电穿孔装置和方法与流程

电穿孔装置和方法
相关申请的交叉引用
1.本技术根据35 u.s.c.
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119(e)要求于2019年11月11日提交的美国临时申请第62/933,717号的优先权。本技术还根据35 u.s.c.
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119(e)要求于2019年11月25日提交的美国临时申请第62/940,032号的优先权。美国临时专利申请第62/933,717号和第62/940,032号通过引用以其整体并入本文。


背景技术：

2.电穿孔是向细胞施加电场从而增加细胞膜渗透性的技术。这允许将药物、化学品和/或大分子(诸如蛋白质和核酸(诸如各种形式的dna和rna))引入细胞。电穿孔也可称为电转染(electrotransfer)。


技术实现要素：

3.一般来说，在一个方面，实施例涉及电穿孔装置。电穿孔装置包括：多个腔室，该多个腔室被配置用于在电穿孔过程期间存储多个细胞；多个电极，该多个电极被配置用于在电穿孔过程期间在多个腔室内产生多个电场，多个电场中的每个电场对应于多个腔室中的一个腔室；流道，该流道被配置用于在电穿孔过程之后的细胞收集过程期间传输多个细胞；以及多个阀，该多个阀将多个腔室连接到流道。
4.一般来说，在一个方面，实施例涉及方法。该方法包括：通过使用多个电极在多个腔室内产生多个电场来执行电穿孔过程，其中多个腔室被配置用于在电穿孔过程期间存储多个细胞。该方法进一步包括通过以下方式执行细胞收集过程：打开连接到多个腔室的多个阀；以及使用连接到多个阀的流道将多个细胞传输到出口，其中多个腔室、多个电极、多个阀、出口和流道位于电穿孔装置内。
5.根据以下描述以及所附权利要求，实施例的其他方面将是显而易见的。
附图说明
6.图1示出了根据一个或多个实施例的电穿孔装置的透视图。
7.图2示出了根据一个或多个实施例的电穿孔装置的横截面。
8.图3示出了根据一个或多个实施例的腔室的俯视图。
9.图4示出了根据一个或多个实施例的流程图。
10.图5示出了根据一个或多个实施例的密封件的透视图。
11.图6示出了根据一个或多个实施例的密封盖(也称为腔室盖)的横截面。
12.图7示出了根据一个或多个实施例的单个电穿孔腔室的侧视图。
13.图8示出了根据一个或多个实施例的单个电穿孔腔室的另一侧视图。
14.图9示出了根据一个或多个实施例的电穿孔装置中的多个电穿孔腔室。
15.图10示出了根据一个或多个实施例的示例插接站(docking station)。
16.图11示出了根据一个或多个实施例的密封件的横截面视图。
17.图12示出了根据一个或多个实施例的阀(即，腔室阀)的示图。
18.图13示出了根据一个或多个实施例的腔室阀的杠杆部分的正视图。
19.图14示出了根据一个或多个实施例的电穿孔设备的仰视图。
20.图15示出了根据一个或多个实施例的示例入口泵和示例出口泵的横截面视图。
21.图16示出了根据一个或多个实施例的电穿孔装置的分解图。
22.图17示出了根据一个或多个实施例的电穿孔装置的组装图。
23.图18示出了根据一个或多个实施例的单个电穿孔过程的示例。
24.图19示出了根据一个或多个实施例的操作电穿孔插接站的流程图。
具体实施方式
25.在实施例的以下详细描述中，阐述了许多特定细节以提供对本公开技术的更透彻的理解。然而，对本领域的普通技术人员将显而易见的是，可以在没有这些特定细节或在形式和/或功能上使用等效替代物的情况下实践本公开技术。
26.在整个申请中，序数(例如，第一、第二、第三等)可以用作元素(即，申请中的任何名词)的形容词。序数的使用不旨在暗示或创建元素的任何特定排序，也不旨在将任何元素限制为仅仅是单个元素，除非明确公开，诸如，通过使用术语“之前”、“之后”、“单个”和其他此类术语。相反，序数的使用是为了区分元素。作为示例，第一元素与第二元素不同，并且第一元素可以在元素的排序中继承第二元素(或在第二元素之前)。
27.一个或多个实施例涉及电穿孔装置和使用/操作电穿孔装置的方法。电穿孔装置能够执行大规模电穿孔过程。
28.图1示出了根据一个或多个实施例的电穿孔装置(100)。电穿孔装置(100)可以称为盒(或暗盒)。电穿孔装置可以是无菌的。电穿孔装置(100)可以包括壳体，壳体由塑料(例如聚碳酸酯)、玻璃或适合生物和/或医疗用途的其他材料制成。如图1中所示，电穿孔装置(100)具有多个部件，包括多个开口(105)、入口(110)、出口(115)、多个电极(120)和多个泵连接器(125)。如图2进一步讨论和描绘的，电穿孔装置(100)可以附加地包括泵(例如，隔膜泵；每个泵具有2个止回阀(例如，仅允许液体单程(单向)流动的入口止回阀和出口止回阀))以影响整个电穿孔装置(100)中的流体移动。下面讨论每个部件。
29.在一个或多个实施例中，多个开口(105)通向腔室(下文进一步讨论)。细胞(连同任何伴随的悬浮材料)可经由多个开口(105)沉积到腔室中的一个或多个腔室中。在电穿孔过程期间要引入细胞中的化学品、药物和/或大分子(诸如蛋白质和核酸(诸如各种形式的dna和rna))也可以经由多个开口(105)沉积到腔室中。尽管图1示出了八个开口(并且因此示出了八个腔室)，但在其他实施例中，可存在不同数量的开口(并且因此存在不同数量的腔室)。例如，在一些实施例中，盒可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25
