的误差率，使用上述的覆盖率来作为以相对的方式表示相对于预先规定的电场区域的长度的电极的长度的数值，由此，能够对构成细胞培养芯片100的电极的长度进行规定。此外，电场区域的长度是指由于第1流路33和第2流路41作为流路延伸而相同地延伸的电场区域的延伸方向上的长度。另外，电极的长度是指沿着第1流路33以及第2流路41延伸的第1电极21～第4电极24的延伸方向上的长度。此外，电场区域的延伸方向与第1电极21～第4电极24的延伸方向一致，第1电极21～第4电极24各自的长度一致。
[0147]
因此，在图7a中，作为用于对电极的长度进行规定的覆盖率，示出作为覆盖率100％、75％、50％、25％以及10％的电极中的、模拟值相对于理论电阻值的误差率。另外，在图7a中，作为比较例，一并示出了图1a所示的结构的细胞培养芯片中的电极的、模拟值相对于理论电阻值的误差率。此外，图1a所示的结构的细胞培养芯片中的电极是指分别配置于各流路的流入口或者流出口、经由在流路中流通的流体等相互电连接的电极，而不是如实施方式这样沿着流路延伸的电极。
[0148]
如图7a所示，在任意的覆盖率下，都可看到作为计测对象的培养细胞的电阻越小、则越大地计测到误差率的倾向。此外，误差率大意味着误差率的绝对值大。也即是，可以说越从误差率0％在正或者负的方向上远离，则误差率越大。在此，培养细胞的电阻值根据细胞类型以及细胞状态(或者生育状态)等而不同。因此，对于覆盖率，根据培养细胞的细胞类型以及细胞状态等选择适当的覆盖率即可。例如，作为使用细胞培养芯片100的细胞，参照图7b对图中的(b)所示的箭头的电阻值(也即是100ω)的情况进行说明。在图7b中，示出将电阻的值固定为100ω、表示相对于覆盖率的变化的模拟值的误差率的变化的曲线图。此外，图中的点阴影线表示满足计测水准的模拟值的误差率的范围。这在图7a、后述的图8以及图9中也是同样的。
[0149]
如图中所示可知，在培养细胞的电阻为100ω的情况下，能在覆盖率的值为70％以上且100％以下的范围中得到满足计测水准的模拟值的误差率。再次参照图7a，若考虑计测对象的电阻越大、则误差率越小，则当为设想为培养细胞的电阻为100ω以上的细胞类型以及细胞状态等时，能够通过具有覆盖率70％以上的电极的细胞培养芯片100良好地进行计测。
[0150]
通过同样的判断，例如在对作为培养细胞所设想的大致最小值即50ω(图中表示为(a)的箭头)的电阻进行计测的情况下，能够通过具有覆盖率75％以上的电极的细胞培养芯片100良好地进行计测。另外，例如在对作为培养细胞所设想的1000ω(图中表示为(c)的箭头)的电阻进行计测的情况下，能够通过具有覆盖率25％以上的电极的细胞培养芯片100良好地进行计测。
[0151]
另外，以下参照图8基于模拟结果对与相对于电极的延伸方向交叉的方向有关的规定进行说明。图8是表示实施方式的与电极宽度有关的模拟的结果的图。在图8中示出了使在第1基板11或者第2基板15的主面所制作的电极被膜的图案加工时的电极的宽度(以下也称为电极宽度)进行了变化时而变化的模拟值的误差率。
[0152]
在此的电极宽度是指相对于电极的延伸方向交叉的方向上的电极的大小中的、与由成膜时的膜厚规定的、层叠方向上的电极的大小即电极厚度不同的大小。也即是，电极宽度表示与延伸方向以及层叠方向正交的方向上的电极的大小。此外，在此，100ω被设定为成为计测对象的培养细胞的电阻值。
[0153]
如图8所示可知，若电极厚度为一定，则电极宽度越大，电极内的电阻越低，模拟值的误差率越小。如图8所示可知，为了满足计测水准地计测100ω的电阻，电极宽度为0.1mm以上即可。另外，鉴于培养细胞的电阻越大、误差率越小的图7a中的结果，要对100ω以上的电阻进行计测，为具备具有0.1mm的电极宽度的电极的细胞培养芯片100即可。
