本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组需钠弧菌及其应用。
背景技术：
1,3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成聚对苯二甲酸丙二酯(ptt)。ptt与pet(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、pbt(聚对苯二甲酸丁二醇酯)相比具有更优良的性能，例如：更好的耐污染性、韧性和回弹性以及抗紫外性能等，此外，还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点。因此ptt被认为是pet的升级产品，具有广阔的市场前景。
目前，1,3-丙二醇的生产方法主要是利用微生物转化甘油或者葡萄糖进行生产。近年来，由于生物柴油产业的快速发展，作为生物柴油副产物的甘油的价格急剧下降，使得利用粗甘油发酵生产1,3-丙二醇的方法具有重要的工业应用价值。目前利用甘油生产1,3-丙二醇主要是利用一些天然的微生物如克雷伯氏肺炎杆菌(klebsiellapneumoniae)、丁酸梭状芽胞杆菌(clostridiumbutyricum)及弗氏柠檬酸菌(citrobacterfreundii)等在厌氧或者微氧的条件下进行。目前甘油法生产1,3-丙二醇工艺路线的主要缺点是：(1)常用的1,3-丙二醇生产菌株如克雷伯氏肺炎杆菌等为条件致病菌，其生产过程中生物安全性需要严格控制；(2)大量副产物如乙酸、乳酸，丁二酸，2,3-丁二醇的合成，使得整个后提取过程变得十分复杂；(3)粗甘油中含有高浓度的nacl，会抑制菌体的生产性能，从而降低利用粗甘油生产1,3-丙二醇的产量。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种重组需钠弧菌，该菌株能够利用甘油高效生产1,3-丙二醇。本发明的另一目的是提供该重组需钠弧菌的应用以及制备1,3-丙二醇的方法。
为实现上述目的，本发明开发能够以甘油(尤其是粗甘油)为底物，具有较高1,3-丙二醇产量和较低副产物的重组微生物。在众多的微生物中，本发明选择需钠弧菌(vibrionatriegens)作为出发菌株构建能够产生1,3-丙二醇的重组需钠弧菌，需钠弧菌是目前已知的生长最快的微生物，且能耐受高浓度盐，但是其本身并不能合成1,3-丙二醇。本发明首先将1,3-丙二醇合成模块导入需钠弧菌中，但发现仅导入合成模块的重组菌的1,3-丙二醇产量很低，在进一步对菌株进行代谢工程改进的过程中，本发明创造性地发现了能够有效促进1,3-丙二醇积累的改造靶点，并通过多个改造靶点的组合和适配性优化，显著提高了需钠弧菌利用甘油发酵生产1,3-丙二醇的性能。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种重组需钠弧菌，该重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且与野生型需钠弧菌相比，该需钠弧菌具有降低的转录调控因子的表达和/或酶活性，所述转录调控因子为arca和/或glpr。
本发明发现，单独降低需钠弧菌的转录调控因子arca、glpr的表达量或活性，均能够显著促进需钠弧菌合成1,3-丙二醇，而且，将两者组合改造，同时降低转录调控因子arca和glpr的表达量或活性，促进需钠弧菌合成1,3-丙二醇的效果更优。
以上所述的转录调控因子arca的氨基酸序列如seqidno.11所示，转录调控因子glpr的氨基酸序列如seqidno.12所示。
因此，具体地，本发明提供以下任一种重组需钠弧菌：
(1)该重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且与野生型需钠弧菌相比，该需钠弧菌具有降低的转录调控因子arca的表达和/或酶活性；
(2)该重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且与野生型需钠弧菌相比，该需钠弧菌具有降低的转录调控因子glpr的表达和/或酶活性；
(3)该重组需钠弧菌表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶，且与野生型需钠弧菌相比，该需钠弧菌具有降低的转录调控因子arca和glpr的表达和/或酶活性。
为配合arca、glpr的靶点改造，本发明进一步对1,3-丙二醇合成模块(pdo)的酶的选择进行了优化。
具体地，所述甘油脱水酶和所述甘油脱水酶激活因子来源于克雷伯氏肺炎杆菌。所述醇脱氢酶来源于大肠杆菌。
优选地，所述甘油脱水酶dhabce的氨基酸序列如seqidno.1-3所示，所述甘油脱水酶激活因子orfxy的氨基酸序列如seqidno.4-5所示，所述醇脱氢酶yqhd的氨基酸序列如seqidno.6所示。
以上所述的甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的表达可通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：
(1)导入携带甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因的表达质粒；