…
等等个腔室，根据可能的需要连续增加腔室的数量，以增加细胞电穿孔能力(或批量电穿孔能力)。在一个或多个实施例中，多个腔室可以共享同一开口。
30.在一个或多个实施例中，多个电极(120)中的每个电极与腔室中的一个腔室相关联。此外，多个电极(120)中的每个电极具有内部部分和外部部分。内部部分在腔室内部，并与存储在腔室中的内容物(例如，细胞)接触。外部部分在腔室外部，并且暴露在电穿孔装置
(100)的表面上和/或从电穿孔装置(100)的表面突出。内部部分和/或外部部分可以包括椭圆(例如，圆形)面。其他形状(例如，矩形)也是可行的。电极(120)中的每个电极可以包括由一种金属或合金组成的基部和由相同或不同的金属或合金组成的涂层。例如，多个电极(120)中的每个电极可以包括由铝组成的基部和金涂层。也可以使用其他金属(例如，铜、银等)代替铝和/或金，或作为铝和/或金的补充。金属和/或合金可以基于化学惰性来选择，因此不太可能与腔室的内容物(例如，细胞)发生化学反应或渗入腔室。
31.在一个或多个实施例中，电极位于电穿孔装置(100)的相对表面上。换言之，可以在相对表面上复制多个电极(120)。因此，每个腔室可以与该腔室的相对侧壁上的电极对(每个表面上有一个电极)相关联。可以通过跨电极对施加电压，从而在与电极对相关联的腔室内产生电场，来执行电穿孔过程。
32.在一个或多个实施例中，入口(110)和出口(115)位于电穿孔装置(100)的相对端。入口(110)和出口(115)可以位于电穿孔装置(100)的相同或不同表面(诸如顶面或底面)上。入口(110)在细胞收集过程期间充当液体介质的输入。例如，在入口(110)处获得的液体介质可用于在电穿孔过程后冲洗腔室。在一个或多个实施例中，入口(110)被配置用于经由凸面(male)鲁尔锁(luer lock)配件(未示出)连接到存储液体介质的袋(或其他容器)。出口(115)在细胞收集过程期间充当收集点。在经电穿孔的细胞(在液体介质中)和无细胞液体介质(用于冲洗腔室)已被传输通过流道后，出口(115)从腔室中获得细胞。在一个或多个实施例中，出口(115)被配置用于经由凸面鲁尔锁配件(未示出)连接到存储所收集的细胞和所收集的液体介质的袋(或其他容器)。
33.在一个或多个实施例中，流体设备(例如，泵)可连接至泵连接器(图1(125))以供在细胞收集过程期间使用，以促进电穿孔装置(100)内流体的移动，诸如在电穿孔过程后用于收集的细胞的移动。以下讨论流体设备和细胞收集过程。
34.图2示出了根据一个或多个实施例的电穿孔装置(100)的线性横截面示图。如图2中所示，电穿孔装置(100)包括多个腔室(205)、多个阀(210)、流道(215)、多个旁侧流道(例如，旁侧流道a(220a)、旁侧流道b(220b))、多个泵(例如，泵a(225a)、泵b(225b))以及具有通气孔(235)的气流通道(230)。泵a 225a和泵b 225b可分别称为入口泵和出口泵。下面讨论这些部件中的每个部件。
35.在一个或多个实施例中，腔室(205)被配置用于存储细胞连同化学品、药物和/或大分子，诸如在电穿孔过程期间要引入细胞的蛋白质和核酸。腔室(205)可以由电穿孔装置(100)的壳体形成，并因此可以由塑料(例如，聚碳酸酯)形成。在一个或多个实施例中，每个腔室(205)的下部呈泪滴状，如下文关于图7所讨论。换言之，腔室下部的壁朝向腔室的底部向内倾斜(即，腔室变得更窄)。这可以有助于排空腔室(205)(下文讨论)。腔室(205)可被设计用于在每个腔室中存储任何期望体积，包括例如，至少250微升(ul)、300ul、350ul、400ul、450ul、500ul、600ul、640ul、700ul、750ul、800ul、900ul、1毫升(ml)、2ml等。不同腔室(205)可以具有不同尺寸，并且不同腔室(205)可以存储不同体积。在一个或多个实施例中，腔室被设计用于存储300到640ul(液体悬浮液中的细胞体积)的范围以用于电穿孔。在一个或多个实施例中，腔室被设计用于存储600ul的液体悬浮液中的细胞最大体积以用于电穿孔。在一个或多个实施例中，腔室被设计用于存储640ul的液体悬浮液中的细胞最大体积以用于电穿孔。
36.如上所述，电穿孔装置可以具有八个腔室(120)。这八个腔室的组合可被配置用于存储至少2ml(例如，250ul
×
8个腔室)、至少2.4ml(例如300ul
×
8个腔室)、至少3.2ml(例如400ul
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8个腔室)、至少4ml(例如500ul
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8个腔室)、至少4.8ml(例如600ul
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8个腔室)、至少5.6ml(例如700ul
×
8个腔室)，或至少6.4ml(例如800ul
×
8个腔室)的液体悬浮液中的细胞以用于电穿孔。