[0154]
以下，进一步参照图9对流路高度与模拟值的误差率的关系进行说明，该流路高度是对第1电极21以及第3电极23、与第2电极22以及第4电极24的距离进行规定的高度。图9是表示实施方式的与流路高度有关的模拟结果的图。在图9中示出表示第1流路33和第2流路41中的、特别是与电场区域对应的第1主流路36和第2主流路44的层叠方向上的大小与模拟值的误差率的关系的曲线图。此外，对于在此的模拟，将第1主流路36和第2主流路44的大小中的、作为与延伸方向以及层叠方向交叉的方向上的大小的流路宽度设定为在能够设计的范围内误差最容易变大的10mm来进行模拟。
[0155]
形成于第1基板11的主面的第1电极21以及第3电极23、和形成于第2基板15的主面的第2电极22以及第4电极24与第1隔壁层12以及第2隔壁层14的厚度对应地分离。第1隔壁层12的厚度与第1主流路36的层叠方向上的大小一致。另外，第2隔壁层14的厚度与第2主流路44的层叠方向上的大小一致。第1电极21以及第3电极23、与第2电极22以及第4电极24的距离关系到在流路中流通的流体的电阻值等，是有可能产生误差的原因之一。
[0156]
如图9所示，在流路高度存在用于满足计测水准的合适的范围。例如，在图9所示的例子中，为了满足计测水准地对100ω的电阻进行计测，流路高度需要被设定在0.2mm以上且1.5mm以下的范围内。也即是，跨第1流路33和第2流路41的电场区域具有0.2mm以上且1.5mm以下的高度(层叠方向上的大小)。若为具有上述范围内的流路高度的细胞培养芯片100，则能够以误差率为
±
20％以内的计测水准良好地对100ω等的培养细胞的电阻进行计测。
[0157]
在此，使用图10a～图10d对本实施方式中的电极的结构的其它例子进行说明。此外，在以下说明的图10a～图10d中，仅图示作为与图6同样的视点的区域a1内的俯视下的细胞培养区域50、第1电极以及第3电极。另外，以下说明的电极的结构的其它例子既可以仅应用于第1电极和第3电极中的一方，也可以应用于第1电极和第3电极这双方，还也可以应用于第1电极、第2电极、第3电极以及第4电极的全部。
[0158]
图10a是对实施方式的电极的结构进行说明的第1图。图10a所示的第1电极21c和第3电极23c在比细胞培养区域50的长度的100％长的范围内沿着细胞培养区域50延伸。也即是，第1电极21c和第3电极23c在沿着第1主流路36的方向上延伸到细胞培养区域50的外侧。第2电极以及第4电极也可以是同样的。由此，电极的端部不位于细胞培养区域50内，因此，能够降低由在电极的端部产生的微小的紊流导致的对计测值的影响。
[0159]
另外，图10b是对实施方式的电极的结构进行说明的第2图。图10b所示的第1电极21d和第3电极23d在比细胞培养区域50的长度的100％长的范围内沿着细胞培养区域50延伸。另外，第1电极21d和第3电极23d的宽度(y轴方向上的长度)比上述的实施方式中的第1
电极21和第3电极23大。第2电极以及第4电极也可以是同样的。由此，能容易地进行第1电极21d以及第3电极23d、与第2电极以及第4电极的y轴方向上的对准和第1电极21d以及第3电极23d、与细胞培养区域50的对准(也即是与第1流路33以及第2流路41的对准)。
[0160]