(2)在基因组上整合一个或多个拷贝的甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因。
对于导入携带上述酶的编码基因的质粒的方式，这些编码基因可存在于同一质粒上，或者分别存在于不同的质粒上。
对于表达质粒，本发明没有特别的限制，只要能够在需钠弧菌中克隆、进行基因表达的质粒均可使用。对于质粒的拷贝数，本发明没有特别的限制，可为高拷贝质粒、中拷贝质粒或低拷贝质粒。优选采用拷贝数为5～100的质粒，例如：pxmj19、ptrc99a等。
作为本发明的优选方案，将甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因置于一个质粒上进行表达，质粒的拷贝数为20～50。
具体地，将甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因置于ptrc99a上，从距离ptrc99a多克隆位点区启动子由近至远的方向，依次为甘油脱水酶编码基因、甘油脱水酶激活因子编码基因和醇脱氢酶编码基因。
对于在基因组上整合上述酶的编码基因的方式，整合编码基因的拷贝数至少为1个，对于整合拷贝数的具体数量，本发明没有特别的限制，优选的整合拷贝数为1～10个。
本发明所述的表达和/或酶活性的降低可通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：
(1)对所述转录因子的编码基因进行一个或多个碱基的插入、缺失或替换以使得转录因子失活、表达量或活性降低；
(2)将所述转录因子的编码基因的转录或翻译调控元件替换为活性更低的调控元件。
上述重组需钠弧菌能够利用甘油发酵生产1,3-丙二醇，具有较高的产量，但是，由于携带表达质粒，在发酵时需要添加抗生素维持质粒的稳定性。本发明进一步提供了一种重组需钠弧菌，该菌株在发酵时不需要添加抗生素维持质粒的稳定性。本发明对有利于维持表达质粒稳定性的改造靶点进行了大量筛选，最终发现将甘油-3-磷酸脱氢酶失活并将其在质粒在表达质粒上表达，能够显著提高该表达质粒的稳定性，使得在不添加抗生素进行发酵的情况下，该质粒也能够在发酵过程中稳定存在。
基于此，以上所述的重组需钠弧菌的基因组甘油-3-磷酸脱氢酶编码基因被失活，且携带含有甘油-3-磷酸脱氢酶编码基因的表达质粒。
优选地，所述表达质粒上还含有甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因。
以上所述的甘油-3-磷酸脱氢酶的氨基酸序列如seqidno.7所示。
在上述重组需钠弧菌的基础上，可进一步引入分子伴侣phap、转氢酶pntab的改造，提高重组需钠弧菌中分子伴侣phap、转氢酶pntab的表达能够进一步提高1,3-丙二醇的产量并降低发酵副产物。
具体地，所述重组需钠弧菌与野生型需钠弧菌相比，还具有提高的分子伴侣phap和/或转氢酶pntab的表达量和/或酶活性。
分子伴侣phap、转氢酶pntab的表达量的提高可通过如下(1)、(2)中的一种或多种方式实现：
(1)导入携带甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因的表达质粒；
(2)在基因组上整合一个或多个拷贝的甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和醇脱氢酶的编码基因。
分子伴侣phap、转氢酶pntab的酶活性的提高可利用目前已报道的以上蛋白的突变体，或者利用本领域常规技术手段对以上蛋白进行突变，获得活性提高的突变体。
以上所述的分子伴侣phap的氨基酸序列如seqidno.8所示，所述转氢酶pntab的氨基酸序列如seqidno.9-10所示。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供一种重组需钠弧菌，该重组需钠弧菌中，转录调控因子arca和glpr均失活，基因组甘油-3-磷酸脱氢酶编码基因glpd失活，且携带表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子、醇脱氢酶以及分子伴侣phap、转氢酶pntab和甘油-3-磷酸脱氢酶编码基因glpd的质粒。
作为本发明的另一种实施方式，本发明提供一种重组需钠弧菌，该重组需钠弧菌中，转录调控因子arca和glpr均失活，且携带表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子、醇脱氢酶以及分子伴侣phap、转氢酶pntab的质粒。
作为本发明的另一种实施方式，本发明提供一种重组需钠弧菌，该重组需钠弧菌中，转录调控因子arca和glpr均失活，基因组甘油-3-磷酸脱氢酶编码基因glpd失活，且携带表达甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子、醇脱氢酶和甘油-3-磷酸脱氢酶编码基因glpd的质粒。
本发明所述的重组需钠弧菌可采用本领域常用的分子生物学等技术手段(包括基因的克隆、表达、敲除等)构建得到。
第二方面，本发明提供所述重组需钠弧菌的应用，具体为以下任一种应用：
(1)在制备1,3-丙二醇或其衍生物中的应用；
(2)在用于生产1,3-丙二醇或其衍生物的微生物的遗传育种中的应用。
本发明所述的1,3-丙二醇的衍生物包括但不限于3-羟基丙酸等。
