一种运用数字PCR进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒与流程

一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒。


背景技术：

2.自孕妇外周血中发现游离胎儿dna以来，研究人员对其展开大量研究，发展出基于二代测序技术的无创产前检测技术，此技术比传统唐氏综合征血清学筛查更准确，比羊水穿刺更安全。由于无创产前检测技术无创、安全和准确，受到医生和孕妇的认可并被临床快速接受，是目前二代测序技术最为成功的临床应用。然而，nipt结果的准确度受母亲外周血中胎儿dna占比情况影响非常大，目前没有合适的技术检测胎儿分数。
3.因此，有必要提供一种新的技术方案以克服现有的胎儿分数检测中存在的技术障碍。


技术实现要素：

4.为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒，应用特殊的缓冲液和引物，通过超多重数字pcr路径实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，实现胎儿游离dna在母亲游离dna中的占比计算。
5.本发明提供一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法，包括以下步骤：步骤一、提取样本中的dna：从孕妇外周血中提取dna，得到样品dna；步骤二、将步骤一得到的样品dna、多重pcr反应酶和目标基因的引物混匀后，进行数字pcr反应；其中，所述目标基因的部分序列在孕妇外周血和胎儿胎盘细胞中存在超甲基化状态或低甲基化状态；所述目标基因的引物包含以下碱基序列：ggguugggaagaaacuguggcacuucggugccagcaaccc；在所述数字pcr反应中，所述目标基因的引物包含三维结构，所述目标基因的引物包含不少于十个碱基的特殊核酸序列n，所述特殊核酸序列n只由腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶组成。
6.通过上述技术方案，应用特殊的和引物，通过超多重数字pcr路径实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，实现胎儿分数的检测。
7.优选地，在如前所述的方法中，所述目标基因的部分序列在孕妇外周血和胎儿胎盘细胞的甲基化状态不同。通过该技术方案，应用特殊的引物，通过超多重数字pcr路径实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，实现胎儿游离dna在母亲游离dna中的占比计算，实现胎儿分数的检测。
8.优选地，在如前所述的方法中，所述数字pcr反应所采用的反应液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组分。通过该技术方案，应用特殊的缓冲液和引物，通过超多重数字pcr路径实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，实现胎儿游离dna在母亲游
离dna中的占比计算，实现胎儿分数的检测。
9.优选地，在如前所述的方法中，步骤二所述数字pcr使用了至少十对引物，同时进行目标基因的检测。通过该技术方案，应用特殊的缓冲液和引物，通过超多重数字pcr路径实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，实现胎儿游离dna在母亲游离dna中的占比计算，实现胎儿分数的检测。
10.本发明提供一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的试剂盒，所述检测试剂盒通过数字pcr完成无创产前胎儿染色体多倍体的检测，所述检测试剂盒使用的引物包含不少于十个碱基的特殊核酸序列n，所述特殊核酸序列n只由腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶组成。通过该技术方案，应用特殊的引物，通过超多重数字pcr路径实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，实现胎儿游离dna在母亲游离dna中的占比计算，实现胎儿分数的检测。
11.优选地，在如前所述的试剂盒中，所述检测试剂盒使用的反应液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组分。通过该技术方案，应用特殊的缓冲液和引物，通过超多重数字pcr路径实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，实现胎儿游离dna在母亲游离dna中的占比计算，实现胎儿分数的检测。
12.优选地，在如前所述的试剂盒中，所述检测试剂盒使用的引物包含三维结构。通过该技术方案，应用特殊的缓冲液和引物，通过超多重数字pcr路径实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，实现胎儿游离dna在母亲游离dna中的占比计算，实现胎儿分数的检测。
13.优选地，在如前所述的试剂盒中，所述检测试剂盒使用了至少十对引物，同时进行目标序列的检测。通过该技术方案，应用特殊的缓冲液和引物，通过超多重数字pcr路径实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，实现胎儿游离dna在母亲游离dna中的占比计算，实现胎儿分数的检测。
14.本发明创造的有益效果：本发明提供一种胎儿分数的检测方法及试剂盒，采用超多重数字pcr的技术手段，无非特异性扩增，特异性好；具有突出操作、结果分析简便，周期短的优势。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
16.图1为临床样本检测结果图，纵坐标为fam荧光通道，横坐标为hex荧光通道；fam荧光通道对应的是一个常染色体上的十重pcr检测；图2为临床样本检测结果图，纵坐标为fam荧光通道，横坐标为hex荧光通道；fam荧光通道对应的是一个常染色体上的十重pcr检测；图3、实施例1采用引物部分序列的结构示意图。
具体实施方式
17.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