另外，图10c是对实施方式的电极的结构进行说明的第3图。图10c所示的第1电极21e和第3电极23e在比细胞培养区域50的长度的100％长的范围内沿着细胞培养区域50延伸。另外，第1电极21e的延伸到了细胞培养区域50的外侧的第1电极21e的一端部和第1接点21g在细胞培养区域50的外侧由第1引出线21f电连接。同样地，第3电极23e的延伸到了细胞培养区域50的外侧的第3电极23e的一端部和第3接点23g在细胞培养区域50的外侧由第3引出线23f电连接。第2电极以及第4电极也可以是同样的。由此，将电极连接于端子的引出线不位于细胞培养区域50内，因此，能够降低由在引出线中产生的微小的紊流导致的对计测值的影响。
[0161]
另外，图10d是对实施方式的电极的结构进行说明的第4图。图10d所示的第3电极23h的宽度(y轴方向上的长度)比第1电极21h的宽度大(也即是宽)。另外，第2电极以及第4电极也可以是同样的。例如，在电阻的计测中使对电流进行计测的电极和对电位进行计测的电极为不同的电极的情况下，用于对电极进行计测的电极优选是内部电阻尽可能小(截面积大)的电极。因此，通过设为上述那样，将第3电极23h作为电流计测用电极，将第1电极21h作为电位计测用电极，能够准确度更高地对电阻进行计测。
[0162]
以下，使用图11a～图17b对实施方式的实施例进行说明。在以下说明的实施例中，一并对进行细胞培养芯片100的制作、然后进行了模型细胞的培养的结果进行说明。
[0163]
图11a是表示细胞培养芯片的制作中的第1工序的俯视图。另外，图11b是图11a中的xi-xi截面的剖视图。如图11a和图11b所示，在制作细胞培养芯片100的第1工序中，准备了由玻璃形成的第2基板15。作为第2基板15，使用了具有y轴方向30毫米
×
x轴方向40毫米的1200平方毫米的面积的主面、具有0.7毫米的厚度(z轴方向上的长度)的基板。接着，通过溅射法，在该第2基板15的主面形成氧化铟锡(ito)以使得成为150纳米的厚度，通过蚀刻形成了第2电极22、第2引出线22a以及第2接点22b和第4电极24、第4引出线24a以及第4接点24b。此时，第2电极22和第4电极24设计为了宽度0.1毫米、长度10毫米。
[0164]
图12a是表示细胞培养芯片的制作中的第2工序的俯视图。另外，图12b是图12a中的xii-xii截面的剖视图。如图12a和图12b所示，在制作细胞培养芯片100的第2工序中，将由硅树脂形成了的第2隔壁层14粘结于了形成有第2电极22和第4电极24的第2基板的主面。作为第2隔壁层14，使用了具有y轴方向20毫米
×
x轴方向40毫米的800平方毫米的面积的主面、具有1.0毫米的厚度(z轴方向上的长度)的隔壁层。对第2隔壁层14使用了预先形成有第2贯通孔的隔壁层。具体而言，第2贯通孔通过激光切削加工形成为了具有1.0毫米的宽度。
[0165]
在第2贯通孔的形成中，沿着x轴方向形成了具有13毫米的长度的、与第2主流路44对应的直线部位。另外，在第2贯通孔的形成中，形成了从该直线部位的x轴负侧端部在相对于x轴方向向x轴负侧且y轴负侧倾斜30度的方向上延伸的、与第2流入路43对应的一端侧的倾斜部位。另外，在第2贯通孔的形成中，在一端侧的倾斜部位的延长线上且未到达第2隔壁层14的端部的位置形成了与第2流入口42对应的部位。
[0166]
另外，在第2贯通孔的形成中，形成了从该直线部位的x轴正侧端部在相对于x轴方向向x轴正侧且y轴正侧倾斜30度的方向上延伸的、与第2流出路45对应的另一端侧的倾斜
部位。另外，在第2贯通孔的形成中，在另一端侧的倾斜部位的延长线上且未到达第2隔壁层14的端部的位置形成了与第2流出口46对应的部位。此外，通过使第2隔壁层14与第2基板15的y轴方向上的长度为20毫米和30毫米，使得形成在了第2基板15上的第2接点22b和第4接点24b露出。也即是，第2基板15的y轴方向上的端部以使得至少一部分露出的方式进行了第2隔壁层14的粘结。
[0167]