以上所述的应用具体为：利用所述重组需钠弧菌转化甘油制备1,3-丙二醇或其衍生物。
第三方面，本发明提供一种制备1,3-丙二醇的方法，该方法为利用所述重组需钠弧菌转化甘油生成1,3-丙二醇。
具体地，所述方法包括：在包含甘油的培养基中，对所述重组需钠弧菌进行培养，收集培养液并分离得到1,3-丙二醇。
优选地，所述培养为在28-37℃(更优选35-37℃)、ph5-8(更优选ph6-7)、溶氧10％以上的条件下培养。
发酵过程的ph可通过流加naoh控制，溶氧可通过改变转数控制。
优选地，所述培养所使用的培养基包括如下组分：甘油10-100g/l，(nh4)2so42-10g/l，kh2po40.5-5.0g/l，mgso40.5-3g/l，nacl2-8g/l，mncl20.005-0.02g/l，cacl20.005-0.02g/l，feso40.005-0.02g/l,酵母粉2-8g/l，维生素b120.005-0.02g/l。
为降低1,3-丙二醇的生产成本，所述甘油可以为未经精制处理、含高浓度nacl的粗甘油。
本发明所述的粗甘油是指生物柴油生产过程中所获得的副产的甘油，一般含甘油含量在50％-80％，同时含有脂肪酸、nacl等杂质。
本发明的有益效果在于：本发明通过改造需钠弧菌，使其能够高效利用甘油(尤其是粗甘油)发酵生产1，3-丙二醇，1，3-丙二醇的产量高，副产物少，提取分离过程简单；而且，使用需钠弧菌解决了传统1,3-丙二醇生产菌株潜在的生物安全性问题以及菌株对粗甘油中盐的耐受性较低的问题，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例使用的粗甘油中甘油的含量为80％，氯化钠的含量为3％。
以下实施例中，为构建自然感受态的需钠弧菌，便于质粒的转化，使用携带质粒pxmj19-tfox的需钠弧菌进行遗传改造。本领域技术人员可以理解，pxmj19-tfox的导入仅为了方便需钠弧菌的遗传改造，对于1,3-丙二醇的生产并无作用。若采用其他转化方法对需钠弧菌进行改造，也可使用不含有质粒pxmj19-tfox的需钠弧菌。
tfox基因编码蛋白氨基酸序列如seqidno.13所示，核苷酸序列如seqidno.14所示。
质粒pxmj19-tfox的构建方法如下：以tfox-f(5’-agcttgcatgcctgcaggtcgactagaaaggtgtgttgatgattaaaggatcaatggatatgaatgagcaaca-3’)和tfox-r(5’-gatattatcgtgaggatgcgattaacgctgctgacaactttctaacag-3’)为引物，以需钠弧菌atcc14048为模板，扩增得到0.7kb的pcr片段。以pfl-f(5’-aagttgtcagcagcgttaatcgcatcctcacgataatatccgg-3’)和pfl-r(5’-atccgccaaaacagccaagctgttaatctttctgcgaattgagatgacgcc-3’)为引物，以质粒psij8(购自addgene)为模板，扩增得到3.7kb的pcr片段。利用gibson组装的方法将以上两个基因片段插入到质粒pxmj19(购自addgene)的ecori/xbai酶切位点处，获得质粒pxmj19-tfox。将pxmj19-tfox转化至需钠弧菌atcc14048中，获得含有pxmj19-tfox的需钠弧菌atcc14048。
实施例1表达质粒的构建
1、1,3-丙二醇合成模块表达质粒的构建
将甘油脱水酶基因dhabce(氨基酸序列如seqidno.1-3所示，核苷酸序列如seqidno.15所示)、甘油脱水酶激活因子基因orfxy(氨基酸序列如seqidno.4-5所示，核苷酸序列如seqidno.16所示)和醇脱氢酶基因yqhd(氨基酸序列如seqidno.6所示，核苷酸序列如seqidno.17所示)连接至表达质粒中，构建含有甘油转化1,3-丙二醇合成模块的质粒ptrc99a-pdo，具体方法如下：
分别以dhabce-f(5’-aagcggcatgcatttacgttttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagcttcaccttttgagccgatgaacaatgaa-3’)和dhabce-r(5’-cgcaccaggataacgctagcactgtacctaggactgagctagccgtcaattaattcgcctgaccggccag-3’)，orfxy-f(5’-cagtcctaggtacagtgctagcgttatcctggtgcgggagagaatgatgaacaagagccaacaagttca-3’)和orfxy-r(5’-ctccttgctagcactgtacctaggactgagctagccgtcaatcaagcgcaagcatcaggcc-3’)为引物，以克雷伯氏肺炎杆菌(klebsiellapneumoniae)acr30为模板扩增得到2.7kb的甘油脱水酶基因的pcr片段和3.2kb的甘油脱水酶激活因子基因的pcr片段。以大肠杆菌w3110(购自中国工业微生物菌种保藏中心)为模板，以yqhd-f(5’-ctcagtcctaggtacagtgctagcaaggagatataccatgaacaactttaatctgcacacccca-3’)和yqhd-r(5’-gtacctaggactgagctagccgtcaatgcctgacgccagaagcatt-3’)为引物扩增得到1.3kb的醇脱氢酶基因pcr片段。
