抗黄热病病毒抗体及其产生和使用方法与流程

抗黄热病病毒抗体及其产生和使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年11月25日提交的美国临时申请第62/940,049号的优先权，所述美国临时申请特此通过引用整体并入。
3.对作为ascii文件提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附录的引用
4.写入创建于2020年11月24日、字节数为493,241、机器格式为ibm-pc、采用ms windows操作系统的文件mab-501001wo_sequencelisting_st25.txt中的序列表通过引用并入本文。
技术领域
5.本公开涉及抗黄热病病毒(yfv)抗体及其抗原结合片段，以及含有此类抗体及其抗原结合片段的组合物，以及所述抗体、抗原结合片段和组合物的诊断用途。


背景技术：

6.黄热病病毒(yfv)是在非洲和南美洲的热带和亚热带地区发现的蚊媒黄病毒。它主要通过受感染的伊蚊或血吸虫叮咬传播给人类，并具有三个不同的传播周期：1)丛林或森林周期；2)非洲大草原(中间)周期；以及3)城市周期。(www.cdc.gov/yellowfever/transmission/index.html)。虽然许多感染yfv的人没有症状，但其它人会在3-6天的潜伏期后出现发烧、发冷、头痛、腰痛、肌痛、食欲不振、恶心、呕吐和/或疲劳等症状。(www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever)。大约15％的感染者会出现yfv的严重形式，包含发烧、出血体质、腹痛、肾功能衰竭、心血管不稳定和肝功能衰竭；高达50％的严重yfv患者会死亡。(mcguinness等人,《神经医院医生(neurohospitalist)》2017,7(4)；157-158)。
7.yfv具有编码三种结构蛋白和七种非结构蛋白的10,862个核苷酸的rna基因组。从5'端开始，编码蛋白质的顺序为：c；prm/m；e；ns1；ns2a；ns2b；ns3；ns4a；ns4b和ns5。三种结构蛋白包含c(衣壳)蛋白、膜蛋白m和包膜蛋白e。包膜蛋白在细胞嗜性、毒力和免疫力中起重要作用。
8.17d减毒活疫苗被认为是迄今为止开发的最安全和最有效的疫苗之一。然而，尽管有疫苗可用，黄热病仍然是一个严重的公共卫生问题。有一些数据表明，免疫力虽然具有保护作用，但在某些人群中可能会随着时间的推移而减弱。此外，yfv在非流行国家的爆发(如2016年中国的11例输入性病例)和同时爆发的17d库存耗尽均凸显了开发治疗方法的重要性。
9.事实上，迄今为止，目前还没有批准的yfv治疗(唯一的疗程是支持性疗法)，并且尽管进行了数十年的研究，但仍难以开发出针对yfv的安全有效的治疗性抗体。yfv e特异性血清抗体响应已被证明主要由靶向e蛋白结构域i(di)和/或结构域ii(dii)的抗体介导，而靶向结构域iii(diii)的抗体在非常低的滴度下不存在或存在(dvratskikh等人《科学公共图书馆-病原体(plos pathogens)》9,e1003458(2013))。相应地，迄今为止描述的六种
yfv e特异性人单克隆抗体都靶向e蛋白dii内的重叠表位(lu等人《细胞报告(cell reports)》26,438-446e435(2019)；daffis等人《病毒学(virology)》337,262-272(2005))。最近，确定了这些mab中的一种mab(5a)与可溶性yfv e二聚体复合的晶体结构，这表明该mab与一个e单体的dii内的保守中和表位结合(lu等人《细胞报告》26,438-446e435(2019))。因此，仍然需要高特异性、高亲和力和高效中和抗yfv抗体及其抗原结合片段。


技术实现要素：

10.本公开涉及发现与yfv蛋白结合并表现出中和效力的抗体及其抗原结合片段，具体地说，与表现出高中和效力的e蛋白的结构域iii(diii)结合的抗体。本公开的抗体还可以与其它黄病毒交叉反应，例如，显示与denv-2、denv-4、wnv和/或zikv e蛋白的结合反应性。描述了一组广泛的yfv特异性单克隆抗体。结合研究表明，对yfv-17d的中和抗体响应主要由识别yfv e蛋白的dii内的fl近端表位的抗体介导。还鉴定了一小组具有有效中和活性的diii靶向抗体。此外，结合测定表明，yfv-17d疫苗接种似乎诱导了显示出广泛黄病毒结合活性的抗体的子集，其中大多数靶向高度保守的fl，并且几乎没有交叉中和活性。中和研究表明，一定比例的抗体显示出高效的中和活性。总之，本文所述的抗体组为yfv疫苗的合理设计提供了有前景的治疗候选者和框架。
11.此类抗体在进行预防性施用时(在暴露于病毒和感染病毒之前)可用于减轻yfv原发感染的严重程度或持续时间，或改善与感染相关的至少一种症状。所述抗体可单独使用或与可用于治疗yfv感染的第二药剂联合使用。在某些实施例中，所述抗体可以单独或与第二药剂联合治疗性地给予(在暴露于病毒和感染病毒之后)，以减轻原发感染的严重程度或持续时间，或改善与感染相关的至少一种症状。在某些实施例中，所述抗体可以预防性地用作独立疗法以保护有感染yfv风险的患者，如上述那些。当单独给予或与包含例如抗病毒疗法或其它抗病毒疫苗的第二药剂联合给予时，任何这些患者群体可受益于用本公开的抗体进行的治疗。
12.在某些实施例中，提供了与yfv特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中此类抗体或其抗原结合片段的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列中的至少一者与选自表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的抗体的表3中公开的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和/或cdrl3氨基酸序列中的至少一者至少70％相同；至少75％相同；80％相同；至少85％相同；至少90％相同；至少95％相同；至少96％相同；至少97％相同；至少98％相同；至少99％；和/或介于它们之间的所有同一性百分比。
13.所述抗体或其抗原结合片段还可以具有以下特性中的一个或多个特性：a)所述抗体或其抗原结合片段显示出干净或低的多反应性特征；b)所述抗体或其抗原结合片段显示出的体外中和效力(ic
50
)介于约0.5微克/毫升(μg/ml)到约5μg/ml之间；介于约0.05μg/ml到约0.5μg/ml之间；或小于约0.05mg/ml；c)所述抗体或其抗原结合片段结合yfv-17d颗粒；或d)所述抗体或其抗原结合片段与yfv的包膜蛋白结合。在某些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括上述特性a)到d)中的至少两个特性；至少三个特性；或4个特性。
14.在某些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括：a)被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrh1氨基酸序列；b)被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrh2氨基酸序列；c)被指定为表3中公开的抗
体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrh3氨基酸序列；d)被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrl1氨基酸序列；e)被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrl2氨基酸序列；f)被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrl3氨基酸序列；和/或g)a)、b)、c)、d)、e)和f)中的两个或更多个的任意组合。
15.在某些其它实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：与被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体至少70％相同；至少75％相同；80％相同；至少85％相同；至少90％相同；至少95％相同；至少96％相同；至少97％相同；至少98％相同；至少99％；和/或介于它们之间的所有同一性百分比的抗体。
16.在某些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括：a)被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的重链(hc)氨基酸序列；和/或b)被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的轻链(lc)氨基酸序列。
17.本公开还考虑了编码所述抗yfv抗体的核酸和包括所述核酸的表达载体，以及通过所述核酸和/或表达载体表达此类抗体的宿主细胞。
18.在一个实施例中，提供了编码本文公开的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸序列。
19.在其它实施例中，提供了包括编码本文公开的抗体或抗原结合片段的分离的核酸序列的表达载体。
20.在其它实施例中，提供了用编码本文公开的抗体或抗原结合片段的核酸序列或包括编码本文公开的抗体或抗原结合片段的分离的核酸序列的表达载体转染、转化或转导的宿主细胞。
21.在其它实施例中，提供了包括一种或多种本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段的药物组合物；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
22.在其它实施例中，提供了药物组合物，其包括一种或多种编码本文公开的抗体或抗原结合片段的核酸序列，或一种或多种包括编码本文公开的抗体或抗原结合片段的核酸序列的表达载体；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
23.在其它实施例中，提供了包括编码本文公开的抗体或抗原结合片段的核酸序列的表达载体；或包括编码本文公开的抗体或抗原结合片段的核酸序列的宿主细胞。
24.本公开进一步考虑了使用所述抗yfv抗体(或编码核酸或包括此类核酸的表达载体)的预防和/或治疗方法。
25.在一个实施例中，提供了治疗或预防黄热病病毒(yfv)感染或与yfv感染相关的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要或疑似有需要的患者施用：a)根据本文公开的其它实施例的一种或多种抗体或其抗原结合片段；b)编码本文公开的抗体或抗原结合片段的一种或多种核酸序列；包括编码本文公开的抗体或抗原结合片段的核酸序列的表达载体；或包括表达载体的宿主细胞，所述表达载体包括编码本文公开的抗体或抗原结合片段的核酸序列；或c)根据本文公开的其它实施例的药物组合物；使得所述yfv感染被治疗或预防，或与yfv感染相关的至少一种症状被治疗、减轻或在严重程度上降低。
26.在其它实施例中，所述方法进一步包括向所述患者施用第二治疗剂。
27.在实施例中，所述第二治疗剂选自：抗病毒剂；对yfv具有特异性的疫苗；对黄病毒
具有特异性的疫苗；对yfv抗原具有特异性的sirna；和对yfv抗原具有特异性的第二抗体。
28.在某些实施例中，提供了用于在有需要或疑似有需要的患者中预防yfv感染，或用于治疗患有yfv感染的患者，或用于改善与所述感染相关的至少一种症状或并发症的药物组合物，其中作为此类用途的结果，所述感染被预防，或与所述感染相关的至少一种症状或并发症被预防、改善或在严重程度和/或持续时间上被减轻。在某些实施例中，提供了用于在有需要或疑似有需要的患者中预防yfv感染的药物组合物。在某些实施例中，提供了用于治疗患有yfv感染的患者的药物组合物。在某些实施例中，提供了用于改善与所述感染相关的至少一种症状或并发症的药物组合物。在某些实施例中，所述感染被预防。在某些实施例中，作为此类用途的结果，与所述感染相关的至少一种症状或并发症被预防、改善或在严重程度和/或持续时间上被减轻。
29.在某些实施例中，提供了用于在有需要或疑似有需要的患者中治疗或预防yfv感染或与所述yfv感染相关的至少一种症状的药物组合物，其中作为此类用途的结果，所述感染被预防，或与所述感染相关的至少一种症状或并发症被预防、改善或在严重程度和/或持续时间上被减轻。
30.在某些其它实施例中，提供了所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在有需要的患者中预防yfv感染，或用于治疗患有yfv感染的患者，或用于改善与所述感染相关的至少一种症状或并发症，其中所述感染被预防，或与所述感染相关的至少一种症状或并发症被预防、改善或在严重程度和/或持续时间上被减轻。
31.在某些其它实施例中，提供了所述药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在有需要或疑似有需要的患者中预防yfv感染或与所述yfv感染相关的至少一种症状，其中作为此类用途的结果，所述感染被预防，或与所述感染相关的至少一种症状或并发症被预防、改善或在严重程度和/或持续时间上被减轻。
32.在某些其它实施例中，提供了于yfv e-蛋白结合的抗体。该抗体可以与yfv e蛋白的结构域ii的fl内的表位、yfv e蛋白的结构域ii的fl近端的表位中的至少一者结合，并与yfv的结构域iii中的蛋白质结合。该抗体还可以具有以下特性中的一个或多个特性：a)所述抗体或其抗原结合片段显示出干净或低的多反应性特征；b)所述抗体或其抗原结合片段显示出的体外中和效力(ic
50
)介于约0.5微克/毫升(μg/ml)到约5μg/ml之间；介于约0.05μg/ml到约0.5μg/ml之间；或小于约0.05mg/ml；c)所述抗体或其抗原结合片段结合yfv-17d颗粒；以及d)所述抗体或其抗原结合片段与yfv的包膜蛋白结合。
附图说明
33.图1a和图1b说明了yvf-14d疫苗接种后的供体血清分析。图1a：疫苗接种后第-5天(接种前)、第10天、第14天、第28天、第90天、第180天、第270天和第360天对针yfv-17d的血清中和活性。示出了来自两个独立实验的平均值
±
sd(n＝6)。图1b：疫苗接种后每个时间点血清样品的中和ic
50
，其表示为血清稀释度的倒数。
34.图2a到图2d示出了在第10天和第14天yfv-17d疫苗接种诱导的浆母细胞响应的表征。图2a：在疫苗接种后第0天、第10天和第14天，外周血中cd19
+
cd20-/lo b细胞中浆母细胞的频率。浆母细胞在本文中定义为cd19
+
cd3-cd8-cd14-cd16-cd20-/lo
cd38
hi
cd27
hi
细胞。图2b：在100nm下对整个yfv-17d颗粒表现出elisa结合反应性的pb衍生型mab的百分比。图2c：
pb衍生型mab在100nm和10nm浓度下对yfv-17d的中和活性。绿点表示vh+v
l
中的核苷酸取代数。图2d：具有指定中和效力(ic
50
)的yfv-17d反应性pb衍生型mab的比例。
35.图3说明了种系恢复的浆母细胞单克隆抗体的结合活性。由biacore测定的三种体细胞突变的pb衍生型mab(adi-46184、adi-46185和adi-42168)及其对应uca的结合痕迹和亲和力。uca，未突变的共同祖先。
36.图4示出了pb衍生型mab的中和筛选。通过微滴度中和测定筛选的pb mab的代表性yfv-17d中和滴定曲线。示出了来自两个独立实验的平均值
±
sd(n＝6)。
37.图5a和5b示出了对yfv-17d显示出反应性的swig
+
b细胞的存在。图5a：每个采样时间点swig
+
b细胞的yfv e反应性。所示的荧光活化细胞分选(facs)绘图在cd19
+
cd20
+
igd—igm—b细胞上进行门控。用两种不同的颜色标记yfv e，以减少背景结合。图5b：在每个采样时间点显示yfv e反应性的swig
+
b细胞的百分比。
38.图6a到6e说明，yfv e特异性抗体显示优先使用vh3-72种系基因。图6a：从每个采样时间点分离的yfv e特异性mab的vh种系基因使用。还包含未选择的人mbc库(“未选择”)的vh种系基因频率以进行比较。未选择的人mbc的测序数据来自多个高通量测序研究。图6b：利用vh3-72种系基因的mab的vl种系基因使用。汇集所有采样时间点的mab用于该分析。饼图中央的数字表示vh3-72 mab的总数。图6c：利用vh3-72种系基因的yfv e特异性mab、利用所有其它vh种系基因的mab或来自mbc的未选择ab中cdr h3的长度分布。图6d：利用vh3-72种系基因或所有其它vh种系基因的yfv e特异性mab的shm负载(表示为vh中的核苷酸取代数)。图6e：利用vh3-72种系基因或所有其它vh种系基因的mab与yfv e蛋白的表观结合亲和力，由bli确定。黑条表示中位数。针对从第14天的mbc中分离出来的mab绘制了亲合(avid)kd
app
，因为只有这些mab的小子集显示出单价取向上可检测到的与yfv e的结合。使用mann-whitney检验进行统计比较(***p《0.001，**p《0.01，*p《0.05)。