此外，第2隔壁层14以使得第2贯通孔的直线部位成为与第2电极22以及第4电极24对应的位置的方式进行对准并进行了粘结。对于第2隔壁层14的粘结，通过在使与第2隔壁层14同样的硅树脂材料熔融了的状态下将其涂敷于第2基板15的主面，在贴合了第2隔壁层14之后，在65℃气氛中静置2小时，从而进行了粘结。
[0168]
在此，使用图13a和图13b对第2基板15与第2隔壁层14的粘结进行更详细的说明。图13a是对实施方式涉及的第1绝缘膜和第2绝缘膜进行说明的剖视图。另外，图13b是对实施方式涉及的第1绝缘膜和第2绝缘膜进行说明的分解立体图。在图13a的(a)中示出图5a的xiii-xiii截面中的剖视图，在图13a的(b)中图示了第1基板11和第1隔壁层12、配置在它们之间的第1绝缘膜16、第2基板15和第2隔壁层14以及配置在它们之间的第2绝缘膜17。
[0169]
另外，在图13b中图示了第1基板11和第1隔壁层12以及配置在它们之间的第1绝缘膜16，进一步，通过反转进行观察，图13b也可以视为图示了第2基板15和第2隔壁层14以及配置在它们之间的第2绝缘膜17。此外，对于进行了反转的情况的标号以及表示进行了反转的情况下的方向的方向轴，附加括号来进行表示。另外，在进行了反转的情况下，忽略不存在于第2基板15和第2隔壁层14的孔31和孔32，同样地，忽略存在于第1绝缘膜16、但不存在于第2绝缘膜17的孔16b。在以下的说明中，对第1基板11和第1隔壁层12侧的结构进行说明。此外，通过将第1基板11替换为第2基板15、将第1隔壁层12替换为第2隔壁层14等，同样的说明成立，因此，省略关于第2基板15和第2隔壁层14侧的结构的说明。
[0170]
如图13a所示，在上述说明过的实施方式中，设为第1基板11和第1隔壁层12经由第1电极21、第1引出线21a以及第1接点21b和第2电极22、第2引出线22a以及第2接点22b粘结来进行了说明。在该情况下，若第1基板11和第1隔壁层12、或者用于将这些粘结的粘结材料形成的粘结层中的任一个为柔软的材料，则不需要考虑第1电极21等的厚度。
[0171]
然而，在第1基板11和第1隔壁层12为硬质的材料、且形成粘结材料非常薄的粘结层等情况下的特定条件下，通过第1电极21等的厚度，在第1基板11和第1隔壁层12之间形成有间隙。此时当在第1流路33中使流体流通时，可能会产生从该间隙漏出流体，无法进行准确的计测的情况。在这样的情况下，也能够使用在第1基板11与第1隔壁层12之间配置了片状的第1绝缘膜16的细胞培养芯片100a。
[0172]
第1绝缘膜16是具有一定的厚度和柔软的特性的材料，例如由丙烯酸树脂等形成。第1绝缘膜16通过一定的厚度和柔软的特性，对第1电极21等的厚度进行吸收，对在第1基板11和第1隔壁层12之间形成的间隙进行填充。在此，形成在第1基板11的主面的第1电极21需要相对于第1隔壁层12的第1贯通孔露出。
[0173]
也即是，优选在第1电极21所存在的第1基板11的主面的一部分与第1隔壁层12之间不存在其它构件。因此，在第1绝缘膜16的与第1电极21对应的部位形成有在厚度方向上将该第1绝缘膜16贯通的第1开口16a(第2绝缘膜17的情况下为第2开口17a)。另外，同样地优选在孔31与孔32之间也不存在其它构件。因此，在第1绝缘膜16的与孔31以及孔32对应的
部位形成有在厚度方向上将该第1绝缘膜16贯通的孔16b。
[0174]
这样，在细胞培养芯片100a中，也可以不损害细胞培养和电阻的计测等的功能地设置第1绝缘膜16，该第1绝缘膜16用于对形成在第1基板11和第1隔壁层12之间的间隙进行填充。
[0175]