以vector-f(5’-gcgtctggtaaaaaaaccgcgtaatgcaggcatgcaagcttggctgttttg-3’)和vector-r(5’-ggactgagctagccgtcaaaacgtaaatgcatgccgcttcg-3’)为引物，以质粒ptrc99a(购自addgene)为模板，扩增得到2.6kb的片段。用gibson组装的方法将以上片段组装，获得携带甘油脱水酶基因、甘油脱水酶激活因子基因和醇脱氢酶基因的表达质粒ptrc99a-pdo，该质粒上，甘油脱水酶基因、甘油脱水酶激活因子基因和醇脱氢酶基因的连接顺序为：启动子-甘油脱水酶基因-甘油脱水酶激活因子基因-醇脱氢酶基因。
2、1,3-丙二醇合成模块以及phap和pntab共表达质粒的构建
将甘油脱水酶基因、甘油脱水酶激活因子基因、醇脱氢酶基因、分子伴侣基因phap和转氢酶基因pntab连接至表达质粒中，构建含有甘油转化1,3-丙二醇合成模块以及分子伴侣基因phap(氨基酸序列如seqidno.8所示，核苷酸序列如seqidno.18所示)和转氢酶基因pntab(氨基酸序列如seqidno.9-10所示，核苷酸序列如seqidno.19所示)的表达质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab，具体方法如下：
分别以dhabce-f(5’-aagcggcatgcatttacgttttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagcttcaccttttgagccgatgaacaatgaa-3’)和dhabce-r(5’-cgcaccaggataacgctagcactgtacctaggactgagctagccgtcaattaattcgcctgaccggccag-3’)，orfxy-f(5’-cagtcctaggtacagtgctagcgttatcctggtgcgggagagaatgatgaacaagagccaacaagttca-3’)和orfxy-r(5’-ctccttgctagcactgtacctaggactgagctagccgtcaatcaagcgcaagcatcaggcc-3’)为引物，以克雷伯氏肺炎杆菌(klebsiellapneumoniae)acr30为模板扩增得到2.7kb的甘油脱水酶基因的pcr片段和3.2kb的甘油脱水酶激活因子基因的pcr片段。
分别以yqhd-f(5’-ctcagtcctaggtacagtgctagcaaggagatataccatgaacaactttaatctgcacacccca-3’)和yqhd-r(5’-gtacctaggactgagctagccgtcaatgcctgacgccagaagcatt-3’)，pntab-f(5’-gcttctggcgtcaggcattgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagcaaccgatggaagggaatatcatgc-3’)和pntab-r(5’-atatctcctttgcaggtcgactcttacagagctttcaggattgcatccac-3’)为引物，以大肠杆菌w3110(购自中国工业微生物菌种保藏中心)为模板扩增得到1.3kb的醇脱氢酶基因pcr片段和3.0kb的nad(p)+转氢酶(transhydrogenase)基因pcr片段。
人工合成分子伴侣phap基因，其基因序列如seqidno.18所示。
以vector-f(5’-gcgtctggtaaaaaaaccgcgtaatgcaggcatgcaagcttggctgttttg-3’)和vector-r(5’-ggactgagctagccgtcaaaacgtaaatgcatgccgcttcg-3’)为引物，以质粒ptrc99a(购自addgene)为模板，扩增得到2.6kb的片段。用gibson组装的方法将以上片段组装，获得携带甘油脱水酶基因、甘油脱水酶激活因子基因、醇脱氢酶基因、分子伴侣基因和转氢酶基因的表达质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab，该质粒上，甘油脱水酶基因、甘油脱水酶激活因子基因、醇脱氢酶基因、分子伴侣基因和转氢酶基因的连接顺序为：启动子-甘油脱水酶基因-甘油脱水酶激活因子基因-醇脱氢酶基因-分子伴侣基因-转氢酶基因。
实施例2敲除arca基因以提高需钠弧菌生产1,3-丙二醇的产量与得率
1、敲除arca基因
在需钠弧菌atcc14048中敲除转录调控因子基因arca(氨基酸序列如seqidno.11所示，核苷酸序列如seqidno.20所示)，arca基因敲除方法如下：