37.在一个或多个实施例中，阀(210)将腔室(205)连接到流道(215)。(参见例如，图2)每个腔室可以有一个阀。替代地，多个腔室可以共享单个阀。阀(210)中的每个阀可以对应于伞式阀、夹持式阀、活塞式阀、闸门式阀、弹簧式阀、杠杆式阀等。阀(210)可以是上述类型的“现成”(即，可商用)阀。优选地，阀的选择可以减少泄漏的可能性，减少堵塞的可能性，并增加在细胞收集过程期间收集的细胞数量(如下所述)。阀(210)的默认位置为关闭。可以同时打开多个阀(210)。替代地，阀(210)可以按顺序打开，诸如一次打开一个。
38.在某些实施例中，每个腔室阀都是夹持阀，并且在高达至少35磅每平方英寸(psi)都无泄漏，以及泄漏到至少(-)10(负10)psi的负压。
39.图12示出了根据一个或多个实施例的阀(1200)的示图，用于阀的打开和关闭位置两者。阀(1200)可对应于上述参考图2讨论的阀(210)中的任何一个阀。阀(1200)可以包括杠杆部分(1201)和弹簧(1210)。杠杆部分(1201)可以包括弹簧连接器(1206)，其中弹簧(1210)附接至杠杆部分(1201)。杠杆部分(1201)还可以包括铰链(1203)、圆顶(1205)和力部分(1207)。
40.阀(1200)与腔室(205)中的一个腔相关联。在一个或多个实施例中，当阀(1200)关闭时，圆顶(1205)移位并压缩腔室底部处的出口与流道(215)之间的橡胶层。这有效地堵塞了腔室底部处的出口，并防止腔室的内容物排入流道(215)和/或防止流道(215)中的液体上升到腔室中。在一个或多个实施例中，橡胶层是流道(215)的柔性部分。当不受到任何外力的影响时，弹簧(1210)将阀(1200)保持在关闭位置中。
41.在一个或多个实施例中，为了打开阀(1200)，向杠杆部分(1201)的力部分(1207)施加力。例如，力可以由插接站的阀致动器施加(如下所述)。响应于力，杠杆部分(1201)围绕铰链(1203)旋转。杠杆部分(1201)的这种移动还使圆顶(1205)移动并拔出腔室底部处的出口。因此，当腔室底部处的出口被拔出时，(例如，当受到泵送力的影响时)腔室的内容物可排入流道(215)和/或流道(215)中的液体可上升到腔室中。当从力部分(1207)移除力时，弹簧(1210)使阀(1200)返回到关闭位置。换言之，弹簧(1210)使杠杆部分(1201)围绕铰链(1203)旋转，这使圆顶(1205)移位并压缩橡胶层，从而有效地堵塞出口。
42.图13示出了根据一个或多个实施例的杠杆部分(1201)的正视图。如图13中所示，杠杆部分(1201)包括铰链(1203)、圆顶(1205)和弹簧连接器(1206)。
43.图14示出了根据一个或多个实施例的电穿孔设备(100)的仰视图。在该仰视图中，腔室(205)的流道(215)和腔室出口(例如，腔室出口(1405))两者是可见的。当阀(1200)关闭时，圆顶(1205)使腔室出口(1405)被堵塞。如上所述，这防止腔室的内容物排入流道(215)和/或防止流道(215)中的液体上升到腔室中。当阀(1200)打开时，圆顶(1205)不再堵塞腔室出口(1405)，并且腔室的内容物可以排入流道(215)。类似地，如果受到泵送力或其他能够移动液体的力(例如，重力(重力流)、增加的气压等)的影响，则流道(215)中的液体可以上升到腔室中。
44.图15示出了根据一个或多个实施例的示例入口泵(225a)和示例出口泵(225b)的横截面视图。该图中的示例泵(225a、225b)与旁侧流道(220a、220b)集成为线路。如本文中所描绘的，泵(225a、225b)各具有与流体腔相邻的柔性(例如，硅)隔膜(1508)，该流体腔与“鸭嘴”止回阀(1506)并置(用于单程(单向)流体流量的调节)。泵(225a、225b)中的每一者通过(经由插接站致动器)反复压平隔膜(1508)“圆顶”来操作，以使流体移位。在某些实施例中，泵(225a、225b)中的每一者在泵致动器的300rpm(每分钟转数)下具有约15毫升/分钟的正常操作流量，并且在600rpm下具有约30毫升/分钟的“快流”操作。在某些实施例中，泵流量能够以50微升的增量进行调整。在某些实施例中，泵(225a、225b)中的每一者也能够充当阀，并且在高达至少35磅每平方英寸(psi)都无泄漏，并且在至少(-)10(负10)psi的负压下无泄漏。
45.图15还示出了插入到入口(110)和出口(115)两者中的凸面鲁尔锁配件(1504)。凸面鲁尔锁配件(1504)被鲁尔帽(1502)覆盖。
46.返回参考图2，在一个或多个实施例中，旁侧流道(220a、220b)将流道(215)连接到入口(110)和出口(115)。通道(220a、220b、215)中的每一者可以是在壳体中形成的管或以其他方式由塑料(例如，聚碳酸酯)、玻璃、金属等组成的管。在细胞收集过程期间，可以通过打开阀(210)将腔室(210)中的内容物(例如，细胞的液体悬浮液)排入流道(215)中。液体介质(在入口(110)处获得)可经由旁侧流道a(220a)行进至流道(215)，并经由侧面流道b(220b)将排出的内容物(例如，细胞的液体悬浮液)从流道(215)推到出口(115)。此外，液体介质可以通过打开的阀进入腔室(即，液体介质从流道(215)进入腔室)，并在经由旁侧流道b(220b)前进至出口(115)之前通过冲洗腔室来收集额外的细胞(即，从腔室中移除更多细胞)。因此，流道(215)和旁侧流道(例如，220b)中的至少一者被配置用于在细胞收集过程期间传输经电穿孔的细胞。