39.图7a到7d说明了靶向fl内或fl近端的表位的抗体主导记忆b细胞对yfv-17d疫苗接种的响应。图7a：每个采样时间点每个主要竞争组中mab的比例。图7b：利用vh3-72的mab根据竞争组用阴影表示；显示了天然配对的轻链种系基因。图7c：与4g2竞争并使用vh3-72种系基因的mab的比例。图7d：使用vh3-72种系基因或所有其它种系基因的4g2竞争性mab的表观亲和力。使用mann-whitney检验进行统计比较(**p《0.01)。
40.图8a到8d说明了大多数高效中和抗体识别fl-近端表位。图8a：每个表位箱中具有针对yfv-17d的中和ic
50
(小于1、1-10、大于10-100和大于100nm)的mab的比例。n.n
–
非结合剂。图8b：各个mab对yfv-17d的中和ic
50
穿过指定的表位箱。黑条表示中位数。图8c：靶向yfv e上指定抗原位点的高效中和抗体(ic
50
《1nm)的比例。饼图中央的数字表示高效中和抗体的数量。图8d：仅5a或5a/adi-45107竞争者中和抗体的vh和vl种系基因使用。来自两个供体的mab被合并用于所有显示的分析。
41.图9a到9c示出了单克隆抗体的子集，其显示出广泛的黄病毒交叉反应性。图9a：与一种或多种测试的黄病毒e蛋白(yfv、denv-1、denv-2、zikv和wnv)反应的mab的比例。通过bli在亲合取向上测量重组e蛋白结合。饼图中央的数字表示分析的mab的数量。图9b：识别指定抗原位点的交叉反应性mab的比例。来自两个供体的交叉反应性mab被合并用于该分析。图9c：示出50种mab的交叉反应性曲线的热图，其显示与除yfv e之外的至少一种黄病毒e蛋白的结合。使用bli在亲合取向上确定表观亲和力(kd
app
)。示出针对yfv-17d和zikv的病
毒中和活性的热图显示在结合热图的下方。单个mab的竞争组分配显示在热图的顶部。n.b.，非结合；n.n.，非中和；neut.，中和。
具体实施方式
42.对人抗体对yfv感染的响应的深入了解将有助于yfv疫苗和治疗性和/或预防性抗体的开发和评估，以用于治疗和/或预防yfv感染。使用高通量抗体分离平台在两个经接种疫苗的成年供体中剖析人记忆b细胞对yfv的响应，并对高效和选择性的yfv中和抗体进行分离和表征。
43.高通量表位作图研究表明，yfv e蛋白的dii上的fl内或fl近端的表位是免疫显性的。虽然与fl特异性表位结合的许多mab是非中和的，但大多数靶向与5a表位重叠的fl近端表位的mab显示出中和活性。此外，绝大多数强效nab识别该抗原位点，这表明yfv-17d疫苗接种诱导的nab响应主要由此类ab介导。这些mab的一个子集显示出异常有效的中和活性，其ic
50
比之前描述的yfv mab低约10倍。鉴于巴西和刚果民主共和国最近爆发了yfv，再加上yfv-17d疫苗供应短缺和yfv疾病缺乏有效治疗方法，这些mab代表了预防和/或疗法的有前景的候选者
44.因此，本文公开了用于治疗和/或预防yfv感染的高度选择性和有效的抗yfv抗体，以及可能的疫苗候选者。此外，此处公开的试剂为评估临床试验提供了一套有用的工具，这对于从目前正在研究的那些中选择最佳yfv疫苗接种或基于抗体的治疗策略至关重要。
45.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在本说明书和以下权利要求书中，将参考多个术语，所述多个术语应被定义为具有以下含义：
46.本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在进行限制。除非上下文另外清楚地说明，否则如本文所使用的，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”旨在包含复数形式。
[0047]“任选的(optional)”或“任选地(optionally)”是指随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且所述描述包含事件或情况发生的实例以及事件或情况不发生的实例。
[0048]
当在包含范围的数值指定例如温度、时间、量、浓度以及此类其它之前使用时，术语“约”指示可以变化(+)或(-)10％、5％、1％或在其之间的任何子范围或子值的近似值。优选地，当关于量使用时，术语“约”表示该量可以变化+/-10％。
[0049]“包括(comprising)”或“包括(comprise)”旨在意味着组合物和方法包含所叙述的要素，但不排除其它要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由
…
组成(consisting essentially of)”应当意味着排除对于所述目的的组合具有任何实质意义的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物将不排除不会实质影响所要求保护的发明的基本和新颖特性的其它材料或步骤。“由
…
组成(consisting of)”应当意味着排除超过痕量要素的其它成分和大量方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本公开的范围内。
[0050]“黄热病病毒”，被也称为“yfv”，是一种rna病毒，其通常通过受感染的伊蚊或血吸虫属蚊虫叮咬传播。
[0051]
术语“yfv-17d”是指通过在鸡和小鼠组织中传代野生型asibi菌株而开发的减毒
cdr3-fr4肽。其它工程化分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(smip)和鲨鱼变异ignar结构域也涵盖在本文所使用的表述“抗原结合片段”内。
[0058]
抗体的抗原结合片段通常包括至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包括至少一个与一个或多个构架序列相邻或在所述构架内的cdr。在具有与v
l
结构域相关的vh结构域的抗原结合片段中，vh结构域和v
l
结构域可以以任何合适的布置相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有v
h-vh、v
h-v
l
或v
l-v
l
二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可以含有单体vh或v
l
结构域。
[0059]
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有共价连接到至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以在本公开的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包含：(i)v
h-ch1；(ii)v
h-ch2；(iii)v
h-ch3；(iv)v
h-ch1-ch2；(v)v
h-ch1-ch2-ch3；(vi)v
h-ch2-ch3；(vii)v
h-c
l
；(viii)v
l-ch1；(ix)v
l-ch2；(x)v
l-ch3；(xi)v
l-ch1-ch2；(xii)v
l-ch1-ch2-ch3；(xiii)v
l-ch2-ch3；以及(xiv)v
l-c
l
。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包含上文所列的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本公开的抗体的抗原结合片段可以包括上文所列出的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，其彼此和/或与一个或多个单体vh或v
l
结构域非共价缔合(例如，通过一个或多个二硫键)。
[0060]
与全抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合单独的抗原或同一抗原上的不同表位。可以使用本领域可用的常规技术，使包含本文公开的示例性双特异性抗体形式的任何多特异性抗体形式适用于本公开的抗体的抗原结合片段的上下文中。
[0061]
每个重链包括重链可变区(“hcvr”或“v
h”)和重链恒定区(包括结构域ch1、ch2和ch3)。每个轻链包括轻链可变区(“lcvr”或“v
l”)和轻链恒定区(c
l
)。vh区和v
l
区可以进一步细分为被称作互补决定区(cdr)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作构架区(fr)的区域。每个vh和v
l
由自氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本公开的某些实施例中，抗体(或其抗原结合片段)的fr可以与人种系序列相同，或者可以是经天然或人工修饰的。可以基于两个或更多个cdr的并列分析来定义氨基酸共有序列。因此，重链中的cdr分别被命名为“cdrh1”、“cdrh2”和“cdrh3”，并且轻链中的cdr被命名为“cdrl1”、“cdrl2”和“cdrl3”。
[0062]
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段含有cdrl3结合结构域，所述结合结构域包括具有序列qqx1x2x3x4x5x6t的共有基序。x1是y、f或a，x2是n、h或y，x3是r、s、t或d，x4是d、f、y、w或p，x5是p或s，x6是y、f、k或w。以下克隆包含此共有基序：adi-50211；adi-48899；adi-45136；adi-45078；adi-49162；adi-49141；adi-42844；adi-48910；adi-45074；adi-49041；adi-50220；adi-42172；adi-42178；adi-50218；以及adi-49194。
[0063]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl3的抗体，其中所述cdrl3结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列qx1x2x3x4tx5x6t，其中x1是q或h，x2是a或s，x3是s或y，x4是t或s，x5是r或p，并且x6是y、l、w或r。以下克隆包含此共有基序：adi-42201；adi-45164；adi-46729；adi-42223；adi-46718；adi-45076；adi-48968；adi-45156；adi-50536；以及adi-50537。
[0064]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl3的抗体，其中所述cdrl3结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列gtwdx1sx2x3sagx4v，其中x1是s或t，x2是s或无氨基酸，x3是l或p，并且x4是k、g或r。以下克隆包含此共有基序：adi-45083；adi-42225；adi-42210；adi-42198；adi-42809；adi-42830；adi-42818；adi-42151；以及adi-50533。
[0065]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrh3的抗体，其中所述cdrh3结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列ax1x2ydsx3x4yyx5x6x7x8，其中x1是k或r，x2是y、f、t、a、g、y或h，x3是s、n或r，x4是a或g，x5是w或y，x6是f、l、i、a或e，x7是d、e或h，并且x8是y、h或s。以下克隆包含此共有基序：adi-45085；adi-50211；adi-45078；adi-49162；adi-45136；adi-42172；adi-49194；adi-50203；adi-42178；adi-48908；adi-42844；adi-48910；以及adi-49168。
[0066]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl2的抗体，其中所述cdrl2结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列x1x2x3x4rps，其中x1是d或e，x2是n、v或d，x3是k、n、d或s，并且x4是k、e或r。以下克隆包含此共有基序：adi-49039；adi-42229；adi-45097；adi-45083；adi-42225；adi-49139；adi-48969；adi-48900；adi-42786；adi-42210；adi-42198；adi-49154；adi-49188；adi-42188；adi-42809；adi-46596；adi-42830；adi-46591；adi-48955；adi-42818；adi-46586；adi-42151；adi-45140；adi-46722；adi-45128；adi-45127；adi-46739；adi-46724；adi-50539；adi-42114；adi-50533；以及adi-49205。
[0067]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl2的抗体，其中所述cdrl2结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列x1x2x3x4lx5x6，其中x1是a、g或r，x2是a或t，x3是s或t，x4是t、g、s或i，x5是q或r，并且x6是s或r。以下克隆包含此共有基序：adi-49133；adi-49033；adi-48895；adi-42201；adi-42230；adi-48916；adi-42211；adi-5164；adi-42191；adi-49145；adi-46729；adi-42189；adi-46718；adi-45076；adi-48968；adi-50203；adi-42227；adi-48894；adi-50218；adi-45156；adi-50536；adi-50537；adi-46737；adi-45123；以及adi-50200。
[0068]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl2的抗体，其中所述cdrl2结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列x1x2sx3rax4，其中x1是g、d、r或a，x2是a或s，x3是s、t或n，x4是t或a。以下克隆包含此共有基序：adi-49147；adi-50201；adi-45113；adi-50219；adi-48897；adi-42194；adi-42847；adi-48908；adi-42231；adi-42233；adi-45148；adi-42187；adi-42787；adi-49141；adi-42213；adi-42192；adi-49590；adi-48462；adi-42200；adi-42181；adi-49037；adi-49137；以及adi-42817。
[0069]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl2的抗体，其中所述cdrl2结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列x1vx2x3rps，其中x1是d、e或r，x2是s、t、n或a，并且x3是n、k或q。以下克隆包含此共有基序：adi-42228；adi-42190；adi-49183；adi-49189；adi-50205；adi-50531；adi-49138；adi-45154；adi-49161；adi-49561；adi-42219；
adi-48435；adi-45161；adi-42193；adi-42149；adi-42216；adi-42810；adi-48890；adi-42206；adi-48950；以及adi-42124。
[0070]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl2的抗体，其中所述cdrl2结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列x1asx2lex3，其中x1是r、q或k，x2是t、s、g、r或i，并且x3是t或s。以下克隆包含此共有基序：adi-42831；adi-42821；adi-45085；adi-50211；adi-48899；adi-49168；adi-45136；adi-45078；adi-42844；adi-48910；adi-49041；adi-42172；adi-42178；adi-49032；以及adi-49194。
[0071]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrh2的抗体，其中所述cdrh2结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列x1x2x3hx4x5x6x7x8yx9px
10
x
11
x
12
s，其中x1是d、e或s，x2是i或v，x3是f或y，x4是x或t，x5是g或e，x6是s、g或t，x7是t或a，x8是n、s、h、k或t，x9是n或s，x