分别以arca-up-f(5’-ccgaatagtctgaaccgttacgacc-3’)，arca-up-r(5’-gacagcttatcactgatcagggcggtacctaaatttgtgacaaaatt-3’)和arca-down-f(5’-aagcagctccagcctacacgtgcgctactgcacttctgtga-3’)与arca-down-r(5’-acgctttgtgacctcttgct-3’)为引物，以需钠弧菌atcc14048为模板，分别扩增得到3.0kb的pcr片段。以arca-kana-f(5’-gtcacaaatttaggtaccgccctgatcagtgataagctgtcaaacatgag-3’)和arca-kana-r(5’-cacagaagtgcagtagcgcacgtgtaggctggagctgcttc-3’)为引物，以质粒psij8(购自addgene)为模板扩增得到1.3kb的pcr片段。通过overlap的方法将以上三个片段连接，并将该片段通过自然转化的方法转入含有pxmj19-tfox的需钠弧菌atcc14048中。在包含100mg/l的卡那霉素lbv2平板上筛选得到抗性的菌株。挑取单克隆菌株在包含50mm鼠李糖的lbv2培养基中过夜培养，获得抗性消失的菌株，即为arca基因敲除的需钠弧菌atcc14048，命名为vn△arca。
2、菌株vn△arca/ptrc99a-pdo的构建和发酵验证
将实施例1构建的表达质粒ptrc99a-pdo电转入vn△arca中，在包含100mg/l氨苄青霉素的lbv2平板上获得抗性菌株，获得菌株vn△arca/ptrc99a-pdo。
同时，将质粒ptrc99a-pdo电转入需钠弧菌atcc14048中，在包含100mg/l氨苄青霉素的lbv2平板上获得抗性菌株，命名为vn/ptrc99a-pdo，获得对照菌株vn/ptrc99a-pdo。
将需钠弧菌vn△arca/ptrc99a-pdo和对照菌株vn/ptrc99a-pdo，在500ml的摇瓶中进行培养，培养基为改良m9培养基(glycerol20g/l，na2hpo4·12h2o15.11g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl15g/l,mgso4·7h2o2g/l,cacl20.015g/l,caco330g/l,vitaminb120.005g/l,ampicillin0.100g/l,fecl3·6h2o0.0024g/l,zncl20.003g/l,na2mo4·2h2o0.003g/l,mncl2·4h2o0.005g/l,cocl2·6h2o0.003g/l,cucl2·2h2o0.00015g/landh3bo30.00008g/l)，培养温度为37℃，转速200rpm，发酵周期24小时。
利用高效液相色谱检测菌株的底物代谢情况与生产1,3-丙二醇的情况。需钠弧菌vn△arca/ptrc99a-pdo的1,3-丙二醇产量与得率分别达到6.54g/l和0.40mol/mol，而对照菌株1,3-丙二醇产量与得率分别为5.82g/l和0.36mol/mol。以上结果证实，敲除需钠弧菌的转录调节因子arca可以提高1,3-丙二醇的产量和得率。
3、菌株vn△arca/ptrc99a-pdo-phap-pntab的构建和发酵验证
将实施例1构建的表达质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab电转入vn△arca中，在包含100mg/l氨苄青霉素的lbv2平板上获得抗性菌株，命名为vn△arca/ptrc99a-pdo-phap-pntab。
同时，将质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab电转入需钠弧菌atcc14048中，在包含100mg/l氨苄青霉素的lbv2平板上获得抗性菌株，命名为vn/ptrc99a-pdo-phap-pntab，获得对照菌株vn/ptrc99a-pdo-phap-pntab。
将需钠弧菌vn△arca/ptrc99a-pdo-phap-pntab和对照菌株vn/ptrc99a-pdo-phap-pntab，在500ml的摇瓶中进行培养，培养基为改良m9培养基(glycerol20g/l，na2hpo4·12h2o15.11g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl15g/l,mgso4·7h2o2g/l,cacl20.015g/l,caco330g/l,vitaminb120.005g/l,ampicillin0.100g/l,fecl3·6h2o0.0024g/l,zncl20.003g/l,na2mo4·2h2o0.003g/l,mncl2·4h2o0.005g/l,cocl2·6h2o0.003g/l,cucl2·2h2o0.00015g/landh3bo30.00008g/l)，培养温度为37℃，转速200rpm，发酵周期24小时。
利用高效液相色谱检测菌株的底物代谢情况与生产1,3-丙二醇的情况。需钠弧菌vn△arca/ptrc99a-pdo-phap-pntab的1,3-丙二醇产量与得率分别达到7.93g/l和0.48mol/mol，而对照菌株1,3-丙二醇产量与得率分别为7.34g/l和0.44mol/mol。以上结果证实，敲除需钠弧菌的转录调节因子arca可以提高1,3-丙二醇的产量和得率。
实施例3敲除glpr基因以提高需钠弧菌生产1,3-丙二醇的产量与得率
1、在需钠弧菌atcc14048和vn△arca中分别敲除转录调控因子基因glpr
glpr基因敲除方法如下：