47.在一个或多个实施例中，一个或多个泵(泵a(225a)、泵b(225b))用于移动液体介质，并因此冲洗腔室(205)并将细胞推向出口(115)。如上所述，泵a 225a和泵b 225b可分别称为入口泵和出口泵。冲洗给定腔室并将排出的内容物(即，细胞的液体悬浮液)推向出口(115)所需的泵冲程的数量和体积取决于例如给定腔室与入口(110)的距离。
48.在一个或多个实施例中，气流通道(230)连接密封盖(500)下方的多个腔室(205)之间的气流。气流通道(230)经由通气孔或过滤器(235)(例如，微生物空气过滤器；诸如可商用的0.2微米过滤器)连接到电穿孔设备的外部(例如，保持大气压力)。在将细胞沉积到腔室(205)中之后，但在执行电穿孔过程之前，用例如由硅(或其他生物相容材料)制成的密封件(关于图5和图6进一步讨论)堵塞(盖住)开口(105)。这有效地创建了封闭系统。向外部的通气孔(235)或过滤器以及气流通道(230)减少或消除了部分真空形成(例如，腔室中的气压低于大气压力)的可能性，并因此有助于在细胞收集过程期间的腔室排放(排入流道(215))，同时保持腔室的无菌完整性。在一个或多个实施例中，加压空气可被强制进入通气孔(235)，并因此进入气流通道(230)，以在细胞收集过程期间加速腔室的排放(其中，此类加压空气的大小不足以提起或打开密封盖)。
49.如上所述，存在与腔室(205)相关联的电极(120)。同样如上所述，每个电极的内部部分可以具有椭圆(例如，圆形)面。图2中示出了电极(120)的椭圆面。在一个或多个实施例中，椭圆面是直径为19.5毫米或约19.5毫米的圆。其他直径和电极形状也是可行的。在一个
或多个实施例中，椭圆(或圆形)形状增加了跨电极的面的导电率。
50.图3示出了根据一个或多个实施例的单个腔室(305)的代表性俯视图。腔室(305)可对应于上述参考图2讨论的腔室(205)中的任何一个腔室。腔室(305)具有相对的边缘(330a、330b)。如图3中所示，腔室(305)与电极对(电极a(320a)、电极b(320b))相关联。两个电极(320a、320b)可对应于上文参考图1和图2讨论的电极(120)。电极对(320a、320b)定位在腔室(305)的相对侧上。在一个或多个实施例中，电极(320a，320b)的内表面形成腔室(305)的相对侧壁(340a，340b)。在一个或多个实施例中，电极(320a，320b)中的每一者的内表面与腔室(305)的现有侧壁相邻。如上所述，在电穿孔过程期间，跨电极(320a、320b)施加电压以在腔室(305)内产生电场。电极对中的每个电极可以彼此间隔足以减少或消除电极之间的电弧的距离，但距离足够近，以允许在电极之间保持电场。例如，侧壁340a处的电极320a的面可以与侧壁340b处的电极320b的面间隔约4毫米(mm)。其他间隔距离(例如，约1毫米、3毫米、5毫米、7毫米、10毫米等)也是可行的。
51.图7示出了根据一个或多个实施例的单个腔室(305)的侧视图，其中未安装电极。在图7的实施例中，腔室(305)具有倒泪滴状横截面(即，腔室在底部变得更窄(或朝底部变窄))。该泪滴形状有助于将经电穿孔的细胞从腔室(305)排入下面的流道(215)。虽然图7的实施例示出了倒泪滴状横截面，但本领域技术人员将认识到也可以使用其他腔室形状，包括圆形、矩形、三角形、菱形、管形等。
52.在一个或多个实施例中，外缘(702)包围腔室(305)的边缘。外缘(702)支撑电极对(320a、320b)中的一者；在腔室(305)的相对侧上存在类似的外缘，用于支撑电极对(320a、320b)中的另一者。图8示出了安装了电极(320a)的图7的侧视图。
53.返回图7，腔室(305)的边缘表面(330a、330b)(可包括(多个)底表面)可由电穿孔装置(100)的壳体形成。一旦将电极(320a、320b)插入外缘(702)，就可以形成腔室(305)的侧壁(图3；340a、340b)。
54.图9示出了根据一个或多个实施例的彼此相邻设置的多个腔室(305)。在一个或多个实施例中，电极(320)分开距离902，以消除相邻电极(320)之间的相互作用。
55.如上文关于图2所讨论的，在一个或多个实施例中，一旦必要的材料(例如，细胞的液体悬浮液和电穿孔材料(例如，核酸))已被添加到腔室(205)中，腔室(205)顶部处的开口(105)就可以用密封件堵塞，以创建自包含的、生物安全的装置。图5示出了可用于密封多个开口(105)的示例密封件500。图5包括多个密封盖(502a-502h)，每个密封盖(502)对应于开口(105)中的一个开口。虽然图5示出了经由桥接部分(504a-504g)连接在一起的多个密封盖(502)，但受益于本详细描述的本领域技术人员将认识到，可以将各个密封盖(502)单独应用于开口(105)中的每一者，或者可以将较小组的密封盖(502)连接在一起以密封开口(105)的子集。
56.每个密封盖(502)包括顶部(506)和底凸件(508)。图6示出了根据一个或多个实施例的密封盖(502)的横截面。密封盖(502)的顶部(506)被配置用于密封相应腔室(205)的顶部。底凸件(508)被配置用于延伸到相应腔室(205)的相应开口(105)中，以确保开口(105)和密封盖(502)之间的紧密配合。在一个或多个实施例中，尽管底凸件(508)部分延伸到相应的开口(105)中，但在底唇(508)和相应腔室(205)之间留有足够的空间，以允许腔室(205)和气流通道(230)之间的气流。类似地，当密封件(500)跨多个腔室(205)安装时，在桥