10
是s或f，x
11
是l或v，并且x
12
是k或e。以下克隆包含此共有基序：adi-45083；adi-42225；adi-49139；adi-48900；adi-42232；adi-42786；adi-42210；adi-42198；adi-49154；adi-42188；adi-42809；adi-42818；adi-42151；adi-46722；adi-46742；adi-49141；adi-46739；adi-46724；adi-50539；adi-48951；adi-50538；以及adi-50533。
[0072]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrh2的抗体，其中所述cdrh2结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列x1x2x3x4dx5x6x7kx8x9adsx
10
x
11
g，其中x1是v或l，x2是i或m，x3是s、w或l，x4是f或y，x5是e或g，x6是s或t，x7是k、n或y，x8是f、w或y，x9是y或f，x
10
是v或l，并且x
11
是k或r。以下克隆包含此共有基序：adi-45097；adi-42144；adi-49138；adi-45154；adi-49561；adi-42189；adi-42844；adi-45161；adi-48462；adi-42172；adi-42178；adi-42217；adi-46737；adi-49205；adi-45151；以及adi-46728。
[0073]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl1的抗体，其中所述cdrl1结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列rx1sx2x3x4x5x6x7x8x9，其中x1是a或t，x2是q或r，x3是s或t，x4是i或v，x5是s或t，x6是s、n、t、f、d或g，x7是n、y、w、f或k，x8是l或v，并且x9是a或n。以下克隆包含此共有基序：adi-49147；adi-50201；adi-45113；adi-42201；adi-42194；adi-42847；adi-45085；adi-48908；adi-50211；adi-42231；adi-45164；adi-48899；adi-46729；adi-49168；adi-49040；adi-45136；adi-45078；adi-46718；adi-49141；adi-42844；adi-42192；adi-48910；adi-42200；adi-50203；adi-42181；adi-49041；adi-50220；adi-42172；adi-42178；adi-49032；adi-49137；adi-42817；adi-45156；adi-50536；adi-50537；以及adi-49194。
[0074]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl1的抗体，其中所述cdrl1结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列sgsx1snx2gx3x4x5vx6，其中x1是n或s，x2是i或f，x3是s或n，x4是n、y、s或d，x5是y、f或d，并且x6是s或a。以下克隆包含此共有基序：adi-49039；adi-42229；adi-45097；adi-45083；adi-42225；adi-48900；adi-42786；adi-42210；adi-42198；adi-49154；adi-42188；adi-42809；adi-46596；adi-42830；adi-46591；adi-48955；adi-42818；adi-46586；adi-42151；adi-45140；adi-46722；adi-45128；adi-46739；adi-46724；adi-50539；adi-42114；以及adi-50533。
[0075]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrl1的抗体，其中所述cdrl1结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列x1gtx2x3dx4gx5x6x7x8vs，其中x1是a或t，x2是s、g或r，x3是s或t，x4是v、f或i，x5是g或a，x6是y、d或f，x7是k或n，并且x8是y或f。以下克
隆包含此共有基序：adi-48969；adi-42228；adi-42190；adi-49183；adi-49189；adi-50205；adi-50531；adi-49138；adi-45154；adi-49161；adi-49561；adi-42219；adi-48435；adi-45161；adi-45127；adi-42149；adi-42216；adi-42810；adi-48890；adi-42206；adi-48950；adi-42124；以及adi-49205。
[0076]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrh1的抗体，其中cdrh1结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列：x1x2fx3x4x5x6x7x8，其中x1是f、y或l，x2是t、a、s或n，x3是s或t，x4是s、t或r，x5是y或l，x6是g、a、t、w、s或d，x7是m、i或l，并且x8是h、s、n或t。以下克隆包含此共有基序：adi-45090；adi-49044；adi-45113；adi-42144；adi-50026；adi-45075；adi-42230；adi-42154；adi-45085；adi-42211；adi-50211；adi-42231；adi-42233；adi-49168；adi-42187；adi-49561；adi-42219；adi-50535；adi-45136；adi-42189；adi-48435；adi-46718；adi-42844；adi-45161；adi-48910；adi-48462；adi-42200；adi-50203；adi-42149；adi-42172；adi-42178；adi-50197；adi-42810；adi-50218；adi-45156；adi-50536；adi-50537；adi-46737；adi-42114；adi-49194；adi-42124；以及adi-46728。
[0077]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrh1的抗体，其中cdrh1结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列：x1six2x3x4x5x6wx7，其中x1是g或i，x2是s或t，x3是s、t、g或无氨基酸，x4是d、s、t或g，x5是y、n或d，x6是w或y，并且x7是s或t。以下克隆包含此共有基序：adi-45083；adi-42225；adi-48900；adi-42786；adi-42210；adi-49188；adi-42188；adi-42818；adi-42151；adi-48913；adi-46722；adi-49141；adi-46741；adi-46739；adi-50539；adi-50538；以及adi-50533。
[0078]
在一些实施例中，本公开提供了包括yfv结合结构域cdrh1的抗体，其中cdrh1结合结构域包括共有基序，所述共有基序包括序列：fx1fsdx2ymx3，其中x1是i或t，x2是h或y，并且x3是a或d。以下克隆包含此共有基序：adi-42191；adi-49040；adi-42223；adi-42193；adi-48968；adi-42212；adi-45126；adi-42141；adi-49140；adi-48894；adi-42226；adi-49137；adi-48890；adi-42206；以及adi-49030。
[0079]
一个或多个cdr残基的取代或一个或多个cdr的省略也是可能的。在科学文献中已经描述了抗体，其中可以省去一个或两个cdr来进行结合。padlan等人(1995《美国生物实验学学会联合会刊(faseb j.)》9:133-139)基于已发表的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区域，并得出结论，只有大约五分之一到三分之一的cdr残基实际上与抗原接触。padlan还发现了许多抗体，其中一个或两个cdr没有与抗原接触的氨基酸(另见vajdos等人2002《分子生物学杂志(j mol biol)》320:415-428)。
[0080]
可以基于先前的研究(例如，通常不需要cdrh2中的残基h60-h65)，通过分子建模和/或凭经验从位于chothia cdr之外的kabat cdr区域中鉴定不接触抗原的cdr残基。如果省略cdr或其残基，则通常用占据另一人抗体序列或此类序列的共有序列中的对应位置的氨基酸进行取代。也可以凭经验选择cdr内的取代位置和要取代的氨基酸。
[0081]
与对应的种系序列相比，本文公开的完全人单克隆抗体可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或cdr区中包括一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定这种突变。本公开包含衍生自本文所公开的任何氨基酸序列的抗体和其抗原结合片段，其中
一个或多个框架和/或cdr区内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的种系序列的一个或多个对应的残基、或突变为另一种人种系序列的一个或多个对应的残基、或突变为一个或多个对应的种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，本领域普通技术人员可以容易地产生包括一个或多个单个种系突变或其组合的许多抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，vh结构域和/或v
l
结构域内的全部框架和/或cdr残基突变回在衍生抗体的原始种系序列中所发现的残基。在其它实施例中，仅将某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在fr1的前8个氨基酸内或在fr4的最后8个氨基酸内所发现的突变后的残基，或仅在cdr1、cdr2或cdr3内发现的突变后的残基。在其它实施例中，框架和/或cdr残基中的一者或多者被突变为不同种系序列(即，与最初衍生抗体的种系序列不同的种系序列)的对应残基。此外，本公开的抗体可以含有框架和/或cdr区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其它残基可以维持或突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得，可以容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所期望的性质，如经改善的结合特异性、增加的结合亲和力、经改善或增强的拮抗或激动的生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以此通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本公开内。
[0082]
本公开还包含完全单克隆抗体，其包括本文公开的具有一个或多个保守取代的任何cdr氨基酸序列的变体。例如，本公开包含具有cdr氨基酸序列的抗体，相对于本文公开的任何cdr氨基酸序列，所述cdr氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等保守氨基酸取代。在一些实施例中，所公开的抗yfv抗体和抗原结合片段是人抗体。如本文所使用的，术语“人抗体”旨在包含具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人抗体可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在cdr中，并且具体地说，在cdr3中。
[0083]
在一些实施例中，所公开的抗yfv抗体和抗原结合片段是重组抗体。术语“重组”通常是指通过基因工程方法产生的表达所关注基因的任何蛋白质、多肽或细胞。就蛋白质或多肽所使用的术语“重组”是指通过重组多核苷酸的表达产生的多肽。本公开的免疫原性组合物中使用的蛋白质可以从天然来源分离或通过基因工程方法产生。
[0084]
在一些实施例中，本公开的抗体可以是重组人抗体。如本文所使用的，术语“重组人抗体”旨在包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体，包含人抗体或人源化抗体，如使用转染到宿主细胞(以下进一步描述)内的重组表达载体表达的抗体、自重组、组合人抗体库(以下进一步描述)中分离的抗体、从对于人类免疫球蛋白基因而言为转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见例如，taylor等人(1992)《核酸研究(nucl.acids res.)》20:6287-6295)，或通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体，所述方式涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列上。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施例中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的vh和v
l
区的氨基酸序列是虽然衍生自人种系vh和v
l
序列并且与其相关但可能不天然存在于体内人抗体种系库中的序列。
[0085]
在一些实施例中，抗yfv抗体及其抗原结合片段是分离的抗体。如本文所使用的，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合yfv或其片段的分离的抗体基本上不含特异性结合除yfv以外的抗原的ab)。在一些实施例中，抗yfv抗体和抗原结合片段特异性结合yfv e蛋白，例如dii结构域或diii的fl。术语“特异性结合”或“与...特异性结合”等意指抗体或其抗原结合片段与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。特异性结合可以由至少约1x10-6
m或更小的平衡解离常数表征(例如，更小的kd表示更紧密的结合)。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，并且包含例如平衡透析、表面等离子体共振等。如本文所述，抗体已通过表面等离子共振(例如biacore
tm
、使用例如fortebio octet htx仪器(颇尔生命科学公司(pall life sciences))的生物层干涉测量法)鉴定，其特异性结合yfv。此外，如本文所使用的，与yfv蛋白和一种或多种额外抗原结合的多特异性抗体，或与yfv的两个不同区域结合的双特异性抗体仍然被认为是“特异性结合”的抗体。在某些实施例中，本文公开的抗体显示出的平衡解离常数(以及因此的特异性)为约1x10-6
m；约1x10-7
m；约1x10-8
m；约1x10-9
m；约1x10-10
m；介于约1x10-6
m和约1x10-7
m之间；介于约1x10-7
m和约1x10-8
m之间；介于约1x10-8
m和约1x10-9
m之间；介于约1x10-9
m和约1x10-10
m之间；或介于约1x10-9
m和约1x10-10
m之间。
[0086]
在一些实施例中，抗yfv抗体和抗原结合片段是高亲和力结合剂。术语“高亲和力”是指对yfv具有至少10-9
m；更优选地，10-10
m，更优选地10-11
m，更优选地10-12
m的结合亲和力(以kd表示)的mab，如通过表面等离子共振(例如biacore
tm
、使用例如fortebio octet htx仪器(颇尔生命科学公司)的生物层干涉测量法)或溶液亲和力elisa所测量的。
[0087]
术语“减慢速率”、“koff”或“kd”是指从yfv解离的抗体，其速率常数为1x10-3
s-1
或更小，优选地1x10-4
s-1
或更小，如通过表面等离子共振(例如biacore
tm
或fortebio octet htx仪器(颇尔生命科学公司)所确定的。
[0088]
本公开的具体实施例、抗体或抗体片段可以缀合至治疗部分(“免疫缀合物”)，如抗生素、第二抗yfv抗体、疫苗或类毒素，或对治疗yfv感染有用的任何其它治疗剂部分。
[0089]