分别以glpr-up-f(5’-cggtcatccaggataaagctacagc-3’)，glpr-up-r(5’-cgaagcagctccagcctacactttcggtattctcggaatcagtgg-3’)和glpr-down-f(5’-tttgacagcttatcactgatcagttaggactccattgtgcacggg-3’)与glpr-down-r(5’-cttactccccccctttaatagagccc-3’)为引物，以需钠弧菌atcc14048为模板，扩增得到长为3.0kb的glpr基因(氨基酸序列如seqidno.12所示，核苷酸序列如seqidno.21所示)上下游片段。以glpr-kana-f(5’-ccactgattccgagaataccgaaagtgtaggctggagctgcttc-3’)和glpr-kana-r(5’-ctacccgtgcacaatggagtcctaactgatcagtgataagctgtcaaacatgaga-3’)为引物，以质粒psij8(购自addgene)为模板扩增获得1.3kb的pcr片段。通过overlap的方法将三个片段连接，并将该片段通过自然转化的方法分别转入含有pxmj19-tfox的需钠弧菌atcc14048和vn△arca中。在包含100mg/l的卡那霉素lbv2平板上筛选得到抗性的菌株。挑取单克隆菌株在包含50mm鼠李糖的lbv2培养基中过夜培养，获得抗性消失的菌株，分别命名为vn△glpr、vn△arca△glpr。
2、菌株vn△glpr/ptrc99a-pdo和vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo的构建和发酵验证
将实施例1构建的表达质粒ptrc99a-pdo分别电转入vn△glpr和vn△arca△glpr中，在包含100mg/l氨苄青霉素的lbv2平板上获得抗性菌株，获得菌株vn△glpr/ptrc99a-pdo和vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo。
将需钠弧菌vn△glpr/ptrc99a-pdo和vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo和对照菌株vn/ptrc99a-pdo，在500ml的摇瓶中进行培养，培养基为改良m9培养基(glycerol20g/l，na2hpo4·12h2o15.11g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl15g/l,mgso4·7h2o2g/l,cacl20.015g/l,caco330g/l,vitaminb120.005g/l,ampicillin0.100g/l,fecl3·6h2o0.0024g/l,zncl20.003g/l,na2mo4·2h2o0.003g/l,mncl2·4h2o0.005g/l,cocl2·6h2o0.003g/l,cucl2·2h2o0.00015g/landh3bo30.00008g/l)，培养温度为37度，转速200rpm，发酵周期24小时。
利用高效液相色谱检测菌株的底物代谢情况与生产1,3-丙二醇的情况。需钠弧菌vn△glpr/ptrc99a-pdo和vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo的1,3-丙二醇产量分别为6.28g/l和7.21g/l，得率分别为0.39mol/mol和0.44mol/mol，而对照菌株的1,3-丙二醇产量与得率分别为5.82g/l和0.36mol/mol。以上结果证实，敲除需钠弧菌的转录调节因子glpr可以提高1,3-丙二醇的产量和得率，且若同时敲除转录调节因子glpr与arca，1,3-丙二醇的产量和得率提升效果更为显著。
3、菌株vn△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab和vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab的构建
将实施例1构建的表达质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab分别电转入vn△glpr和vn△arca△glpr中，在包含100mg/l氨苄青霉素的lbv2平板上获得抗性菌株，获得菌株vn△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab和vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab。