接部分(504)下方留有足够的空间，以允许空气通过气流通道(230)。由于气流通道(230)通过空气过滤器或通气孔(235)通气，密封件(500)创建生物封闭的包含式系统，该系统仍然允许维持系统内的空气压力。
57.图11示出了根据一个或多个实施例的插入相应腔室(205)的开口(105)中的密封件(500)的横截面视图。如从图11可以看出的，密封件(500)的密封盖挤入并干扰开口(105)处的锥形腔室壁以创建密封。双头箭头指示内部电极面之间的间距。通气孔(或微生物空气过滤器)由腔室盖(500)左侧的圆圈表示。
58.图16示出了电穿孔装置(100)(其(如上所述)也可以被称为盒)的分解图。在图16中，在电穿孔装置(100)的组装之前，示出了多个电极(120)、入口(110)、出口(115)、凸面鲁尔锁配件(1504)、鲁尔帽(1502)和密封件(500)。图16还示出了被配置用于分别存储入口泵(225a)和出口泵(225b)的部件的泵壳体a(1605a)和泵壳体b(1605)。
59.图17示出了电穿孔装置(100)(其(如上所述)也可以被称为盒)的组装图。图17示出了多个电极120、泵壳体a(1605a)、泵壳体b(1605b)、多个腔室阀(210)(每个阀具有弹簧(1210)和杠杆(1201))、密封件(500)、凸面鲁尔锁配件(1504)和鲁尔帽(1502)。
60.图4示出了根据本发明的一个或多个实施例的流程图。图4的流程图描绘了用于使用/操作上述电穿孔装置(100)的过程。在一个或多个实施例中，可以省略、重复和/或以与图4中所示顺序不同的顺序执行图4中所示的步骤中的一个或多个步骤。因此，本发明的范围不应被视为限于图4中所示的步骤的特定布置。
61.在步骤407中，将细胞和要引入细胞的化学品、药物和/或大分子(诸如蛋白质和核酸)装载到电穿孔装置(100)的腔室(205)中。该装载可经由例如开口(105)发生。然后可以使用密封件(诸如密封件(500)和/或密封盖(502))堵塞开口(105)。尽管电穿孔装置(100)具有多个腔室，但一些腔室可能不会被使用(即，细胞的液体悬浮液可能不会沉积到一些腔室中)。
62.在步骤409中，将电穿孔装置(100)装载到插接站中。图10示出了根据一个或多个实施例的示例插接站(1000)。插接站(1000)包括插座(1002)、阀致动器(1004)、电触点(1006)和泵致动器(1008)。插座(1002)的尺寸和形状被设计为接收电穿孔装置(100)，并将电穿孔装置(100)保持在固定和直立的位置。阀致动器(1004)被配置用于与电穿孔装置(100)上的阀(210)接合。例如，如果电穿孔装置(100)上的阀(210)是弹簧式阀，则阀致动器(1004)将包括向阀(210)施加力(例如，按压)以使阀(210)打开的部件。在一个或多个实施例中，每个阀致动器(1004)与阀(210)具有一对一的对应关系，使得每个阀(210)可以由相应的阀致动器(1004)单独控制。
63.插接站(1000)的电触点(1006)与电穿孔装置(100)的电极(120)接合。如图10中所示，电触点(1006)可以沿插座(1002)的长度线性对齐。此外，电触点(1006)定位在插座(1002)的相对侧上；出于查看目的，图10中仅描绘了一侧(1002)。电触点(1006)可以是例如高压触点。插接站(1000)的泵致动器(1008)与电穿孔装置(100)的流体部件(诸如泵(泵a(225a)、泵b(225b)))接合。阀致动器(1004)、电触点(1006)和泵致动器(1008)中的每一者可以由一个或多个可操作地链接到插接站的控制板或设备(未示出)控制。
64.返回图4，在步骤409处，由于将电穿孔装置(100)装载到插接站中，电极(120)中的每一者的外部与插接站的一个或多个电路(诸如插接站(1000)的电触点(1006))接触。因
此，在将电穿孔装置(100)装载到插接站中后，电极(120)成为一个或多个电路的元件。此外，由于将电穿孔装置(100)装载到插接站中，一个或多个泵(225a、225b)和阀(210)或阀杠杆部分(1201)可以与插接站的致动器可操作地接触。具有液体介质的袋(或其他容器)可以附接至入口(110)，并且收集袋(或其他容器)可以附接至电穿孔装置(100)的出口(115)。
65.在步骤412中，可以使用电极(120)在腔室(205)中的一者或多者内产生电场。例如，插接站可以使用由软件(例如经由链接的计算机设备)控制的电路(诸如经由电触点1006)向电极(120)施加一个或多个电压脉冲以产生电场。可在所有腔室(205)内同时产生电场。替代地，可以每次为一个腔室(205)生成电场，或者每次为腔室(205)的子集生成电场。这些施加的电场增加细胞膜的渗透性，并因此允许将化学品、药物和/或大分子(诸如蛋白质和核酸)引入细胞中。