还考虑了与本文提供的抗体基本上相同的抗体和抗原结合片段。当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上相同”表示，当通过适当的核苷酸插入或缺失与另一个核酸(或其互补链)进行最佳比对时，核苷酸序列同一性为核苷酸碱基的至少约90％，并且更优选地，至少约95％、96％、97％、98％或99％，如通过如fasta、blast或gap等任何众所周知的序列同一性算法所测量的，如以下所讨论的。因此，显示某一百分比“同一性”的核酸序列共享该百分比同一性，和/或彼此该百分比“相同”。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本同一性的核酸分子可以编码与参考核酸分子编码的多肽具有相同或基本上类似的氨基酸序列的多肽。
[0090]
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括此类抗体或其抗原结合片段的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列中的至少一者，其与选自表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的抗体的表3中公开的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和/或cdrl3氨基酸序列中的至少一者至少70％相同；至少75％相同；80％相同；至少85％相同；至少90％相同；至少95％相同；至少96％相同；至少97％相同；至少98％相同；至少99％；和/或介于它们之间的所有同一性百分比。
[0091]
在某些实施例中，抗体及其抗原结合片段包括被指定为表3中公开的抗体编号1到
抗体编号152的任何一种抗体的cdrh3氨基酸序列。
[0092]
在某些实施例中，抗体及其抗原结合片段包括被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrh2氨基酸序列。
[0093]
在某些实施例中，抗体及其抗原结合片段包括被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrh1氨基酸序列。
[0094]
在某些实施例中，抗体及其抗原结合片段包括被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrl3氨基酸序列。
[0095]
在某些实施例中，抗体及其抗原结合片段包括被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrl2氨基酸序列。
[0096]
在某些实施例中，抗体及其抗原结合片段包括被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrl1氨基酸序列。
[0097]
在一些实施例中，抗yfv抗体及其抗原结合片段与被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体至少70％相同；至少75％相同；80％相同；至少85％相同；至少90％相同；至少95％相同；至少96％相同；至少97％相同；至少98％相同；至少99％；和/或介于它们之间的所有同一性百分比。
[0098]
在某些实施例中，抗体及其抗原结合片段包括被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的重链(hc)氨基酸序列。
[0099]
在某些实施例中，本发明的抗体及其抗原结合片段包括被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的轻链(lc)氨基酸序列。在某些实施例中，本发明的抗体及其抗原结合片段包括被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的重链(hc)氨基酸序列和轻链(lc)氨基酸序列。
[0100]
在某些实施例中，抗体及其抗原结合片段各自选自由以下组成的组：被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的抗体。
[0101]
还提供了编码本文所述抗体的核酸。在某些实施例中，提供了编码特异性结合yfv的抗体及其抗原结合片段的分离的核酸序列，其中所述抗体或其所述抗原结合片段的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和/或cdrl3氨基酸序列中的至少一者与选自表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的抗体的表3中公开的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和/或cdrl3氨基酸序列中的至少一者至少70％相同；至少75％相同；80％相同；至少85％相同；至少90％相同；至少95％相同；至少96％相同；至少97％相同；至少98％相同；至少99％；和/或介于它们之间的所有同一性百分比。
[0102]
在某些实施例中，提供了编码抗体及其抗原结合片段的分离的核酸序列，其中此类核酸序列包括编码被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrh3氨基酸序列的序列。
[0103]
在某些实施例中，提供了编码抗体及其抗原结合片段的分离的核酸序列，其中此类核酸序列包括编码被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrh2氨基酸序列的序列。
[0104]
在某些实施例中，提供了编码抗体及其抗原结合片段的分离的核酸序列，其中此类核酸序列包括编码被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrh1氨基酸序列的序列。
[0105]
在某些实施例中，提供了编码抗体及其抗原结合片段的分离的核酸序列，其中此类核酸序列包括编码被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrl3氨基酸序列的序列。
[0106]
在某些实施例中，提供了编码抗体及其抗原结合片段的分离的核酸序列，其中此类核酸序列包括编码被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrl2氨基酸序列的序列。
[0107]
在某些实施例中，提供了编码抗体及其抗原结合片段的分离的核酸序列，其中此类核酸序列包括编码被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的cdrl1氨基酸序列的序列。
[0108]
在某些实施例中，提供了编码抗体及其抗原结合片段的分离的核酸序列，其中此类核酸序列包括编码被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的重链(hc)氨基酸序列的序列
[0109]
在某些实施例中，提供了编码抗体及其抗原结合片段的分离的核酸序列，其中此类核酸序列包括编码被指定为表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的任何一种抗体的重链(lc)氨基酸序列的序列。当应用于多肽时，术语“基本同一性”或“基本上相同”意指当如通过使用默认间隙权重的程序gap或bestfit进行最佳比对时，两个肽序列共享至少90％的序列同一性，甚至更优选地，至少95％、98％或99％的序列同一性。因此，显示某一百分比“同一性”的氨基酸序列共享该百分比同一性，和/或彼此该百分比“相同”。因此，显示某一百分比“同一性”的氨基酸序列共享该百分比同一性，和/或彼此该百分比“相同”。
[0110]
在某些实施例中，所公开的抗体氨基酸序列与其它序列例如：至少70％相同；至少75％相同；80％相同；至少85％相同；至少90％相同；至少95％相同；至少96％相同；至少97％相同；至少98％相同；至少99％；和/或介于它们之间的所有同一性百分比和/或彼此(或与本文公开的抗体序列的某些子集)共享此类百分比同一性。
[0111]
优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有化学性质(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(r基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。总体而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整百分比或类似性程度以校正取代的保守性质。用于做出此调整的方法是本领域技术人员所熟知的。(参见例如，pearson(1994)《分子生物学方法(methods mol.biol.)》24:307-331)。具有类似化学性质的侧链的氨基酸基团的实例包含：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替换是在以下文献中公开的pam250对数似然矩阵中具有正值的任何变化：gonnet等人(1992)《科学(science)》256:1443 45。“适度保守”替代是pam250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
[0112]
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列类似性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰(包含保守氨基酸取代)的类似性度量来匹配类似的序列。例如，
gcg软件含有如gap和bestfit等程序，所述程序可以在默认参数下使用以测定紧密相关的多肽(如来自不同生物体物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，6.1版gcg。还可以使用fasta(使用默认或推荐参数)——6.1版gcg中的程序来比较多肽序列。fasta(例如，fasta2和fasta3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的对齐和序列一致性百分比(pearson(2000)，同上文)。当比较本公开的序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库时，另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。(参见例如，altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403 410以及(1997)《核酸研究》25:3389 402)。
[0113]
在某些实施例中，用于本公开的方法的抗体或抗体片段可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以含有对多于一种靶多肽的表位具有特异性的抗原结合结构域。
[0114]
如本文所公开的，抗yfv抗体可以使用技术人员可用的技术从人b细胞获得，例如，如下文实例中所述。用于在如小鼠等转基因动物中产生人抗体的方法也是本领域已知的并且可以用于根据本公开衍生抗体。可以将任何此类已知方法用于本公开的上下文中以制备异性结合yfv的人抗体(参见例如us 6,596,541)。
[0115]
在某些实施例中，当通过与固定在固相上或溶液中的抗原的结合来测量时，本公开的抗体的亲和力(kd)范围为约1.0x10-7
m到约1.0x10-12
m。在某些实施例中，当通过与固定在固相上或溶液中的抗原的结合来测量时，本公开的抗体的亲和力(kd)范围为约1x10-7
m到约6x10-10
m。在某些实施例中，当通过与固定在固相上或溶液中的抗原的结合来测量时，本公开的抗体的亲和力(kd)范围为约1x10-7
m到约9x10-10
m。
[0116]
除了本文公开的特异性抗yfv抗体和抗体片段之外，本公开还考虑了维持生物等效性的那些抗体和抗体片段的变体。当与亲本序列相比时，此类变体抗体和抗体片段包括氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但表现出与所描述抗体的生物活性基本上等效的生物活性。同样，本公开的编码抗体的dna序列涵盖当与所公开的序列相比时包括核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代，但编码与本公开的抗体或抗体片段基本上生物等效的抗体或抗体片段的序列。
[0117]
如果例如，两种抗原结合蛋白或抗体是吸收速率和吸收程度在类似的实验条件下以相同的摩尔剂量施用(单次剂量或多次剂量)时不显示显著差异的药物等效物或药物替代物，则其被认为是生物等效的。如果一些抗体在其吸收程度上等效但在其吸收速率上不等效，则认为所述抗体是等效物或药物替代物，并且可以认为所述抗体是生物等效的，因为有意的并且反映在标记上的这种吸收速率差异在例如长期使用时对于达到有效的身体药物浓度并非是必需的并且对于所研究的特定药物产品而言被认为是医学上无关紧要的。
[0118]
在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白的安全性、纯度和效力不存在临床上有意义的差异，则所述两种抗原结合蛋白是生物等效的。
[0119]
在一个实施例中，与不存在参考产品和生物产品之间的转换的持续治疗相比，如果患者可以在参考产品和生物产品之间转换一次或多次而没有预期的副作用风险增加(包含免疫原性的临床显著变化或有效性降低)，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。
[0120]
在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白均通过针对一个或多个使用条件的一种或多种共同作用机制起作用(只要这些机制是已知的)，则所述两种抗原结合蛋白是生物等
效的。
[0121]
生物等效性可以通过体内和/或体外方法来证明。生物等效性测量包含，例如，(a)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中在血液、血浆、血清或其它生物流体中测量抗体或其代谢物的浓度随时间的变化；(b)与人体内生物利用度数据相关并且可合理预测的体外试验；(c)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中测量抗体(或其靶标)的适当急性药理作用随时间的变化；以及(d)在建立抗体的安全性、功效或生物利用度或生物等效性的控制良好的临床试验中。
[0122]
可以通过例如对残基或序列进行各种取代或使非生物活性所需的末端或内部残基或序列缺失来构建本公开的抗体的生物等效变体。例如，可以使非生物活性所必需的半胱氨酸残基缺失或用其它氨基酸替代，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫桥。在其它上下文中，生物等效抗体可以包含抗体变体，所述抗体变体包括修饰抗体的糖基化特性的氨基酸变化，例如消除或去除糖基化的突变。
[0123]
抗体的生物学和生物物理特性
[0124]
在某些实施例中，本发明的抗体及其抗原结合片段与yfv特异性结合，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和/或cdrl3氨基酸序列中的至少一者与选自表3中公开的抗体编号1到抗体编号152的抗体的表3中公开的对应cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和/或cdrl3氨基酸序列至少70％相同；至少75％相同；80％相同；至少85％相同；至少90％相同；至少95％相同；至少96％相同；至少97％相同；至少98％相同；至少99％；和/或介于它们之间的所有同一性百分比。
[0125]
在一些实施例中，抗yfv抗体及其抗原结合片段是中和抗体，即表现出中和效力。如本文所使用的，“中和抗体”(或“中和yfv活性的抗体”或“具有中和活性的抗体”)是指这样一种抗体，其与抗原的结合(例如，视情况而定，本文所公开的yfv e蛋白)导致抑制至少一种生物活性。例如，本公开的抗体可有助于阻断yfv与宿主细胞的融合，或防止合胞体形成，或预防由yfv引起的原发性疾病。可替代地，本公开的抗体可以证明改善yfv感染的至少一种症状的能力。这种对yfv生物活性的抑制可以通过用一种或多种标准体外测定法(如中和测定法，如本文所述)或本领域已知的体内测定法(例如，观察在施用一种或多种本文所述的抗体后对yfv攻击的保护作用的动物模型)测量yfv生物活性的一种或多种指标来进行评估。
[0126]
在某些实施例中，抗体及其抗原结合片段显示出的体外中和效力(ic
50
)介于约0.5微克/毫升(μg/ml)到约5μg/ml之间；介于约0.05μg/ml到约0.5μg/ml之间；或小于约0.05mg/ml。
[0127]
术语“ic
50”是指“半数最大抑制浓度”，该值衡量化合物(例如抗yfv抗体)对生物或生化效用的抑制的有效性。这种定量度量指示特定抑制剂将给定生物过程抑制一半所需的量。在某些实施例中，本文公开的抗yfv中和抗体的yfv中和效力表示为中和ic
50
值。在本文所述的抗体中，通常与yfv e蛋白的diii结合的抗体具有最高的中和效力。
[0128]
在一些实施例中，抗体及其抗原结合片段与denv-2、denv-4、wnv或zikv e蛋白交叉反应，即结合至yfv e蛋白和来自一种或多种其它黄病毒的e蛋白。在某些实施例中，此类抗体及其抗原结合片段以高表观亲合亲和力(k
dapp
《10nm)结合至denv-2、denv-4、wnv、yfv和zikv e蛋白。在某些实施例中，交叉反应性抗体或其抗原结合片段具有针对yfv-17d和另