将需钠弧菌vn△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab、vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab和对照菌株vn/ptrc99a-pdo-phap-pntab，在500ml的摇瓶中进行培养，培养基为改良m9培养基(glycerol20g/l，na2hpo4·12h2o15.11g/l,kh2po43g/l,nh4cl1g/l,nacl15g/l,mgso4·7h2o2g/l,cacl20.015g/l,caco330g/l,vitaminb120.005g/l,ampicillin0.100g/l,fecl3·6h2o0.0024g/l,zncl20.003g/l,na2mo4·2h2o0.003g/l,mncl2·4h2o0.005g/l,cocl2·6h2o0.003g/l,cucl2·2h2o0.00015g/landh3bo30.00008g/l)，培养温度为37度，转速200rpm，发酵周期24小时，利用高效液相色谱检测菌株的底物代谢情况与生产1,3-丙二醇的情况。需钠弧菌vn△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab与vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab的1,3-丙二醇产量分别为7.45g/l和8.32g/l，得率分别为0.45mol/mol和0.50mol/mol而对照菌株1,3-丙二醇产量与得率分别为7.34g/l和0.44mol/mol。本发明证实敲除需钠弧菌的转录调节因子glpr可以提高1,3-丙二醇的产量和得率，且若同时敲除转录调节因子glpr与arca，效果更为显著。
实施例4敲除glpd基因并在质粒上互补表达glpd基因以提高质粒的稳定性和减少抗生素的使用
在1,3-丙二醇的发酵罐放大实验中发现，即使在培养基中添加抗生素，所用菌株也很快出现质粒丢失的情况。本发明通过敲除需钠弧菌中的甘油代谢的关键酶甘油-3-磷酸脱氢酶基因glpd(氨基酸序列如seqidno.7所示，核苷酸序列如seqidno.22所示)，并在质粒上互补表达glpd基因，使其在保持甘油代谢能力的同时，提高质粒稳定性，避免抗生素的使用。同时，对比了glpd基因表达强度的变化对1,3-丙二醇产量和得率的影响。
1、glpd基因敲除
glpd基因敲除方法如下：
分别以glpd-up-f(5’-attggcgatctttgctaactttgcc-3’)，glpd-up-r(5’-cgaagcagctccagcctacaccgttctcgcagcacgtgaaaac-3’)和glpd-down-f(5’-gacagcttatcactgatcagaaatttgacctctttggtgagcgaac-3’)与glpd-down-r(5’-tcgtgactttggaccaaaactgttcg-3’)为引物，以需钠弧菌atcc14048为模板，扩增得到长为3kb的glpd基因上下游片段。以glpd-kana-f(5’-ttttcacgtgctgcgagaacggtgtaggctggagctgcttcg-3’)和glpd-kana-r(5’-tcaccaaagaggtcaaatttctgatcagtgataagctgtcaaacatgag-3’)为引物，以质粒psij8(购自addgene)为模板扩增获得1.3kb的pcr片段。通过overlap的方法将三个片段连接，并将该片段通过自然转化的方法转入含有pxmj19-tfox的需钠弧菌vn△arca△glpr中。在包含100mg/l的卡那霉素lbv2平板上筛选得到抗性的菌株。挑取单克隆菌株在包含50mm鼠李糖的lbv2培养基中过夜培养，获得抗性消失的菌株，命名为vn△arca△glpr△glpd。
2、glpd的互补
(1)构建质粒ptrc99a-pdo-promoter2-glpd并转入菌株vn△arca△glpr△glpd中
glpd编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.7所示，核苷酸序列如seqidno.22所示。
质粒ptrc99a-pdo-promoter2-glpd的构建方法如下：以terminator2-f(5’-ggtaaaaaaaccgcgtaatgcaggcatgcacaaataaaacgaaaggctcagtcgaaag-3’)和terminator2-r(5’-acaaaatttgtttgcagcacaaaaggccatccgtcaggat-3’)为引物，以ptrc99a-pdo-phap-pntab为模板，扩增得到0.3kb的pcr片段。以promoter2-f(5’-atcctgacggatggccttttgtgctgcaaacaaattttgtacagacaataat-3’)和promoter2-r(5’-gcatttttttgtatactcataaaacctaacaaaaaagaaaaatcatgattggtg-3’)为引物，以需钠弧菌atcc14048为模板，扩增得到1.0kb的pcr片段。以glpd2-f(5’-tttcttttttgttaggttttatgagtatacaaaaaaatgcttccacaactg-3’)和glpd2-r(5’-aaaatcttctctcatccgccaaaacagccattagcccacttgtgagaggttcac-3’)为引物，以需钠弧菌atcc14048为模板，扩增得到1.6kb的pcr片段。利用gibson组装的方法将以上三个基因片段插入到质粒ptrc99a-pdo的hindiii酶切位点处，获得质粒ptrc99a-pdo-promoter2-glpd。
将质粒ptrc99a-pdo-promoter2-glpd电转入需钠弧菌vn△arca△glpr△glpd，在包含100mg/l氨苄青霉素的lbv2平板上筛选抗性菌株，获得菌株vn△arca△glpr△glpd/ptrc99a-pdo-promoter2-glpd。