18.可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
19.在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
20.在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的胎儿分数(fetal dna fraction)是指母亲血浆中胎儿游离dna/总dna的百分比。
21.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明，但本发明包括但不限于这些实施例。实施例1.一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒
22.本实施例主要描述了一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒，应用特殊的缓冲液和引物，通过超多重数字pcr路径，实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，从而实现胎儿游离dna在母亲游离dna中的占比计算。
23.一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法，包括以下步骤：1、样本处理将孕妇外周血样本于4℃条件下以1600g离心10分钟，将血浆部分再于4℃条件下以16000g离心10分钟，进一步去除残留血细胞。
24.2、dna提取按照制造商的说明书，利用qiaamp circulatingnucleic acid提取试剂盒(制造商：qiagen；目录号：55114)从血浆中提取游离dna。
25.3、试剂配制：按照表1配方制备数字pcr反应液(1个反应)：表1、数字pcr反应液组分体积10
×
dpcr buffer3.5μl酶1.0μl引物2.8μl检测模板1.0～17.5μl总体积用无核酶水补至30～35μl其中，所述数字pcr反应所采用的反应液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组分，将上述反应液混合均匀，涡旋混匀30秒，瞬时离心将反应液收集于管底后置于冰上待用。其中，10
×
dpcr buffer不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dctp)。
26.4、按照表2配方制备油相混合液(1个反应)：表2、数字pcr反应液 体积
油相a30μl油相b10μl总计40μl按表2配方将反应油相混合后，涡旋混匀30s，瞬时离心除去气泡，并将液体收集于管底，置于冰上待用。
27.5、检测进样(1)检测系统本实施例使用美国bio
‑
rad的数字pcr系统，系统为2路荧光通道，可并行处理12个样本，每个反应体系的有效液滴数为2万个。
28.6、样本基因标准品的制备按表3所示条件，将样品dna、多重pcr反应酶和目标基因引物混匀后，进行数字pcr反应得到pcr产物，得到如图1所示的实验结果。纵坐标为fam荧光通道，横坐标为hex荧光通道。fam荧光通道对应的是一个常染色体上的10重pcr检测。
29.表3、pcr反应条件其中，在实验开始前，发明人利用ion ampliseq designer在线设计网站设计出覆盖目标基因位点的10重pcr引物，设计引物的目标基因为rassf1a，如表4所示。将设计好的引物的一端添加上核苷酸序列“ggguugggaagaaacuguggcacuucggugccagcaaccc(seq id no.081)”，得到扩增用的初始核苷酸序列。将上述针对目标基因位点的引物和探针设计的扩增用的初始核苷酸序列，送到生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成后的核苷酸需进行预处理，预处理的方法为：将合成的核苷酸序列，加入到缓冲液b中加热至65℃，保温10分钟，然后冷却至35℃，保温30分钟，得到用于检测的核苷酸序列全长；其中，缓冲液b的组分为：320mm nacl，7mm mgcl2，25mm tris(ph 7.6)，1μm茶多酚。
30.表4.rassf1a基因检测引物探针序列
图1为临床样本检测结果图，纵坐标为fam荧光通道，横坐标为hex荧光通道。fam荧光通道对应的是一个常染色体上的10重pcr检测。其中，数字pcr的设计参数，按照表1和2配制pcr反应体系。将配制好的不同比例的反应体系上样到pcr系统上，形成微反应单元。将样品放入数字pcr仪中，按照表3中pcr反应条件进行pcr反应。
31.扩增结束后，通过电脑分析，对两个通道的有效荧光阳性点进行判读，并对结果进行分析，如图1所示实验结果。
32.根据下列计算公式可以算出样本中胎儿分数(ffa)：1.genome equivalent counts(ge)＝fam channel counts/10；2.fetal fraction(ff)＝counts(hex)/ge*100％；3.本实施例检测结果与现有检测手段的对比(由于没有现有成熟商业化方法，目前仅能与检测母亲外周血中y染色体检测结果(y染色体检测确定胎儿分数方法参照cn110914456a)进行对比)。
33.表5.本实施例检测结果与现有检测手段的对比
以上两组数据的p值为0.8952，证明胎儿分数结果与y染色体检测结果无区别，因此胎儿分数检测是准确反应临床信息的。实施例2.一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒
34.本实施例主要描述了一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒，应用特殊的缓冲液和引物，通过超多重数字pcr路径，实现对母亲外周血中游离dna中胎儿特异性基因位点的扩增，从而实现胎儿游离dna在母亲游离dna中的占比计算。
35.一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法，包括以下步骤：1、样本处理将孕妇外周血样本于4℃条件下以1600g离心10分钟，将血浆部分再于4℃条件下以16000g离心10分钟，进一步去除残留血细胞。