图14a是表示细胞培养芯片的制作中的第3工序的俯视图。另外，图14b是图14a中的xiv-xiv截面的剖视图。如图14a和图14b所示，在制作细胞培养芯片100的第3工序中，使得第2主面13b取向为第2隔壁层14的主面侧，将由多孔质性的树脂形成的细胞分离膜13粘结于了第2隔壁层14的主面。
[0176]
作为细胞分离膜13，使用了具有y轴方向5.0毫米
×
x轴方向14毫米的70平方毫米的面积的主面、具有10微米的厚度(z轴方向上的长度)的细胞分离膜。对细胞分离膜13使用了形成有具有3.0微米的孔径来作为预定孔径的贯通孔的细胞分离膜。细胞分离膜13以使得至少将第2贯通孔的直线部位覆盖的方式进行对准并进行了粘结，优选使得第2隔壁层14和xy平面中的中心大致一致。对于细胞分离膜13的粘结，与第2基板15和第2隔壁层14的粘结同样地，通过在使与第2隔壁层14同样的硅树脂材料熔融了的状态下将其涂敷于第2隔壁层14的主面，在贴合了细胞分离膜13之后，在65℃气氛中静置2小时，从而进行了该粘结。
[0177]
图15a是表示细胞培养芯片的制作中的第4工序的俯视图。另外，图15b是图15a中的xv-xv截面的剖视图。如图15a和图15b所示，在制作细胞培养芯片100的第4工序中，将由硅树脂形成了的第1隔壁层12粘结于了细胞分离膜13和第2隔壁层14的主面。
[0178]
作为第1隔壁层12，使用了具有与第2隔壁层14同等的y轴方向20毫米
×
x轴方向40毫米的800平方毫米的面积的主面、具有1.0毫米的厚度(z轴方向上的长度)的隔壁层。对第1隔壁层12使用了预先形成有第1贯通孔和孔32的隔壁层。具体而言，第1贯通孔通过激光切削加工形成为了具有1.0毫米的宽度，孔32通过激光切削加工形成为了具有0.5毫米的直径。
[0179]
在第1贯通孔的形成中，沿着x轴方向形成了具有13毫米的长度的、与第1主流路36对应的直线部位。另外，在第1贯通孔的形成中，形成了从该直线部位的x轴负侧端部在相对于x轴方向向x轴负侧且y轴正侧倾斜30度的方向上延伸的、与第1流入路35对应的一端侧的倾斜部位。另外，在第1贯通孔的形成中，在一端侧的倾斜部位的延长线上且未到达第1隔壁层12的端部的位置形成了与第1流入口34对应的部位。
[0180]
另外，在第1贯通孔的形成中，形成了从该直线部位的x轴正侧端部在相对于x轴方向向x轴正侧且y轴负侧倾斜30度的方向上延伸的、与第1流出路37对应的另一端侧的倾斜部位。另外，在第1贯通孔的形成中，在另一端侧的倾斜部位的延长线上且未到达第1隔壁层12的端部的位置形成了与第1流出口38对应的部位。
[0181]
对于第1隔壁层12的粘结，与第2基板15和第2隔壁层14的粘结同样地，通过在使与第1隔壁层12同样的硅树脂材料熔融了的状态下将其涂覆于细胞分离膜13和第2隔壁层14的主面，在贴合了第1隔壁层12之后，在65℃气氛中静置2小时，从而进行了该粘结。
[0182]
图16a是表示细胞培养芯片的制作中的第5工序的俯视图。另外，图16b是图16a中的xvi-xvi截面的剖视图。如图16a和图16b所示，在制作细胞培养芯片100的第5工序中，准备了由玻璃形成的第1基板11。作为第1基板11，使用了具有y轴方向30毫米
×
x轴方向40毫米的1200平方毫米的面积的主面、具有0.7毫米的厚度(z轴方向上的长度)的基板。接着，通
过溅射法，在该第1基板11的主面形成氧化铟锡(ito)以使得成为150纳米的厚度，通过蚀刻形成了第1电极21、第1引出线21a以及第1接点21b和第3电极23、第3引出线23a以及第3接点23b。此时，第1电极21和第3电极23设计为了宽度0.1毫米、长度10毫米。
[0183]