66.在步骤414中，打开电穿孔装置(100)的阀(210)。例如，插接站(1000)的阀致动器(1004)可以打开所对接的电穿孔装置(100)的阀(210)。插接站可以同时打开所有阀(210)。替代地，插接站可以每次打开一个阀(210)，或者插接站可以每次打开阀(210)的子集。取决于阀的类型，致动器可以需要操纵活塞、杠杆、弹簧等来打开阀(210)。换言之，阀(210)可以使用弹簧运动、杠杆运动、活塞运动等进行操作。打开阀(210)中的一个阀会使连接到阀的腔室中的内容物排入流道(215)中。此类排放可能是以下一项或多项的结果：由泵或多个泵的致动产生的液压力；重力(取决于阀(210)相对于腔室(205)的取向)；腔室(205)和流道(215)之间的压力差；增加的空气压力；毛细管效应；等等。在一个或多个实施例中，在开口(105)下方并在腔室(205)之间延伸的通气气流通道(230)可以通过防止部分真空的创建来帮助排放过程。在一个实施例中，可将加压空气压入将气流通道(230)连接到电穿孔装置(100)外部的空气过滤器或通气孔(235)，以加快排放过程。
67.在步骤416中，液体介质从入口(110)被泵入电穿孔装置(100)的腔室(205)中，并且经电穿孔的细胞在出口(115)处被收集。例如，插接站(1000)的泵致动器(1008)可以操作一个或多个泵(225a、225b)，以将液体介质从附接至入口(110)的袋(或其他容器)泵入电穿孔装置(100)中。操作泵(225a、225b)使液体介质行进通过各种通道(220a、215、220b)，并向出口(115)传输流道(215)中的排出的细胞的液体悬浮液，并进入连接至出口(115)的收集袋(或其他容器)。操作泵(225a、225b)还迫使液体介质从流道(215)(经由打开的阀)进入腔室(205)，以便液体介质在通过流道(215)向出口(115)输送细胞之前，冲洗腔室(205)中仍在腔室(205)中的任何残余/剩余细胞。可以同时冲洗腔室(205)。替代地，可以一次冲洗一个腔室(205)，或者可以一起冲洗腔室(205)的子集。此外，每个腔室可在排放后立即冲洗。
68.在一个或多个实施例中，步骤412对应于电穿孔过程，而步骤414和步骤416对应于在电穿孔过程之后执行的细胞收集过程。
69.图19示出了根据一个或多个实施例的流程图。图19的流程图描绘了用于使用/操作上述参考图10所述的插接站(1000)的过程。在一个或多个实施例中，可以省略、重复和/或以与图19中所示顺序不同的顺序执行图19中所示的一个或多个步骤。因此，本发明的范围不应被视为限于图19中所示的步骤的特定布置。图19中描绘的过程与图4中描绘的过程相关(如上所述)。
70.在步骤1907中，电穿孔装置(100)(在一个实施例中，其预装载有液体悬浮液中的细胞)固定在插接站(1000)的插座(1002)中。插座(1002)包括用于插入电穿孔装置(100)并
将电穿孔装置(100)固定在直立位置的开口。在将电穿孔装置(100)固定到插座中后，使插接站(1000)的电触点(1006)与电穿孔装置(100)的电极(120)接触。如上所述，电触点(1006)定位在插座(1002)的相对侧上。
71.类似地，在固定电穿孔装置(100)后，插接站(1000)的阀致动器(1004)可以与电穿孔装置(100)的阀(210)接合，并且插接站(1000)的泵致动器(1008)可以与电穿孔装置(100)的泵(225a、225b)接合。
72.电穿孔装置(100)的一个或多个腔室(205)可以(经由液体悬浮液的沉积)填充有在电穿孔装置(100)被固定在插座(1002)中之前要引入细胞的细胞和化学品、药物和/或大分子(诸如蛋白质和核酸)。此外，在电穿孔装置(100)被固定到插座(1002)中之前，密封件(500)可以在电穿孔装置(100)的开口(105)上就位。在电穿孔装置(100)被固定到插座(1002)中之前或之后，具有液体介质的袋(或其他容器)可以(经由凸面鲁尔锁配件1504)附接至电穿孔装置(100)的入口(110)，并且收集袋(或其他容器)可以(经由凸面鲁尔锁配件1504)附接至电穿孔装置(100)的出口(115)。
73.在步骤1909处，电穿孔插接站(1000)使用电触点(1006)在电穿孔装置(100)的腔室(205)中的电极对(120)之间产生电场。电触点(1006)是插接站(1000)的(多个)电路中的元件。电场可以通过使用脉冲发生器用一个或多个信号驱动电触点(1006)来产生。可在所有腔室(205)内同时产生电场。替代地，可以每次为一个腔室(205)生成电场，或者每次为腔室(205)的子集生成电场。这些施加的电场增加细胞膜的渗透性，并因此允许将化学品、药物和/或大分子(诸如蛋白质和核酸)引入细胞中。
74.在步骤1912处，插接站(1000)的阀致动器(1004)被操作用于打开所对接的电穿孔装置(100)的阀(210)。插接站(1000)可以同时打开所有阀(210)。替代地，插接站(1000)可以每次打开一个阀(210)，或者插接站(1000)可以每次打开阀(210)的子集。根据阀的类型，致动器可以需要操纵活塞、杠杆、弹簧等来打开阀(210)。打开阀(210)中的一个阀使连接到阀的腔室中的内容物排入电穿孔装置(100)的流道(215)中。
75.在步骤1914处，操作插接站(1000)的泵致动器(1008)以激活泵(225a、225b)。这可以包括重复地压平每个泵(225a、225b)的隔膜(1508)。作为结果，液体介质从附接至入口(110)的袋(或其他容器)被泵送到电穿孔装置(100)中。具体地，操作泵致动器(1008)使泵(225a、225b)将液体介质泵送通过各种通道(220a、215、220b)，并向出口(115)传输流道(215)中的排出的细胞的液体悬浮液，并进入附接至出口(115)的收集袋(或其他容器)。操作泵(225a、225b)还迫使液体介质从流道(215)(经由打开的阀)进入腔室(205)，以便液体介质在通过流道(215)向出口(115)传输细胞之前，冲洗腔室(205)中仍在腔室(205)中的任何残余/剩余细胞。可以同时冲洗腔室(205)。替代地，可以一次冲洗一个腔室(205)，或者可以一起冲洗腔室(205)的子集。此外，每个腔室可在排放后立即冲洗。