36.2、dna提取按照制造商的说明书，利用qiaamp circulatingnucleic acid提取试剂盒(制造商：qiagen；目录号：55114)从血浆中提取游离dna。
37.3、试剂配制：按照表6配方制备数字pcr反应液(1个反应)：表6、数字pcr反应液组分体积10
×
dpcr buffer3.5μl
酶1.0μl引物2.8μl检测模板1.0～17.5μl总体积用无核酶水补至30～35μl其中，所述数字pcr反应所采用的反应液不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组分，将上述反应液混合均匀，涡旋混匀30秒，瞬时离心将反应液收集于管底后置于冰上待用。其中，10
×
dpcr buffer不包含三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸(dctp)。
38.4、按照表7配方制备油相混合液(1个反应)：表7、数字pcr反应液 体积油相a30μl油相b10μl总计40μl按表7配方将反应油相混合后，涡旋混匀30s，瞬时离心除去气泡，并将液体收集于管底，置于冰上待用。
39.5、检测进样(1)检测系统本实施例使用美国bio
‑
rad的数字pcr系统，系统为2路荧光通道，可并行处理12个样本，每个反应体系的有效液滴数为2万个。
40.6、样本基因标准品的制备按表8所示条件，将样品dna、多重pcr反应酶和目标基因引物混匀后，进行数字pcr反应得到pcr产物，得到如图1所示的实验结果。纵坐标为fam荧光通道，横坐标为hex荧光通道。fam荧光通道对应的是一个常染色体上的10重pcr检测。
41.表8、pcr反应条件表8、pcr反应条件其中，在实验开始前，发明人利用ion ampliseq designer在线设计网站设计出覆盖目标基因位点的10重pcr引物，设计引物的目标基因为hlcs，如表9所示。将设计好的引物的一端添加上核苷酸序列“ggguugggaagaaacuguggcacuucggugccagcaaccc”，得到扩增用的初始核苷酸序列。将上述针对目标基因位点的引物和探针设计的扩增用的初始核苷酸序列，送到生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成后的核苷酸需进行预处理，预处理的方法为：将合成的核苷酸序列，加入到缓冲液b中加热至70℃，保温5分钟，然后冷却至30℃，保温25分钟，得到用于检测的核苷酸序列全长；其中，缓冲液b的组分为：300mm nacl，5mm mgcl2，20mm tris(ph 7.6)，5μm茶多酚。
42.表9.hlcs基因检测引物探针序列
图2为临床样本检测结果图，纵坐标为fam荧光通道，横坐标为hex荧光通道。fam荧光通道对应的是一个常染色体上的10重pcr检测。其中，数字pcr的设计参数，按照表6和7配制pcr反应体系。将配制好的不同比例的反应体系上样到pcr系统上，形成微反应单元。将样品放入数字pcr仪中，按照表3中pcr反应条件进行pcr反应。
43.扩增结束后，通过电脑分析，对两个通道的有效荧光阳性点进行判读，并对结果进行分析，如图2所示实验结果。
44.根据下列计算公式可以算出样本中胎儿分数(ffa)：1.genome equivalent counts(ge)＝fam channel counts/10.2.fetal fraction(ff)＝counts(hex)/ge*100％3.本实施例检测结果与现有检测手段的对比(由于没有现有成熟商业化方法，目前仅能与检测母亲外周血中y染色体检测结果(y染色体检测确定胎儿分数方法参照cn110914456a)进行对比)。
45.表10.本实施例检测结果与现有检测手段的对比样本序号胎儿分数y染色体％19.21％9.01％210.30％10.25％312.47％12.59％47.45％7.80％59.34％9.25％616.20％16.14％710.32％10.25％88.17％9.15％920.15％22.30％107.31％7.24％1110.19％10.91％1210.29％11.02％fgdna3.29％nafgdna2.65％nanipt
‑
pc3.52％nanipt
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nc4.24％na以上两组数据的p值为0.9142，证明胎儿分数结果与y染色体检测结果无区别，因此胎儿分数检测是准确反应临床信息的。实施例3.一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒
46.本实施例主要描述了一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒，与实施例1的不同之处在于，合成后的核苷酸需进行预处理为：将合成的核苷酸序列，加入到缓冲液b中加热至69℃，保温7分钟，然后冷却至32℃，保温27分钟，得到用于检测的核苷酸序列全长；其中，缓冲液b的组分为：310mm nacl，6mm mgcl2，23mm tris(ph 7.6)。
47.本实施例检测结果与现有检测手段(cn110914456a)的对比发现，测定胎儿分数的两组数据的p值为0.8057，证明胎儿分数结果与y染色体检测结果无区别。实施例4.一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒
48.本实施例主要描述了一种运用数字pcr进行胎儿分数检测的方法及其试剂盒，与实施例2的不同之处在于，合成后的核苷酸需进行预处理为：将合成的核苷酸序列，加入到缓冲液b中加热至67℃，保温6分钟，然后冷却至33℃，保温26分钟，得到用于检测的核苷酸序列全长；其中，缓冲液b的组分为：310mm nacl，6mm mgcl2，23mm tris(ph 7.6)，3μm茶多酚。
49.本实施例检测结果与现有检测手段(cn110914456a)的对比发现，测定胎儿分数的两组数据的p值为0.9256，证明胎儿分数结果与y染色体检测结果无区别。
50.发明人通过x单晶衍射实验，测定实施例1至4所使用的每一检测的核苷酸部分序列的结构，均得到了实验需要的不同三维结构，其中实施例1采用引物的部分序列的结构如图3所示，且准确地完成了实施例1至3所需要的胎儿分数检测。
51.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。