这样，将第1基板11粘结于了第1隔壁层12，以使得形成了第1电极21、第1引出线21a以及第1接点21b和第3电极23、第3引出线23a以及第3接点23b的第1基板11的主面与第1隔壁层12侧相对向。此外，通过使第1隔壁层12和第1基板11的y轴方向上的长度为20毫米和30毫米，使得形成在了第1基板11上的第1接点21b和第3接点23b露出。也即是，以第1基板11的y轴方向上的端部的至少一部分露出的方式进行了第1基板11的粘结。
[0184]
此外，第1基板11以使得第1贯通孔的直线部位成为与第1电极21以及第3电极23对应的位置的方式进行对准并进行了粘结。对于第1基板11的粘结，通过在使与第1隔壁层12同样的硅树脂材料熔融了的状态下将其涂敷于第1隔壁层12的主面，在贴合了第1基板11之后，在65℃气氛中静置2小时，从而进行了粘结。
[0185]
此外，也可以在通过在使以上的硅树脂材料熔融了的状态下将其进行涂敷、在65℃气氛中静置2小时来进行粘结的情况下，一体地进行65℃气氛中的2小时的静置的步骤。如上所述，制作了与上述的实施方式同样的细胞培养芯片100。
[0186]
另外，进一步，在本实施例中，进行了用于使用于细胞培养的培养基的贮存槽的安装。图17a是表示细胞培养芯片的制作中的第6工序的俯视图。另外，图17b是图17a中的xvii-xvii截面的剖视图。如图17a和图17b所示，在制作细胞培养芯片的第6工序中，制作了对制作到了第5工序的细胞培养芯片100粘结了贮存槽200的细胞培养芯片100b。贮存槽200是由硅树脂形成的具有6.0毫米的直径以及7.0毫米的高度(z轴方向上的长度)的圆筒状的构件，通过被粘结在第1基板11上，成为将第1基板11的主面作为底面的容器。贮存槽200与设置于第1基板的孔31分别对应地进行了粘结。贮存槽200通过上述的尺寸而具有大约200微升的容积。对于贮存槽200的粘结，与上述同样地通过在使硅树脂材料熔融了的状态下将其涂覆于第1基板11的主面，在65℃气氛中静置2小时，从而进行了粘结。
[0187]
接着，使用制作到了第6工序的细胞培养芯片100b，进行了作为模型细胞的源于人结肠癌的细胞株(cell strain)即caco-2细胞的培养。首先，对细胞培养芯片100b进行30分钟的紫外线照射，进行细胞培养芯片100b的灭菌处理，使用磷酸缓冲生理盐水(phosphate buffered saline：pbs)进行了3次清洗。接着，向第2流路41注入了10微升的培养基，向第1流路33注入了10微升细胞悬浊液。细胞悬浊液使用了预先进行了调整以使得caco-2细胞的数量成为2.0
×
106(个/毫升)的悬浊液。在37℃、5％co2气氛中将该细胞培养芯片100b静置培养了30分钟。进一步，一边向细胞培养芯片100b的全部贮存槽200各注入150微升培养基、并在37℃、5％co2气氛中进行静置培养，一边一天一次地进行了电阻的计测。此外，进行了如下操作：两天一次地将贮存槽200内的培养基全部除去，并新注入150微升的培养基。
[0188]
电阻的计测使用了上述说明过的细胞培养装置500的计测器300、控制装置301以及开关盒302。在连接端子s1经由第1接点21b连接了第1电极21，在连接端子s3经由第3接点23b连接了第3电极23。另外，在连接端子s2经由第2接点22b连接了第2电极22，在连接端子s4经由第4接点24b连接了第4电极24。
[0189]
通过控制装置301的控制信号，对r
12
、r
13
、r
24
以及r
34
进行了计测。另外，通过上述式1算出了所培养的caco-2细胞的细胞片中的电阻。根据所算出的细胞片的电阻，观察到暂时
性的电阻值的上升，推定了紧密连接等的细胞间基质的形成和崩解的过程。这样的推定是在基于目视的细胞状态的推定中所不能看到的，因此，相对于以往的基于目视的细胞状态的推定，确认了本公开中的细胞状态推定的准确度的高度。