76.在一个或多个实施例中，步骤1909对应于电穿孔过程，而步骤1912和步骤1914对应于在电穿孔过程之后执行的细胞收集过程。
77.在一个或多个实施例中，电穿孔装置(100)被消毒。在一个或多个实施例中，电穿孔装置(100)通过暴露于50千戈瑞(kgy)或更大剂量的伽马辐射进行消毒。在一个或多个实施例中，电穿孔装置(100)通过暴露于50-70千戈瑞(kgy)剂量的伽马辐射进行消毒。在一个或多个实施例中，电穿孔装置(100)在消毒过程之后具有全功能。在一个或多个实施例中，
电穿孔装置(100)在暴露于50-70千戈瑞(kgy)剂量的伽马辐射之后具有全功能。
78.在一个或多个实施例中，电穿孔装置(100)用于单次使用。在一个或多个其他实施例中，电穿孔装置(100)可以重复使用。换言之，对于单个电穿孔装置，可以多次重复图4和/或图19中所描绘的过程。
79.传统电穿孔系统需要使用多个比色皿(cuvette)来对大量细胞进行电穿孔。此外，即使生物安全柜(bsc)可用于在此类过程中提供无菌条件(即，将细胞移到多个比色皿中)，但处理多个比色皿本质上不可避免地增加了引入微生物污染的机会(即，无菌条件的损失)。附加地，此类多次处理本质上也增加了处理/加工时间，并在条件和/或过程一致性方面引入了不可避免的变化。
80.作为对此前系统的重大改进，电穿孔装置(100)和插接站(1000)可用于在单个电穿孔过程(即，在单个电穿孔“运行”)中对大量细胞进行电穿孔。
81.在一个或多个实施例中，电穿孔装置(100)和插接站(1000)可用于在单个电穿孔过程中(即，在单个“运行”中)对，例如但不限于，至少1
×
108个细胞、至少2
×
108个细胞、至少3
×
108个细胞、至少4
×
108个细胞、至少5
×
108个细胞、至少6
×
108个细胞、至少7
×
108个细胞、至少8
×
108个细胞、至少9
×
108个细胞、至少1
×
109个细胞，至少2
×
109个细胞、至少3
×
109个细胞、至少4
×
109个细胞、至少5
×
109个细胞、至少6
×
109个细胞、至少7
×
109个细胞、至少8
×
109个细胞、至少9
×
109个细胞、至少1
×
10
10
个细胞、至少2
×
10
10
个细胞、至少3
×
10
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个细胞、至少4
×
10
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个细胞、至少5
×
10
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个细胞、至少6
×
10
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个细胞、至少7
×
10
10
个细胞、至少8
×
10
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个细胞、至少9
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10
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个细胞，至少1
×
10
11
个细胞、至少2
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10
11
个细胞、至少3
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个细胞、至少4
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个细胞、至少5
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10
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个细胞、至少6
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10
11
个细胞、至少7
×
10
11
个细胞、至少8
×
10
11
个细胞、至少9
×
10
11
个细胞、至少1
×
10
12
个细胞、至少2
×
10
12
个细胞、至少3
×
10
12
个细胞、至少4
×
10
12
个细胞、至少5
×
10
12
个细胞、至少6
×
10
12
个细胞、至少7
×
10
12
个细胞、至少8
×
10
12
个细胞，以及至少9
×
10
12
个细胞进行电穿孔。
82.在一个或多个实施例中，电穿孔装置(100)和插接站(1000)可用于任何类型的真核或原核细胞(例如但不限于非贴壁细胞，诸如免疫细胞、nk细胞、t细胞等)进行电穿孔。