一种黄病毒的中和活性。在某些实施例中，交叉反应性抗体及其抗原结合片段与fl表位结合。在某些实施例中，交叉反应性抗体及其抗原结合片段与diii结合。在某个实施例中，交叉反应性抗体是adi-48905。
[0129]
表位分箱和相关技术
[0130]
如上所述并且如实例中所证明的，申请人已经表征了本发明抗体及其抗原结合片段的表位分箱。除了进行此类表征的方法之外，技术人员还可以使用各种其它技术，这些技术可用于进行此类表征或以其它方式确定抗体是否“与多肽或蛋白质内的一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包含，例如，常规交叉阻断测定，如可以进行所述的抗体，harlow和lane(纽约冷泉港的冷泉港出版社(cold spring harbor press,cold spring harb.,ny))。其它方法包含丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(reineke(2004)《分子生物学方法》248:443-63)、肽切割分析晶体学研究和nmr分析。另外，可以采用如表位切除、表位提取及抗原的化学修饰等方法(tomer 2000,《蛋白质科学(protein science)》9:487-496)。可以用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对所关注的蛋白质进行氘标记，然后将抗体与经氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，并且受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比并非是界面的一部分的氨基酸内的可交换质子慢的速率经历氢-氘反交换。因此，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可以保留氘，并且因此表现出与并未包含在界面中的氨基酸相比相对较高的质量。在解离抗体后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，由此揭示与同抗体相互作用的特定氨基酸相对应的经氘标记的残基。参见例如，ehring(1999)《分析生物化学(analytical biochemistry)》267(2):252-259；engen和smith(2001)《分析化学(anal.chem.》73:256a-265a。
[0131]
如技术人员将理解的，表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。在独特的空间构象中，表位通常包含至少3个(并且更常见地，至少5个或8-10个)氨基酸。
[0132]
修饰辅助分析(map)，也被称为基于抗原结构的抗体分析(asap)，是一种根据每种抗体与化学或酶促修饰的抗原表面的结合特征的类似性，对大量针对相同抗原的单克隆抗体(mab)进行分类的方法(us 2004/0101920)。每个类别可以反映一个独特的表位，该表位与另一个类别所代表的表位明显不同或部分重叠。该技术允许快速过滤基因相同的抗体，从而可以将表征集中在基因不同的抗体上。当应用于杂交瘤筛选时，map可能有助于鉴定产生具有所期望特性的mab的稀有杂交瘤克隆。map可用于将本公开的抗体分选成结合不同表位的抗体组。
[0133]
如技术人员所理解的，通过使用本领域可用的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参考抗yfv抗体结合相同的表位或者与所述参考抗yfv抗体竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本公开的参考yfv抗体结合相同的表位，使参考抗体在饱和条件下与yfv蛋白或肽结合。接下来，评估测试抗体与yfv分子结合的能力。如果测试抗体能够在与参考抗yfv抗体饱和结合后结合yfv，则可以得出结论，测试抗体与参考抗yfv抗体结合不同的表位。另一方面，如果测试抗体在与参考抗yfv抗体饱和结合后不能够结合抗yfv分子，则测试抗体可以结合与由本公开的参考抗yfv抗体所结合的表位相同的表位。
[0134]
为了确定抗体是否与参考抗yfv抗体竞争结合，在两个取向上进行上述结合方法：在第一取向上，使参考抗体在饱和条件下与yfv分子结合，然后评估测试抗体与yfv分子的结合。在第二取向上，使测试抗体在饱和条件下与yfv分子结合，然后评估参考抗体与yfv分子的结合。如果在两个取向上只有第一(饱和的)抗体能够与yfv分子结合，则得出结论，测试抗体和参考抗体竞争结合yfv。如本领域普通技术人员所理解的，与参考抗体竞争结合的抗体可能不一定与参考抗体结合相同的表位，但是可以通过结合重叠或相邻表位来在空间上阻断参考抗体的结合。
[0135]
如果两种抗体中的每种抗体竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则所述两种抗体与相同或重叠的表位结合。换言之，一种抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量将另一种抗体的结合抑制至少50％，但优选地75％、90％或者甚至99％，如在竞争性结合测定中所测量的(参见例如，junghans等人,《癌症研究(cancer res.)》(1990)50:1495-1502)。可替代地，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则所述两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的某些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则所述两种抗体具有“重叠表位”。
[0136]
然后可以进行额外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认所观察到的测试抗体的结合缺乏是否实际上是由于与参考抗体结合相同的表位，或者是否是空间阻断(或其它现象)导致所观察到的结合缺乏。可以使用elisa、ria、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域可用的任何其它定量或定性抗体结合测定执行这种分选的实验。
[0137]
免疫缀合物
[0138]
本公开涵盖与治疗部分(“免疫缀合物”)缀合的人yfv单克隆抗体，如能够降低yfv原发感染的严重程度或改善与yfv感染相关的至少一种症状(包含发烧、肌肉疼痛、头痛、呕吐、腹泻、出血或其严重程度)的药剂。这种药剂可以是针对yfv的第二种不同抗体或疫苗。可以与抗yfv抗体缀合的治疗部分的类型将考虑待治疗的病状和要实现的所期望的治疗效果。可替代地，如果所期望的治疗效果是治疗与yfv感染相关的后遗症或症状，或由此类感染引起的任何其它病状，如但不限于弥散性血管内凝血、急性肾衰竭和急性呼吸窘迫综合征，则可能有利的是，缀合适于治疗病状的后遗症或症状或减轻本公开抗体的任何副作用的药剂。用于形成免疫缀合物的合适的药剂的实例是本领域已知的，参见例如，wo 05/103081。
[0139]
多特异性抗体
[0140]
本公开的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以含有对多于一种靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如，tutt等人,1991,《免疫学期刊(j.immunol.)》147:60-69；kufer等人,2004,《生物科技趋势(trends biotechnol.)》22:238-244。本公开的抗体可以与另一种功能分子例如另一种肽或蛋白连接或共表达。例如，抗体或其片段可以与如另一种抗体或抗体片段等一个或多个其它分子实体(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)功能性地连接，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
[0141]
治疗剂施用和调配物
[0142]
本公开提供了包括本发明的抗yfv抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。根据本公开的治疗剂组合物的施用将与合适的载体、赋形剂和并入到调配物中以提供改进的转
移、递送、耐受性等的其它试剂一起施用。在为所有药物化学家所知的处方集中可以找到大量合适的调配物：《雷明顿氏药物科学(remington's pharmaceutical sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(mack publishing company,easton,pa)。这些调配物包含例如粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如lipofectin
tm
)、dna缀合物、无水吸收膏、水包油和油包水乳剂、碳蜡乳剂(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。参见例如powell等人“用于肠胃外调配物的赋形剂的汇编(compendium of excipients for parenteral formulations)”pda(1998)《药物科学与技术杂志(j pharm sci technol)》52:238-311。
[0143]
本公开的每种抗体的剂量可以根据待施用的受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。当本公开的抗体用于治疗yfv感染，或用于治疗与yfv感染相关的一种或多种症状(如与患者的yfv感染相关的发热、恶心或肌肉疼痛)或用于减轻疾病的严重程度时，静脉内或皮下施用本公开的每种抗体是有利的。通常，每种抗体将以约0.01到约30mg/kg体重，更优选地，约0.1到约20mg/kg体重，或约0.1到约15mg/kg体重，或约0.02到约7mg/kg体重，约0.03到约5mg/kg体重，或约0.05到约3mg/kg体重，或约1mg/kg体重，或约3.0mg/kg体重，或约10mg/kg体重，或约20mg/kg体重的单剂量施用。必要时可施用多剂量。根据病状的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施例中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以以至少约0.1mg到约800mg、约1到约600mg、约5到约300mg或约10到约150mg、到约100mg或到约50mg的初始剂量施用。在某些实施例中，在初始剂量之后可以施用第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其量可以与初始剂量大致相同或更少，其中所述随后的剂量相隔至少1天到3天；至少一周、至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
[0144]
各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本公开的药物组合物，例如，包封在脂质体、微颗粒、微胶囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用中(参见例如，wu等人(1987)《生物化学杂志(j.biol.chem.)》262:4429-4432)。引入的方法包含但不限于皮内、透皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径施用组合物，例如通过输注或团注注射、通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、鼻粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。其可以作为雾化调配物递送(参见us2011/0311515和us2012/0128669)。用于通过吸入治疗呼吸道疾病的药剂的递送正变得越来越被广泛接受(参见a.j.bitonti和j.a.dumont,(2006),《先进药物递送评论(adv.drug deliv.rev)》,58:1 106-1 1 18)。除了有效治疗局部肺部疾病外，这种递送机制还可用于抗体的全身递送(参见maillet等人(2008),《药学研究(pharmaceutical research)》,第25卷,第6期,2008)。
[0145]
药物组合物也可以在囊泡(具体地说，脂质体)中递送(参见例如langer(1990)《科学》249:1527-1533)。
[0146]
在某些情况下，可以在控释系统中递送药物组合物。在一个实施例中，可以使用泵。在另一个实施例中，可以使用聚合材料。在又一个实施例中，可以将控释系统放置在组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。
[0147]
可注射制剂可以包含用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法制备。例如，可注射制剂可以通过例如将上述抗体或其盐溶
解、悬浮或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，例如，有生理盐水、含有葡萄糖的等渗溶液以及其它助剂等，其可以与适当的增溶剂，如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、hco-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，可以采用例如，芝麻油、大豆油等，其可以与如苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶剂组合使用。如此制备的注射剂优选地填充在适当的安瓿中。
[0148]
可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本公开的药物组合物。另外，关于皮下递送，笔递送装置易于应用于递送本公开的药物组合物。此类笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常利用含有药物组合物的可更换药筒。一旦已经施用了药筒内的全部药物组合物，并且药筒是空的，就可以轻易地丢弃空药筒，并且用含有药物组合物的新药筒更换。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性笔递送装置中，没有可更换的药筒。相反，一次性笔递送装置预装有固持在装置内的贮存器中的药物组合物。一旦贮存器中的药物组合物被清空，就丢弃整个装置。
[0149]
许多可重复使用的笔递送装置和自动注射器递送装置应用于皮下递送本公开的药物组合物。实例包含但当然不限于autopen
tm
(英国伍德斯托克的欧曼福德公司(owen mumford,inc.,woodstock,uk))、disetronic
tm
笔(瑞士波道夫的disetronic医疗系统公司(disetronic medical systems,burghdorf,switzerland))、humalog mix 75/25
tm
笔、humalog
tm
笔、humalin 70/30
tm
笔(印第安纳州印第安纳波利斯的礼来公司(eli lilly and co.,indianapolis,in))、novopen
tm i、ii和iii(丹麦哥本哈根的诺和诺德公司(novo nordisk,copenhagen,denmark))、novopen junior
tm
(丹麦哥本哈根的诺和诺德公司)、bd
tm
笔(新泽西州富兰克林湖的贝迪医疗(becton dickinson,franklin lakes,nj))、optipen
tm
、optipen pro
tm
、optipen starlet
tm
以及opticlik
tm
(德国法兰克福市的赛诺菲公司(sanofi-aventis,frankfurt,germany))，仅举几例。应用于皮下递送本公开的药物组合物的一次性笔递送装置的实例包含但当然不限于solostar
tm
笔(赛诺菲公司)、flexpen
tm
(诺和诺德公司)以及kwikpen
tm
(礼来公司)、sureclick
tm
自动注射器(加利福尼亚州的千橡市安进公司(amgen,thousand oaks,ca))、penlet
tm
(德国斯图加特的haselmeier公司(haselmeier,stuttgart,germany))、epipen(dey公司(dey,l.p.))以及humira
tm
笔(伊利诺伊州雅培科技园的雅培实验室(abbott labs,abbott park il))，仅举几例。
[0150]
有利的是，将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适合于配合一定剂量的活性成分的单位剂量剂型。单位剂量的这种剂型包含例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿剂)、栓剂等。所含有的上述抗体的量通常为每单位剂量剂型约5mg到约500mg；特别是在注射形式下，优选地上述抗体的含量为约5mg到约100mg，对于其它剂型，约10mg到约250mg。