[0190]
(其它实施方式)
[0191]
以上，对实施方式等进行了说明，但本公开并不限定于上述实施方式等。
[0192]
另外，在上述实施方式等中对构成细胞培养装置的构成要素进行了例示，但细胞培养装置具备的构成要素的各功能也可以任意地分成构成细胞培养装置的多个部分。
[0193]
此外，对实施方式等实施本领域技术人员能够想到的各种变形而得到的方案或者通过在不脱离本公开的宗旨的范围内任意地组合实施方式等中的构成要素和功能而实现的方案也包含于本公开。
[0194]
例如，在上述的实施方式中作为具有层叠构造来进行了说明的细胞培养芯片也可以是使用3d打印等方法以一体的方式形成的。
[0195]
另外，例如第1基板和第1电极以及第2电极也可以不是透明。在目的仅为细胞片中的电阻的计测的情况下，细胞的细胞状态也可以无法通过目视进行确认。
[0196]
另外，也可以为如下构成：在一个细胞培养芯片内具备多个与上述的实施方式同样的结构(即具备第1流路、第2流路、第1电极以及第2电极)，能一举进行多个条件下的细胞培养和使用了所培养的细胞的试验。
[0197]
另外，在上述实施方式中，细胞培养区域设为了呈直线状延伸的第1主流路和呈直线状延伸的第2主流路重叠的直线形状，但只要第1流路和第2流路重叠，也可以是呈曲线状延伸的第1主流路和第2主流路重叠的曲线形状。
[0198]
另外，例如也可以不具备第3电极和第4电极，而通过仅第1电极和第2电极的两端子方式实现本公开。另外，在该情况下，也可以不具备开关盒和控制装置。作为细胞培养装置，只要最低限度仅具有细胞培养芯片和计测器，就能够实现本公开。
[0199]
产业上可利用性
[0200]
本公开有助于细胞的培养装置以及基于使用该培养装置所培养的细胞的试验系统的构建等、医药品开发等中的新发展。
[0201]
标号说明
[0202]
11 第1基板
[0203]
12 第1隔壁层
[0204]
13 细胞分离膜
[0205]
13a 第1主面
[0206]
13b 第2主面
[0207]
14 第2隔壁层
[0208]
15 第2基板
[0209]
16 第1绝缘膜
[0210]
16a 第1开口
[0211]
16b、31、32 孔
[0212]
17 第2绝缘膜
[0213]
17a 第2开口
[0214]
21、21c、21d、21e、21h 第1电极
[0215]
21a、21f 第1引出线
[0216]
21b、21g 第1接点
[0217]
22 第2电极
[0218]
22a 第2引出线
[0219]
22b 第2接点
[0220]
23、23c、23d、23e、23h 第3电极
[0221]
23a、23f 第3引出线
[0222]
23b、23g 第3接点
[0223]
24 第4电极
[0224]
24a 第4引出线
[0225]
24b 第4接点
[0226]
33 第1流路
[0227]
34 第1流入口
[0228]
35 第1流入路
[0229]
36 第1主流路
[0230]
37 第1流出路
[0231]
38 第1流出口
[0232]
41 第2流路
[0233]
42 第2流入口
[0234]
43 第2流入路
[0235]
44 第2主流路
[0236]
45 第2流出路
[0237]
46 第2流出口
[0238]
50 细胞培养区域
[0239]
s1、s2、s3、s4 连接端子
[0240]
t1、t2 端子
[0241]
100、100a、100b 细胞培养芯片
[0242]
200 贮存槽
[0243]
300 计测器
[0244]
301 控制装置
[0245]
302 开关盒
[0246]
500 细胞培养装置