83.图18示出了在单个电穿孔过程(电穿孔“运行”)中使用的电穿孔装置部件的“封闭”(即无菌或消毒)配置的示例。运行可包括以下步骤中的一项或多项：在无菌条件下(例如，在生物安全/生物安全柜中)，容器(诸如输入介质袋(1805))连接到入口(诸如经由入口消毒管(1815))，并且另一容器(诸如输出细胞培养袋(1810)；用于电穿孔后的细胞收集)连接到出口(诸如经由出口消毒管(1820))。接着，将电穿孔装置或盒(100)(现在是封闭系统)放置在插接站或“巢”(1000)中，并且电穿孔过程的其余部分可由可操作地链接到“巢”的计算机(例如，笔记本电脑或平板电脑)连同电穿孔脉冲发生器(用于递送(多个)电信号)控制。在腔室的电极对之间产生一个或多个电场。通过出口(115)将经电穿孔的细胞收集(例如，经由对细胞培养基泵送通过电穿孔装置或盒(100))到收集容器(诸如输出细胞培养袋(1810))中；该收集容器可以预填充一定量的培养基。电穿孔完成后，可(例如，经由使用管式热封闭器来密封/关闭输出细胞培养袋(1810)和出口(115)之间的连接)将输出细胞培养袋(1810)从电穿孔装置/盒中无菌移除，并放置在培养箱中。
84.执行使用一个或多个公开实施例的整个电穿孔过程的时间极大程度上少于需要使用多个单独比色皿的系统所需的时间。因此，本文所述的电穿孔装置或盒(100)的示例能
够用于以闭合方式自动执行电穿孔，并从而比其他可用系统更有效且一致地递送更高产量的转染细胞(例如，转染免疫细胞/t细胞)。因此，本文所述的电穿孔装置(100)能够在封闭系统中以高度自动化的方式对大量细胞进行电穿孔(从而提供在无菌和/或cgmp制造环境中快速且有效地产生大量转染细胞的能力)。
85.电穿孔过程中使用的容器或袋(1805、1810)可以是，例如但不限于由氟化乙烯丙烯(fep)材料构成的细胞培养袋，以提供对氧气和二氧化碳的高渗透性，同时保持对水的不渗透性以用于改进培养和膨胀。
86.电穿孔装置或盒(100)的部件可包括镀金电极。由于金具有生物相容性和良好的电性能，可以选择金。电穿孔装置或盒(100)可以在受控的洁净室环境中组装。在分发和/或使用之前，可通过伽马辐照清洁和消毒电穿孔装置或盒(100)。
87.如上所述，本文所述的电穿孔盒可用于还包括计算机(例如，包括笔记本电脑或平板电脑)、电脉冲发生器、以及插接站或“巢”(1000)的系统内，以允许用于固定(例如，固持)和自动操纵电穿孔盒过程(例如，向电穿孔腔室内的细胞施加(多个)电场，通过盒(即，流道和腔室)泵送介质和细胞，打开和关闭盒阀(210))。在这种类型的系统中，计算机(或笔记本电脑/平板电脑)充当用户界面，并可操作地连接以控制电脉冲发生器。发生器经由与盒电极的接触，通过巢中的连接提供电穿孔脉冲。因此，插接站或“巢”(1000)固持盒，并提供与盒的机械和电气接触两者。
88.示例盒可包括八个腔室和盖，用于在填充有细胞悬浮材料(例如，细胞、介质、核酸、蛋白质、小分子)后覆盖和密封腔室。盒可以具有两个配件(诸如鲁尔型配件)(1502、1504)，以允许将输入介质袋(1805)和输出细胞培养袋(1810)无菌附接在生物安全柜中。输入介质袋(1805)填充有适量的回收介质，并由用户在生物安全柜中(在电穿孔之前)附接至盒上的输入配件。输出细胞培养袋(1810)可填充有一定体积的回收介质，并由用户在生物安全柜中(同样在电穿孔之前)附接至盒上的输出配件。
89.每个腔室(205)可以正常关闭，以防止样品在电穿孔之前排入歧管通道。当由插接站或“巢”(1000)致动时，这些阀(210)可以打开。在入口(110)和出口(115)以及配件(1504)的正下方是隔膜泵(225a、225b)。插接站或“巢”(1000)中的电机可以通过内置在泵堆中(即，内)的止回阀泵送流体。此类系统配置确保培养液仅单向流过腔室、歧管并流向输出细胞培养袋(1810)。隔膜泵(225a、225b)在关闭时也可以充当阀。
90.对于电穿孔，用户可以将细胞/核酸混合物无菌转移到盒的腔室(205)中，并在生物安全柜中盖住盒。盒中的阀(210)可以保持关闭，直到被巢中的致动器打开。每个腔室(205)可以被电穿孔，然后排放(通过打开阀(210))并致动隔膜泵(225a、225b)，直到样品到达输出细胞培养袋(1810)。可重复该过程，直到所有腔室(205)已被电穿孔、排放并泵送至输出细胞培养袋(1810)。在电穿孔之后，来自输入介质袋(1805)的回收细胞培养基可以被泵送通过盒，以冲洗腔室(205)和盒流道(215、220a、220b)。一旦冲洗循环完成后，可通过热密封出口消毒管(1820)将输出细胞培养袋(1810)无菌地从盒中移除，并放置在细胞培养箱中。
91.总之，本文所述的电穿孔装置(100)表示对细胞(例如，免疫细胞/t细胞)的大规模电穿孔和基因改造细胞产品的生产的重大改进。电穿孔盒在封闭系统中以最少的手动操作(即，以很大程度上自动化的方式)在短时间内对大量细胞进行电穿孔，从而显著降低微生
物污染的可能性，并增强细胞产物的一致性。
92.本文阐述的实施例和示例是为了最好地解释各种实施例及其(多个)特定应用，从而使本领域技术人员能够制作和使用这些实施例。然而，本领域技术人员将认识到，前面的描述和示例仅用于说明和示例的目的。所阐述的描述不旨在穷举或限于所公开的精确形式。
93.虽然已经描述了许多实施例，但受益于本公开的本领域技术人员将理解，可以设计出不偏离范围的其他实施例。因此，本发明的范围应当仅由所附权利要求书来限定。