[0151]
施用方案
[0152]
在一些实施例中，治疗有效量的抗yfv抗体或其抗原结合片段在其进料中提供给例如感染yfv或处于感染yfv风险的受试者。短语“治疗有效量”意指施用以产生期望效果的量。确切的量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域的技术人员使用已知的技术确定(参见例如，lloyd(1999)《药物复合的艺术、科学和技术(the art,science and technology of pharmaceutical compounding)》)。
[0153]
根据某些实施例，可以在限定的时间过程中向受试者施用多剂针对yfv的抗体。根据本公开的这个方面的方法包括向受试者依次施用多个剂量的针对yfv的抗体。如本文所使用的，“依次施用”意指在不同时间点，例如在相隔预定间隔(例如，几小时、几天、几周或几个月)的不同日子，将每一剂针对yfv的抗体施用给受试者。本公开包含方法，所述方法包括向患者依次施用单一初始剂量的针对yfv的抗体，然后施用一个或多个第二剂量的针对yfv的抗体，并且任选地随后施用一个或多个第三剂量的针对yfv的抗体。
[0154]
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用针对yfv的抗体的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也被称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量后施用的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量可以均含有相同量的针对yfv的抗体，但是在施用频率方面通常可能彼此不同。然而，在某些实施例中，在治疗过程期间，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中含有的针对yfv的抗体的量彼此不同(例如，适当地向上或向下调整)。在某些实施例中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)剂量作为“负载剂量”，然后在较不频繁的基础上施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。
[0155]
在本公开的一个示例性实施例中，在前一剂量后1到26(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周施用每个第二剂量和/或第三剂量。如本文所使用的，短语“前一剂量”是指按照多次施用的顺序，在顺序中的下一个剂量施用之前施用给患者的针对yfv的抗体的剂量，没有中间剂量。
[0156]
根据本公开的这个方面的方法可以包括向患者施用任意数量的第二和/或第三剂量的针对yfv的抗体。例如，在某些实施例中，仅向患者施用单个第二剂量。在其它实施例中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第二剂量。同样地，在某些实施例中，仅向患者施用单个第三剂量。在其它实施例中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第三剂量。
[0157]
在涉及多个第二剂量的实施例中，每个第二剂量可以按与其它第二剂量相同的频率施用。例如，可以在前一剂量后1到2周向患者施用每个第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施例中，每个第三剂量可以按与其它第三剂量相同的频率施用。例如，可以在前一剂量后2到4周向患者施用每个第三剂量。可替代地，向患者施用第二剂量和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中变化。施用频率也可以在医师的治疗过程中根据临床检查后个体患者的需要进行调整。
[0158]
因此，在某些实施例中提供了药物组合物，其包括：本文和全文公开的一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体和/或一种或多种赋形剂。在某些其它实施例中，提供了药物组合物，其包括：编码一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段的一种或多种核酸序列；或含有此类核酸序列的一种或多种表达载体；以及药学上可接受的载体和/或一种或多种赋形剂。
[0159]
抗体的治疗用途
[0160]
本文公开的抗yfv抗体可用于治疗患有yfv的受试者和/或预防yfv感染。
[0161]
如本文所使用的，术语“治疗(treat、treatment和treating)”是指减少或改善yfv
感染的进展、严重程度和/或持续时间，或由施用一种或多种疗法(包含但不限于施用一种或多种预防剂或治疗剂)引起的与其相关的症状或病状(如发烧、寒战、头痛、腰痛、肌痛、食欲不振、恶心、呕吐、疲劳或其组合)。在某些实施例中，此类术语是指减少或抑制yfv的复制，抑制或减少yfv向其它受试者的传播，抑制或减少yfv对细胞的感染，或改善与yfv感染相关的一种或多种症状。
[0162]
如本文所使用的，术语“预防(prevent、preventing和prevention)”是指预防或抑制受试者中yfv感染或与其相关的病状的发展或发作，预防或抑制由施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)引起的yfv感染或与其相关的病状的进展，预防yfv感染或与其相关的病状的症状，或施用疗法的组合(例如，预防剂或治疗剂的组合)。如本文所使用的，术语“改善”和“减轻”是指减轻或降低病状或其任何症状的严重程度。
[0163]
由于它们与yfv的结合和相互作用，据信本发明的抗体及其抗原结合片段
–
不希望受任何理论束缚
–
可用于防止病毒与宿主细胞膜融合，用于防止细胞间病毒传播，并用于抑制合胞体的形成。可替代地，本公开的抗体可用于改善与感染相关的至少一种症状，如发热、腹泻和出血，或用于减轻感染的严重程度、持续时间和/或频率。本公开的抗体还考虑了用于处于发展或获得yfv感染的风险下的患者中的预防性用途。经考虑，本公开的抗体可单独使用，或与第二药剂或第三药剂联合使用以治疗yfv感染，或用于减轻与yfv感染相关的至少一种症状或并发症，如与此类感染相关或由此类感染引起的发烧、恶心或肌肉疼痛。第二或第三药剂可以与本公开的抗体同时递送，或者它们可以在本公开的抗体之前或之后单独施用。第二或第三药剂可以是抗病毒剂、nsaid或其它减轻发热或疼痛的药剂、另一种特异性结合yfv的第二种但不同的抗体、与另一种yfv抗原结合的药剂(例如抗体)、针对yfv的疫苗yfv，以及对yfv抗原具有特异性的sirna。
[0164]
在本公开的又一个实施例中，本发明的抗体用于制备用于治疗患有yfv感染的患者的药物组合物。在本公开的另一个实施例中，本发明的抗体用于制备用于降低yfv原发感染的严重程度、或用于缩短感染持续时间、或用于减轻与yfv感染相关的至少一种症状的药物组合物。在本公开的另外的实施例中，本发明的抗体与可用于治疗yfv感染的任何其它药剂一起用作辅助疗法，所述其它药剂包含抗病毒剂、类毒素、疫苗、第二yfv抗体或对yfv抗原具有特异性的任何其它抗体，或本领域技术人员已知的任何其它姑息疗法。
[0165]
因此，在某些实施例中，提供了治疗或预防yfv感染或与yfv感染相关的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要或疑似有需要的患者施用本文和全文公开的一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段，例如表3中公开的一种或多种抗yfv抗体，使得所述yfv感染被治疗或预防，或与yfv感染相关的至少一种症状被治疗、减轻或在严重程度上降低。
[0166]
在某些其它实施例中，提供了治疗或预防yfv感染或与yfv感染相关的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要或疑似有需要的患者施用编码一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段的核酸序列，所述核酸序列编码表3中公开的氨基酸序列及其互补序列，使得所述yfv感染被治疗或预防，或与yfv感染相关的至少一种症状被治疗、减轻或在严重程度上降低。
[0167]
在额外的实施例中，提供了治疗或预防yfv感染或与yfv感染相关的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要或疑似有需要的患者施用宿主细胞，所述宿主细胞含有核酸序列或包括此类核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列编码选自表3中公开的序列及
其互补序列的氨基酸序列，使得所述yfv感染被治疗或预防，或与yfv感染相关的至少一种症状被治疗、减轻或在严重程度上降低。
[0168]
在额外的实施例中，提供了治疗或预防yfv感染或与yfv感染相关的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要或疑似有需要的患者施用药物组合物，所述药物组合物包括：如表3中所公开的一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段；一种或多种核酸序列或包括此类核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列编码选自表3中公开的序列及其互补序列的氨基酸序列；一种或多种宿主细胞，所述宿主细胞含有一种或多种核酸序列或包括此类一种或多种核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列编码选自表3中公开的序列及其互补序列的氨基酸序列；以及药学上可接受的载体和/或一种或多种赋形剂，使得所述yfv感染被治疗或预防，或与yfv感染相关的至少一种症状被治疗、减轻或在严重程度上降低。
[0169]
在某些实施例中，提供了治疗或预防yfv感染或与所述yfv感染相关的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要或疑似有需要的患者施用本文和全文公开的一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段，例如表3中公开的一种或多种抗yfv抗体，使得所述yfv感染被治疗或预防，或与yfv感染相关的至少一种症状被治疗、减轻或在严重程度上降低。
[0170]
在某些其它实施例中，提供了治疗或预防yfv感染或与所述yfv感染相关的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要或疑似有需要的患者施用编码一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段的核酸序列，所述核酸序列编码表3中公开的氨基酸序列及其互补序列，使得所述yfv感染被治疗或预防，或与yfv感染相关的至少一种症状被治疗、减轻或在严重程度上降低。
[0171]
在额外的实施例中，提供了治疗或预防yfv感染或与所述yfv感染相关的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要或疑似有需要的患者施用含有核酸序列或包括此类核酸序列的表达载体的宿主细胞，其中此类核酸序列编码选自表3中公开的序列及其互补序列的氨基酸序列，使得所述yfv感染被治疗或预防，或与yfv感染相关的至少一种症状被治疗、减轻或在严重程度上降低。
[0172]
在额外的实施例中，提供了治疗或预防yfv感染或与所述yfv感染相关的至少一种症状的方法，所述方法包括向有需要或疑似有需要的患者施用药物组合物，所述药物组合物包括：如表3中所公开的一种或多种本发明抗体或其抗原结合片段；一种或多种核酸序列或包括此类核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列编码选自表3中公开的序列及其互补序列的氨基酸序列；一种或多种宿主细胞，所述宿主细胞含有一种或多种核酸序列或包括此类一种或多种核酸序列的表达载体，其中此类核酸序列编码选自表3中公开的序列及其互补序列的氨基酸序列；以及药学上可接受的载体和/或一种或多种赋形剂，使得所述yfv感染被治疗或预防，或与yfv感染相关的至少一种症状被治疗、减轻或在严重程度上降低。
[0173]
组合疗法
[0174]
如上所述，根据某些实施例，所公开的方法包括向受试者施用一种或多种额外的治疗剂以及针对yfv的抗体。如本文所使用的，表述“与
……
组合”意指在包括抗yfv抗体的药物组合物之前、之后或同时施用额外的治疗剂。术语“与
……
组合”还包含抗yfv抗体和第二治疗剂的顺序或同时施用。
[0175]
例如，当在包括抗yfv抗体的药物组合物“之前”施用时，额外的治疗剂可以在施用包括抗yfv抗体的药物组合物之前约72小时、约60小时、约48小时、约36小时、约24小时、约
12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟或约10分钟施用。当在包括抗yfv抗体的药物组合物“之后”施用时，额外的治疗剂可以在施用包括抗yfv抗体的药物组合物之后约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时或约72小时施用。与包括抗yfv抗体的药物组合物“同时”施用意指在施用包括抗yfv抗体的药物组合物不到5分钟内(在之前、之后或同时)以单独的剂型向受试者施用额外的治疗剂，或作为包括额外的治疗剂和抗yfv抗体的单一组合剂量调配物向受试者施用。
[0176]
组合疗法可以包含本公开的抗yfv抗体和可以有利地与本公开的抗体或与本公开的抗体的生物活性片段组合的任何额外的治疗剂。
[0177]
例如，可以采用第二或第三治疗剂来帮助降低肝脏中的病毒负载，如抗病毒剂。如上所述，抗体也可以与其它疗法联合使用，所述其它疗法包含类毒素、对yfv具有特异性的疫苗、对yfv具有特异性的第二抗体或对另一种yfv抗原具有特异性的抗体。
[0178]
抗体的诊断用途
[0179]
本发明的抗yfv抗体及其抗原结合片段也可用于检测和/或测量样品中的yfv，例如用于诊断目的。经设想，可以通过使用本公开的任何一种或多种抗体测量病毒的存在来确认被认为是由yfv引起的感染。yfv的示例性诊断测定可以包括例如使从患者获得的样品与本公开的抗yfv抗体接触，其中yfv抗体用可检测标记或报告基因分子标记或用作捕获配体以选择性地从患者样品中分离出含有该蛋白质的病毒。可替代地，未标记的yfv抗体可以与本身被可检测地标记的二级抗体组合以用于诊断应用。可检测标记或报告基因分子可以是如3h、
14
c、
32
p、
35
s或
125
i等放射性同位素；荧光或化学发光部分，如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可用于检测或测量样品中的yfv的具体示例性测定包含酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)和荧光活化细胞分选(facs)。
[0180]
可用于根据本公开的yfv诊断测定中的样品包含可从患者获得的任何组织或流体样品，其在正常或病理条件下含有可检测量的yfv蛋白或其片段。通常，将测量从健康患者(例如，未患有与yfv存在相关的疾病或病状的患者)获得的特定样品中yfv的水平，以初步建立yfv蛋白的基线或标准水平。然后可以将yfv的此基线水平与从疑似患有yfv感染或与这种感染相关的症状的个体获得的样品中测量的yfv水平进行比较。
[0181]
实例
[0182]
在用yfv-17d免疫后，通过从两个未感染过黄病毒的供体的记忆b细胞中分离和表征152个yfv特异性单克隆抗体来全面分析人抗体对yfv的响应，然后使用这些抗体来绘制yfv的抗原拓扑。经发现，获得的抗yfv抗体结合几个抗原位点，最常见的是靶向yfv e蛋白的结构域ii的fl内或fl近端的表位，因此，为开发靶向结构域ii的yfv抗体提供了支持。然而，经发现，第二类不太常见的具有高效中和活性的抗体靶向病毒的diii。此类diii定向抗体在单克隆抗体或混合物的治疗应用中可能特别有价值，因为该表位在自然免疫响应中处于次要地位。总之，这些结果对yfv疫苗和基于抗体的候选治疗药物的设计和评估具有重要意义，并为被动预防提供了新的选择。
[0183]
研究设计：用yfv-17d疫苗(stamaril；赛诺菲)对两个未感染黄病毒的健康成年供体(“供体8”和“供体9”)进行免疫，并在接种后10天、14天、28天、90天、180天、270天和360天
时收集血液样品。到疫苗接种后第14天，两个供体中都出现了针对yfv-17d的血清中和活性，并在整个研究过程中持续存在(图1a)。来自两个供体的疫苗接种前血清缺乏与yfv-17d的反应性，并且没有显示出对yfv-17d的可检测中和活性(数据未示出)，并且也缺乏与来自其它常见的流行黄病毒的e和ns1蛋白的反应性，即登革热病毒血清型1-4(denv1-4)、jev、tbev、西尼罗河病毒(wnv)和寨卡病毒(zikv)，这证实这两个供体在接种疫苗时可能都未感染过黄病毒(数据未示出)。
[0184]
yfv-17d诱导的浆母细胞响应的分子和功能表征
[0185]
在疫苗接种后10天和14天时监测两个供体中的浆母细胞响应。在这两个供体中，在10天和14天时间点都观察到扩大的浆母细胞群体，其比疫苗接种前的水平高约10倍(图2a)。通过单细胞pcr对来自每个供体的大约300个浆母细胞进行分选并扩增对应的vh和vl区域。分别从供体8和供体9克隆了161个和210个天然配对的抗体，并在工程化的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株中表达为全长igg。序列分析显示，两个供体的浆母细胞响应高度多样化，只有约15％的克隆属于扩展的克隆谱系(数据未示出)。来自两个供体的大部分浆母细胞衍生型抗体含有高水平的体细胞超突变(shm)，这表明mbc有效募集到pb响应中(数据未示出)。pb衍生型mab中shm的中值水平在第10天显著高于第14天。相应地，从第14天pb克隆的更大比例的mab缺乏shm，这表明该时间点从原初b细胞区室募集的细胞增加(数据未示出)。
[0186]
为了分析pb衍生型mab中的体细胞突变是否有助于结合活性，从三个体细胞突变的pb克隆产生了推断未分解的普通祖先(uca)mab，并测量其与重组yfv e蛋白的结合亲和力。在所有三种情况下，与成熟的mab相比，uca mab均显示出大幅度降低的结合亲和力，这表明pb mab中的体细胞突变对于识别yfv e很重要(图3)。
[0187]
然后，使用夹心elisa测定法测试了pb衍生型mab与yfv-17d颗粒的结合反应性(图2b)。从第10天和第14天pb中分离的yfv-17d结合性mab的频率范围为8-41％。从供体8和9中的扩展的pb群体中回收了45个和46个yfv-17d结合性mab，然后以100和10nm浓度在微滴度中和测定中分析mab的中和活性。中和活性的范围从10nm时的完全中和到在100nm时无可检测到的中和(图2c)。与第10天pb相比，从第14天pb分离出的更大部分的mab显示出中和活性，这与两个供体中第14天对比第10天的血清中和活性增加是一致的(数据未示出)。在100nm时显示出至少50％感染抑制的mab上的中和滴定实验表明，从第14天pb中分离出的yfv-17d结合性mab中有9-12％显示出中到高的中和活性(ic
50
≤10nm)(图2d和图4)。序列分析表明，12.5
–
33％的pb衍生型nab利用vh4-4/vl1-51种系基因配对，这表明对常见抗原位点的识别(数据未示出)。
[0188]
分别从供体8和9中分离出的约50％和22％的中和抗体缺乏体细胞突变，这表明yfv-17d中和抗体存在于原初b细胞库中，并表明yfv-17d疫苗接种诱导起源于原初和mbc的pb响应，并且这些b细胞中只有少数编码显示出中和活性的ab。参见图1a和1b。
[0189]
yfv-17d诱导的mbc响应的分子和功能表征
[0190]
通过在第14天、第28天、第90天、第180天、第270天和第360天收集pbmc来监测两个供体的mbc响应，并将纯化的b细胞用一组先前描述的b细胞表面标志物(cd19、cd20、cd27、igm、igd、cd21和cd71)和荧光标记的重组yfv e蛋白染色(图5a)。yfv e特异性swig
+
mbc在两个供体中出现在第14-28天，在第90天和第180天之间达到峰值，并在第180天和第360天
之间缓慢下降(图5b)。
[0191]
在每个采样时间点，从两个供体中对100
–
400个yfv e反应性b细胞进行分选。通过所采用的分选策略捕获了原初b细胞衍生的非结合性mab，但其被排除在随后的分析之外。对在单细胞分选的yfv e反应性b细胞上表达的b细胞表面标志物的分析表明，mbc对yfv e的响应在所有时间点上都是高度异质的(数据未示出)。在最早的采样时间点(第14天)，活化的原初b细胞和igm+cd27+mbc在两个供体的响应中占主导地位，但是这些b细胞群体随着时间的推移迅速减弱。到第90天，不到15％的yfv e特异性响应包括igm+cd27+mbc，并且到第360天，只有约5％的yfv e特异性b细胞属于该mbc群体(图8b)。相比之下，swig+mbc群体(包括cd27+和cd27-b细胞二者)在第14天和第90天之间扩展，然后在整个研究过程中保持稳定。在自然感染puuv后，还观察到在yfv-17d疫苗接种后观察到的mbc响应(数据未示出)。
[0192]
在每个采样时间点跟踪yfv e特异性mab的shm负载、表观结合亲和力(k
dapp
)和中和效力。在两个供体中，第14天的shm的中值水平都很低(超过50％的ab缺乏体细胞突变)，并且在6-9个月的时间段内逐渐增加，在疫苗接种后9个月在两个供体中保持平稳，其中针对供体8和9，vh中的核苷酸取代中值分别为9和7(数据未示出)。重组yfv e蛋白的结合研究表明，mbc衍生型mab的k
dapp
在早期时间点非常弱，并且在疫苗接种后6-9个月内逐渐改善(数据未示出)。在疫苗接种后第14天和第28天，大多数yfv e特异性mab显示出k
dapp
》50nm，而到第180天，约有50％的yfv e特异性mab显示出k
dapp
《5nm。在亲和力增加的同时，从第90天开始观察到高度有效的中和抗体的出现(ic
50
《1nm)(数据未示出)。这些中和抗体衍生自多个mbc子集，包含非典型igm+和/或igd+mbc(数据未示出)。表2总结了分离的和表征的中和mab的亲和力和中和数据。
[0193]
通过分析yfv e特异性mbc上cd71和cd21的表达来评估持续的b细胞活化。cd71在第14天在75
–
85％的yfv e特异性b细胞上表达，并在两个供体中持续约6个月保持升高(数据未示出)。在两个供体中，yfv e特异性cd21
lo
细胞在疫苗接种后的第14天和第28天都以高频率存在，占yfv e特异性响应的约40
–
80％，然后在第90天迅速下降。虽然cd71
+
和cd21
lo
群体之间高度重叠，其中50-80％的yfv e特异性活化的b细胞(被定义为cd71
+
和/或cd21
lo
)在第14天显示出cd71
+
cd21
lo
表型，到第28-90天，cd71
+
cd21
lo
群体在两个供体中均降低到《50％的活化b细胞响应，并且大多数yfv e特异性活化的b细胞显示出cd71
+
cd21
+
或cd71
─
cd21
lo
表型，并且在同种型和cd27表达方面是异质的(数据未示出)。
[0194]
抗yfv抗体的分离和表征
[0195]
分离并表征了大约152个中和单克隆抗体。通过单细胞pcr挽救抗体可变重链(vh)和可变轻链(vl)基因。tiller等人(2008)《免疫学方法杂志(j immunol methods)》329,112-124。随后将同源重链和轻链对克隆并表示为工程化的酿酒酵母菌株中的全长igg，以进一步表征。bornholdt等人,(2016)《科学》351,1078-1083。
[0196]
分析了分离的mab的种系基因使用。在两个供体中，利用vh3-72种系基因的mab在所有时间点的响应中都占主导地位(图6a)。这些mab中很大一部分还利用了五个显性轻链(lc)种系基因之一，并显示出短于平均的重链(hc)互补确定区3(cdrh3)长度，这表明共享的抗原识别模式(图6b-c)。利用vh3-72的mab的结合亲和力显著高于针对利用其它vh种系的mab所观察到的结合亲和力，尽管含有类似的shm水平(图6d-e)。表1总结了分离的mab的种系使用和核苷酸取代数量。
[0197]
为了探索分离的mab的表位覆盖范围，使用新分离的mab和两个良好表征的对照mab(4g2和5a)进行了成对竞争实验，所述mab识别yfv e单体的dii内的近端但不重叠的表位。4g2是靶向fl的泛黄病毒mab，而5a是yfv e特异性mab，其结合至与拟议的prm关联区域重叠的fl-近端表位。使用carterra lsa仪器上的高通量表面等离子体共振(spr)进行竞争实验。还通过bli评估了mab与重组yfv-17d diii蛋白的反应性。大多数mab都识别出八个不同的抗原位点之一，这些位点是基于与diii的反应性以及与4g2、5a和三个新分离的mab(adi-49147、adi-44112和adi-45107)的竞争定义的(图7a)。mab的子集与5a和adi-45107二者竞争，这表明这两个抗原位点处于近距离状态。mab的小子集(772个中的6个)识别diii内的表位。diii定向mab中的五个交叉竞争，而第六个adi-48945可能会识别出独特的表位。来自两个供体的mab中超过一半都与4g2和/或5a竞争，这表明大多数yfv e特异性响应是由靶向dii上的fl内或fl近端的表位的ab介导的(图7a)。几乎所有利用vh3-72种系基因的mab都与4g2竞争(图7b)。因此，对通过竞争组聚类的mab的序列特征的分析表明，与4g2竞争的超过一半的mab利用了vh3-72种系基因(图7c)。与利用其它vh种系基因的mab相比，利用vh3-72的4g2竞争者mab显示出明显更高的亲和力(图7d)。尽管靶向每个抗原位点的mab的比例并未随着时间的流逝而发生巨大变化，但在供体8的后期时间点(第270天和第360天)观察到4g2/5a竞争者mab的抑制。此外，在两个供体中，与5a和adi-45107二者竞争的mab直到第28-90天才出现。结果表明，绝大多数yfv e特异性响应针对结构域ii上的fl内或fl近端的表位，并且在b细胞响应yfv-17d的成熟期间，ab免疫主力层次结构中只有很小的转变。
[0198]
高度有效的中和抗体识别fl近端表位
[0199]
研究了抗原位点与中和效力之间的关系。仅与5a竞争或与5a和adi-45107二者竞争的mab中有超过90％表现出中和活性(图8a)。组中的高度有效的中和抗体(ic
50
《1nm)中的大多数(78％)属于这两个竞争组(图8b-8c)。表2提供了这些抗体的箱数据。对这些仅5a或5a/adi-45107竞争者中和抗体的序列特征的分析表明，将近40％利用vh4-4/vl1-51种系基因配对，并且未显示出收敛的cdrh3序列的证据，这表明种系编码的抗原识别的一种常见模式(图8d)。与先前的研究一致，大多数diii定向mab也显示出高度有效的中和活性。与5a竞争者和diii定向mab相反，属于其它竞争组的mab中只有少数显示出中和活性。例如，仅与4g2竞争或与4g2和5a二者竞争的mab中只有12％和20％显示出中和ic
50
《100nm。结果表明，nab对yfv-17d的响应主要由识别yfv e蛋白的dii内的fl近端表位的ab介导。
[0200]
mab的子集显示出与来自其它黄病毒的e蛋白的交叉反应性
[0201]
评估了分离的mab与重组denv-2、denv-4、wnv或zikv e蛋白的结合反应性。在两个供体中，约6％的yfv e反应性mab显示出与至少一个异源黄病毒e蛋白的交叉反应性(图9a)。这些交叉反应性mab中的大多数靶向高度保守的fl表位，并与所有五种具有高表观亲合亲和力(k
dapp
《10nm)的黄病毒e蛋白结合(图9b-9c)。相应地，与fl之外的表位结合的mab的小子集通常显示出更有限的交叉反应性曲线和较低的k
dapp
(图9c)。在50个交叉反应性mab中，只有6个显示出对yfv-17d的中和活性，并且只有一个mab(diii结合剂adi-48905)显示出可检测到的对zikv的中和活性，尽管较弱(ic
50
～100nm)。mab对西尼罗河病毒或日本脑炎病毒报告基因病毒颗粒均没有可测量的中和活性。因此，yfv-17d疫苗接种似乎诱导了显示出广泛黄病毒结合活性的ab的子集，其中大多数靶向高度保守的fl，并且几乎没有交叉中和活性。
[0202]
下表1提供了本文所述的152种抗yfv抗体的种系使用和氨基酸序列信息。表1中提供的序列包含每个列出的抗体的cdrh3序列(seq id no:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、27、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300和302)和cdrl3序列(seq id no:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、29、31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 79 81 83 85 87 89 91 93 95 97 99 101 103 105 107 109 111 113 115 117 119 121 123 125 127 129 131 133 135 137 139 141 143 145 147 149 151 153 155 157 159 161 163 165 167 169 171 173 175 177 179 181 183 185 187 189 191 193 195 197 199 201 203 205 207 209 211 213 215 217 219 221 223 225 227 229 231 233 235 237 239 241 243 245 247 249 251 253 255 257 259 261 263 265 267 269 271 273 275 277 279 281 283 285 287 289 291 293 295 297 299 301和303)。
[0203]
下表2提供了表1中列出的152种抗yfv抗体的亲和力和中和数据。
[0204]
下表3提供了表1中列出的152种抗yfv抗体中每一种抗体的重链和轻链的cdr的部分氨基酸序列。cdr以粗体/下划线表示。每个cdr氨基酸序列也在序列表中单独列出(cdrh1和cdrh2对应于seq id no:607-840；cdrl1和cdrl2对应于seq id no:841-1005)。
[0205]
表1：抗yfv抗体的种系使用和序列信息
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215][0216]
[0217]
表2：抗yfv抗体的亲和力和中和数据
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222][0223]
*nn-非中和；n.d.
–
未确定；其它
–
未阻断任何列出的竞争测定对照
[0224]
表3：非正式序列表
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237]
[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
[0242]
[0243]
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248]
[0249]
[0250]
[0251]
[0252]
[0253]
[0254]
[0255][0256]
材料与方法
[0257]
研究设计
[0258]
对30岁和31岁的研究受试者接种yfv-17d stamaril疫苗。在接种疫苗前和接种疫苗后第10天、第14天、第28天、第90天、第180天、第270天和第360天从受试者获得肝素化血液(50
–
100cc)。将样品在达特茅斯盖泽尔医学院(geisel school of medicine at dartmouth)的免疫监测和流式细胞术核心实验室进行处理，以获得血浆并分离外周血衍生的b细胞。将分离的细胞和血浆在-80℃下冷冻保存。
[0259]
细胞：使用0.05％胰蛋白酶/edta溶液(gibco)每3至4天对huh 7.5.1细胞(从jan carette博士获得；最初从frank chisari博士获得)传代一次，并将其维持在杜氏改良的伊格尔氏培养基(dmem高葡萄糖，gibco)中，所述培养基补充有10％热灭活胎牛血清(fbs，atlanta biologicals)、1％青霉素/链霉素(p/s，gibco)、1％gluta-max(gibco)和25mm hepes(gibco)。使用0.05％胰蛋白酶/edta溶液(gibco)每3至4天对vero非洲灰尾猴肾细胞(从atcc获得)进行传代，并将其维持在杜氏改良的伊格尔氏培养基(dmem高葡萄糖，gibco)中，所述培养基补充有2％热灭活胎牛血清(fbs，atlanta biologicals)、1％青霉素/链霉
cy5.5)、cd8(percp-cy5.5)、cd14(percp-cy5.5)和cd16(percp-cy5.5)对pbmc进行染色。浆母细胞被定义为cd19+cd3-cd20-/locd27highcd38high细胞。对于mbc分选，使用macs b细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司(miltenyi biotec)；目录号130-091-151)对b细胞进行纯化，随后使用抗人cd19(pe-cy7)、cd20(pe-cy7)、cd3(percp-cy5.5)、cd8(percp-cy5.5)、cd14(percp-cy5.5)、cd16(percp-cy5.5)、igd(bv421)、igm(af-488)、cd27(bv510)、cd21(bv605)、cd71(apc-cy7和双标记(apc和pe)yfv e四聚体的混合物(各25nm)进行染色。为每个实验新鲜制备四聚体，并将对yfv e四聚体显示出反应性的b细胞进行单细胞分选。使用bd facs aria ii(bd生物科学公司(bd biosciences))将单细胞分选到96孔pcr板(biorad)中，该板含有20ul/孔裂解缓冲液[5ul的5x第一链cdna缓冲液(英杰公司(invitrogen))、0.625ul np-40(新英格兰生物实验室(new england biolabs))、0.25ul rnaseout(英杰公司)、1.25ul二硫苏糖醇(英杰公司)和12.6ul dh2o]。将板立即储存在-80℃下。使用flowjo软件分析流式细胞术数据。
[0268]
抗体可变基因的扩增和克隆
[0269]
如前所述，使用igg特异性引物和igm特异性引物的混合物通过逆转录pcr和嵌套pcr对抗体可变基因(igh、igk和igl)进行扩增(tiller等人,《免疫学期刊》2008)。第二轮pcr中使用的引物含有40个碱基对，其与消化后的表达载体具有5'和3'同源性，这允许通过同源重组克隆到酿酒酵母中。使用用于化学转化的醋酸锂方法将pcr产物克隆到酿酒酵母中(gietz和schiestl,《自然实验室指南(nat protoc)》2007)。每个转化反应使用10ul未纯化的重链和轻链pcr产物以及200ng消化后的表达载体。转化后，挑选单个酵母菌落进行测序和表征。
[0270]
igg和fab片段的表达和纯化
[0271]
如前所述，将igg在生长于24孔板中的酿酒酵母培养物中表达(bornholdt等人,《科学》2016b)。6天后，通过离心收获培养物并通过蛋白a亲和色谱纯化igg。用200mm乙酸/50mm nacl(ph 3.5)将结合的抗体洗脱到1/8体积的2m hepes(ph 8.0)中，并将缓冲液交换到pbs(ph 7.0)中。
[0272]
在人igg1恒定区中产生两种yfv e反应性对照mab，5a和4g2。将两种对照抗体4g2和5a的公开可用的可变区序列合成为具有同源突出端的gblock片段(idt)，用于重组克隆到酿酒酵母中。如上所述进行随后的生产。
[0273]
通过用木瓜蛋白酶将igg在30℃下消化2小时来产生fab片段。通过添加碘乙酰胺终止消化，并将fab和fc混合物通过蛋白a琼脂糖以去除fc片段和未消化的igg。然后将蛋白a树脂流过captureselect
tm igg-ch1亲和树脂(赛默飞世尔科技公司(thermofischer scientific))，并用200mm乙酸/50mm nacl ph 3.5洗脱到1/8体积的2m hepes ph 8.0中。然后将fab片段缓冲交换到pbs ph 7.0中。
[0274]
结合测量的动力学
[0275]
igg结合的表面等离子共振动力学测量(spr)：biacore 8k系统，与cap传感器芯片对接，样品室设置为10℃，流通池温度设置为25℃，并且数据收集速率设置为10hz。hbs-ep+(10mm hepes ph 7.3、150mm nacl、3mm edta、0.05％表面活性剂p20)用作运行缓冲液。在每个周期中，将在运行缓冲液中以1:20稀释的生物素capture试剂(通用电气医疗集团)以5微升/分钟的流速注入流通池1和2中，持续600秒，然后在流通池2中捕获(1微升/分钟)生物
素化的yfv e抗原(25nm，于hbs-ep+中)，持续900秒，以达到400ru的最低捕获水平。然后将抗体(36
–
288nm，于hbs-ep+中)注入流通池1和2中，持续300秒(30微升/分钟)，监测解离300秒(30微升/分钟)，并将表面在寡核苷酸水平上用0.25mnaoh中的6m胍-hcl再生120秒(10微升/分钟)。至少两次空白(hbs-ep+)注入也在与上述相同的条件下运行，用于评估和减去系统伪影。使用biacore 8k评估软件1.0版对数据进行对齐、双重参考并拟合到二价分析物结合模型。
[0276]
fab结合的表面等离子体共振动力学测量(spr)：biacore 8k系统，与cap传感器芯片对接，样品室设置为10℃，流通池温度设置为25℃，并且数据收集速率设置为10hz。hbs-ep+(10mm hepes ph 7.3、150mm nacl、3mm edta、0.05％表面活性剂p20)用作运行缓冲液。在每个周期中，将在运行缓冲液中以1:20稀释的生物素capture试剂(通用电气医疗集团)以1微升/分钟的流速注入流通池1和2中，持续600秒，然后在流通池2中捕获(1微升/分钟)生物素化的yfv e蛋白(15nm，于hbs-ep+中)，持续900秒，以达到275ru的最低捕获水平。然后将fab(a5:27
–
1nm，于hbs-ep+中；4g2:4
–
0.125nm，于hbs-ep+中)注入流通池1和2中，持续300秒(30微升/分钟)，监测解离1200秒(30微升/分钟)，并将表面在寡核苷酸水平上用0.25m naoh中的6m胍-hcl再生185秒(10微升/分钟)。至少两次空白(hbs-ep+)注入也在与上述相同的条件下运行，用于评估和减去系统伪影。使用biacore 8k评估软件1.0版对数据进行对齐、双重参考并拟合到1:1结合模型。
[0277]
生物层干涉动力学测量(bli)：对于单价表观kd测定，使用fort
é
bio octet htx仪器(美谷分子仪器公司(molecular devices))通过生物层干涉(bli)测量igg与重组yfv e抗原的结合。将igg捕获(1.5nm)到抗人igg捕获(ahc)生物传感器(美谷分子仪器公司)上，并使其在pbsf(具有0.1％w/v bsa的pbs)中静置至少30分钟。在pbsf中的短暂(60秒)基线步骤后，负载igg的生物传感器尖端暴露(180秒，1000rpm轨道振动)于yfv e抗原(100nm，于pbsf中)，然后浸入(180秒，1000rpm轨道振动)pbsf中，以测量抗原从生物传感器尖端表面的任何解离。使用fort
é
bio数据分析软件11.1版对结合响应》0.1nm的数据进行对齐、步间校正(相对于关联步骤)并拟合到1:1结合模型。
[0278]
对于二价表观kd测定，使用fort
é
bio octet htx仪器(美谷分子仪器公司)通过生物层干涉(bli)测量igg与重组yfv e抗原的结合。将重组生物素化的yfv e固定在链霉亲和素生物传感器(美谷分子仪器公司)上，并使其在pbsf(具有0.1％w/v bsa的pbs)中静置至少30分钟。在pbsf中的短暂(60秒)基线步骤后，负载抗原的生物传感器尖端暴露(180秒，1000rpm轨道振动)于igg(100nm，于pbsf中)，然后浸入(180秒，1000rpm轨道振动)pbsf中，以测量igg从生物传感器尖端表面的任何解离。使用fort
é
bio数据分析软件11.1版对结合响应》0.1nm的数据进行对齐、步间校正(相对于关联步骤)并拟合到1:1结合模型。
[0279]
高通量抗体表位分配
[0280]
生物层干涉(bli)表位分箱：对于表位分箱，在抗人igg捕获生物传感器(0.9nm)(美谷分子仪器公司)上捕获对照抗体a5和4g2(作为人igg1嵌合体产生)，然后通过将生物传感器暴露于阿达木单抗(0.5mg/ml；20分钟，350rpm轨道振动)来阻断生物传感器。在pbsf中的短暂(60秒)基线步骤后，在样品igg和负载的生物传感器之间进行交叉相互作用检查(180秒，1000rpm轨道振动)。对于这组igg，没有观察到交叉相互作用。然后将负载的生物传感器在pbsf中进行第二次短暂(60秒)基线步骤，然后在100nm重组yfv e单体中进行关联步
骤(180秒，1000rpm轨道振动)。最后，在含有0.1％bsa的pbs(pbsf)中的100nm样品igg中进行分箱步骤(180秒，1000rpm轨道振动)。使用fort
é
bio数据分析软件11.1版分析数据。分箱响应低于0.1nm的样品igg被确定为与对照抗体竞争。分箱响应大于0.1nm的样品igg被确定为与对照抗体不竞争。
[0281]
使用carterra lsa(spr)的高通量表位分箱
[0282]
结合动力学和亲和力。使用配备有hc-30m芯片类型的carterra高通量表面等离子体共振(spr)生物传感器平台，在25℃的温度下以“捕获动力学”测定形式确定黄热病抗原(作为经纯化的重组单体由adimab提供，mw为45kda)与770+adi mab(作为经纯化的人igg提供)文库结合的动力学速率和亲和常数。为了准备用于该实验的表面，在10mm hepes ph7.4、150mm nacl、3mm edta、0.05％tween20的运行缓冲液(hbset)中使用标准胺偶联将芯片包被为“菌台(lawn)”，其带有捕获试剂，即多克隆交叉吸附到来自多个其它物种的血清蛋白的山羊抗人igg fc(南方生物科技公司(southern biotech)，目录号2014-01)。简而言之，这涉及用hbset运行缓冲液引发单流通池(sfc)，持续10分钟注入新鲜制备的1:1:1 v/v/v 0.1m n-羟基磺基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs，pierce)+0.4m 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)(edc，pierce)+0.1m mes ph 5.5(carterra)的活化溶液，将稀释到10mm醋酸钠ph 4.3中的50μg/ml山羊抗人igg fc偶联15分钟，以及用1m乙醇胺ph 8.5将过量的反应性酯淬灭7分钟。这导致6256ru
±
4％方差的平均最终偶联水平(由384个反应点判断)。然后将96通道打印头(96ph)在运行缓冲液中引发并用于捕获作为配体的adi mab，将adi mab在运行缓冲液中稀释至2μg/ml，并一次将96个打印头批量打印到离散点上。使用96ph的四次连续对接来寻址所有4个打印块位置，从而产生384个配体的阵列。将96ph放回水中进行清洗，将sfc对接在打印的阵列上并用hbset+0.5g/l bsa的测定运行缓冲液引发。将黄热病单体抗原的分析物样品制备为跨越0.02-367nm标称浓度的8元4倍稀释系列，并在几次缓冲液(空白)注射后以递增浓度注入sfc。结合和解离时间分别为5分钟和20分钟。如下在carterra动力学软件中分析数据。通过从局部参考点(代表裸捕获试剂)中减去响应，然后从缓冲液空白分析物中减去响应来双重参考反应点上的结合数据66。将双重参考数据全局拟合到一个简单的langmuir模型，从而允许每个点都有自己的关联速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和rmax值。平衡解离(亲和力)常数(kd)由动力学速率常数的比率计算，kd＝kd/ka)。
[0283]
表位分箱实验：carterra的lsa用于使用6种基准mab(adi-49582、adi-44112、adi-45107、adi-49147、4g2和5a)作为分析物，以经典夹心测定格式67进行表位分箱测定，以探测770+adi文库作为配体的表位多样性。使用hcx-30m(预活化)芯片类型并在25℃下进行实验。在25mm mes ph5.5+0.01％tween20的运行缓冲液中引发sfc和96ph。将adi mab在10mm醋酸钠ph 4.5(偶联缓冲液)中稀释至2μg/ml，并通过96ph偶联，每个打印块位置的接触时间为7分钟。在96ph进行4次连续对接以构建384个配体的阵列后，将sfc对接在整个表面上，以通过持续7分钟注入乙醇胺ph8.5来淬灭过量的反应性酯。每个mab的最终偶联水平范围为每个点1000-4000ru。将96ph放回水中进行清洗，并将sfc在hbset+0.5g/l bsa的测定运行缓冲液中引发。每个分箱周期都涉及一种共注入的样品递送方式，其中抗原(50nm黄热病单体)和抗体分析物(20ug/ml mab或缓冲液)样品连续注入，它们之间在384个配体的阵列上的解离时间最短。典型的结合时间为3或5分钟，并且在每个分箱周期后用75mm磷酸对表
面进行再生。在carterra的表位软件中分析了结合数据。
[0284]
微滴度中和测定
[0285]
将单克隆抗体在含有10％热灭活fbs(gibco)、1％gluta-max gibco)、1％p/s(gibco)和25mm hepes(gibco)的dmem高葡萄糖培养基(gibco)中连续稀释，并在室温下与yfv-17d或zikv一起温育1小时。将yfv-17d或zikv稀释以达到60％的终点感染。将抗体-病毒混合物一式三份添加到含有前一天接种的5x10^3huh 7.5.1cell细胞单层的96孔板(costar 3595)中。将细胞在37℃和5％co2下培养2天。然后将细胞用4％多聚甲醛(西格玛公司(sigma))固定10分钟，然后用tris缓冲液(50mm tris、150mm nacl(所有均来自赛默飞世尔科技公司)，ph 7.6洗涤三次。将固定后的细胞与2μg/ml泛黄病毒小鼠mab 4g2(atcc)在含有3％脱脂奶粉(biorad)、0.5％triton x-100(mp生物医疗公司(mp biomedicals))和0.05％tween 20(飞世尔科技公司)的tris缓冲液中在室温(rt)下温育一小时。之后，将细胞洗涤三次，并与缀合至alexa fluor 488山羊抗小鼠(英杰公司)的二级抗体一起在室温下以1:500稀释度温育一小时。再次洗涤细胞并将细胞核用pbs中1:2,000稀释的hoechst-33342(英杰公司)染色。通过使用cytation-5自动荧光显微镜(biotek)从捕获的图像中自动计数alexa fluor 488阳性细胞来测量病毒感染性，并使用gen5数据分析软件(biotek)进行分析。使用graphpad prism软件的非线性回归分析计算mab的半数最大抑制浓度(ic50)。对病毒中和数据进行非线性回归分析以提取半数最大抑制浓度(ic50)值(4参数，可变斜率s型剂量响应方程；graphpad prism)。
[0286]
供体血浆样品的中和完全按照上面对经纯化的igg的描述进行。在添加到细胞单层之前，将血浆的系列稀释液与yfv-17d感染原液一起预温育1小时。
[0287]
在针对yfv-17d和zikv(目录号ab_2337042，杰克逊免疫研究(jackson immuno research))的经纯化的igg中和测定中，使用来自未免疫供体的经纯化的总人igg作为阴性对照。
[0288]
frnt测定
[0289]
如前所述筛选病毒特异性mab。简而言之，将所有经纯化的mab在含有5％热灭活胎牛血清(fbs)(gibco-英杰公司)的199培养基(赛默飞世尔科技公司)中连续稀释，并在37℃下与yfv-17dd一起温育。温育1小时后，将ab-病毒混合物一式两份添加到含有vero e6细胞80％汇合单层的96孔板中。将板在37℃下温育1.5小时。然后在含有5％热灭活fbs(gibco-英杰公司)和1％两性霉素b的补充optimem glutamax培养基(英杰公司)中用1％甲基纤维素覆盖孔，并将孔在37℃、5％co2下温育72小时。然后将细胞用perm/wash缓冲液(bd生物科学公司)固定和透化30分钟。透化后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤，并与在perm/wash缓冲液中1:2000稀释的抗黄病毒抗体(mab10216，emd密理博公司(emd millipore))一起温育2小时。温育后，将细胞用pbs洗涤并与抗小鼠辣根过氧化物酶(hrp)缀合的二级抗体(115035146，杰克逊免疫研究实验室)一起温育2小时。用过氧化物酶底物(kpl)洗涤和显影板。使用graphpad prism软件的非线性回归分析计算mab的半数最大抑制浓度(ic50)。
[0290]
血清和经纯化的igg elisa
[0291]
对于ns1和e结合性elisa，将96孔板(康宁公司(corning)；目录号3690)用稀释在pbs中的5μg/ml ns1或e蛋白包被，并在4℃下温育过夜。洗涤孔，然后在37℃下用pbs中的5％脱脂奶粉(nfdm)封闭1小时。将孔用pbs洗涤3次，并添加人血浆在5％nfdm-pbs中的连续
稀释液，并在37℃下温育1小时。然后将板用pbs洗涤3次，并在37℃下在5％nfdm-pbs中以1:8000稀释度添加二级交叉吸附的抗人igg-hrp(赛默飞世尔科技公司；目录号31413)或抗人igm(西格玛奥德里奇公司(sigma aldrich)；目录号ap114p)检测抗体，持续1小时。用pbs洗涤3次后，按照制造商的建议(赛默飞世尔科技公司；目录号34029)添加检测试剂，并使用spectramax微孔板读取器(美谷分子仪器公司)在450nm波长处测量吸光度。
[0292]
对于病毒结合性elisa，将96孔elisa板用稀释在pbs中的5ug/ml 4g2(密理博mab10216)包被，并在37℃下温育2小时。用pbs洗涤3次后，将整个yfv-17d病毒颗粒在pbs ph 7.4中稀释并在4℃下温育过夜。然后将板用pbs洗涤3次，并在37℃下用5％nfdm-pbs封闭1小时。去除封闭液后，使稀释在5％nfdm-pbs中的测试抗体在37℃下结合1小时。然后将板用pbs洗涤3次，并在37℃下在5％nfdm-pbs中以1:8000稀释度添加二级交叉吸附的抗人igg-hrp(赛默飞世尔科技公司；目录号31413)或抗人igm(西格玛奥德里奇公司(sigma aldrich)；目录号ap114p)检测抗体，持续1小时。用pbs洗涤3次后，按照制造商的建议(赛默飞世尔科技公司；目录号34029)添加检测试剂，并使用spectramax微孔板读取器(美谷分子仪器公司)在450nm波长处测量吸光度。
[0293]
如上文所述进行经纯化的igg与病毒颗粒的结合。将igg稀释在5％nfdm-pbs中，并在100nm浓度下对浆母细胞和mbc衍生的第14天抗体进行单点反应性测试。
[0294]
本文引用的所有参考文献、专利和专利出版物均在此通过引用整体并入本文，用于其中教导的所有内容。