(2)构建质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab-promoter2-glpd并转入菌株vn△arca△glpr△glpd中
质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab-promoter2-glpd的构建方法如下：以terminator2-f(5’-ggtaaaaaaaccgcgtaatgcaggcatgcacaaataaaacgaaaggctcagtcgaaag-3’)和terminator2-r(5’-acaaaatttgtttgcagcacaaaaggccatccgtcaggat-3’)为引物，以ptrc99a-pdo-phap-pntab为模板，扩增得到0.3kb的pcr片段。以promoter2-f(5’-atcctgacggatggccttttgtgctgcaaacaaattttgtacagacaataat-3’)和promoter2-r(5’-gcatttttttgtatactcataaaacctaacaaaaaagaaaaatcatgattggtg-3’)为引物，以需钠弧菌atcc14048为模板，扩增得到1.0kb的pcr片段。以glpd2-f(5’-tttcttttttgttaggttttatgagtatacaaaaaaatgcttccacaactg-3’)和glpd2-r(5’-aaaatcttctctcatccgccaaaacagccattagcccacttgtgagaggttcac-3’)为引物，以需钠弧菌atcc14048为模板，扩增得到1.6kb的pcr片段。利用gibson组装的方法将以上三个基因片段插入到质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab的hindiii酶切位点处，获得质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab-promoter2-glpd。
将质粒ptrc99a-pdo-phap-pntab-promoter2-glpd电转入需钠弧菌vn△arca△glpr△glpd，在包含100mg/l氨苄青霉素的lbv2平板上筛选抗性菌株，获得菌株vn△arca△glpr△glpd/ptrc99a-pdo-phap-pntab-promoter2-glpd。
将需钠弧菌vn△arca△glpr△glpd/ptrc99a-pdo-promoter2-glpd、vn△arca△glpr△glpd/ptrc99a-pdo-phap-pntab-promoter2-glpd以及菌株vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo和vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab，在发酵罐中培养，培养基为改良vn培养基(粗甘油50g/l，kh2po41g/l,(nh4)2so45g/l,酵母粉5g/l,nacl5g/l,mgso4·7h2o2g/l,cacl20.01g/lcocl2·6h2o0.01g/l,mncl2·4h2o0.01g/l,feso4·7h2o0.01g/l,vitaminb120.005g/l.)，实验组不添加抗生素，对照组添加100mg/l的氨苄青霉素。种子培养基为lbv2培养基，接种量10％，培养温度为37℃，使用5m氢氧化钠溶液调节ph在6.5，溶氧控制在10％。当甘油浓度低于5g/l时，脉冲式流加600g/l的甘油以维持甘油浓度在5g/l以上，利用高效液相色谱检测菌株的底物代谢情况与生产1,3-丙二醇的情况。
结果显示，发酵24h，菌株vn△arca△glpr△glpd/ptrc99a-pdo-promoter2-glpd的1,3-丙二醇产量为42.8g/l，得率为0.56mol/mol，而菌株vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo的1,3-丙二醇产量为38.8g/l，得率为0.52mol/mol，两菌株在发酵过程中均没有副产物乙酸、乳酸，丁二酸，2，3-丁二醇等的积累。
发酵24h，菌株vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab的1,3-丙二醇产量为47.1g/l，得率为0.59mol/mol，而菌株vn△arca△glpr△glpd/ptrc99a-pdo-phap-pntab-promoter2-glpd的1,3-丙二醇产量为62.4g/l,得率为0.61mol/mol。两菌株在发酵过程中均没有副产物乙酸、乳酸，丁二酸，2，3-丁二醇等的积累。菌株vn△arca△glpr/ptrc99a-pdo-phap-pntab的质粒保存率仅为55％，而菌株vn△arca△glpr△glpd/ptrc99a-pdo-phap-pntab-promoter2–glpd的质粒保存率为100％。
以上实验结果证实在质粒上互补表达甘油-3-磷酸脱氢酶可以提高需钠弧菌在以甘油为唯一碳源的培养基中的质粒保存率，且可以提高1,3-丙二醇产量和得率；同时，不依赖抗生素的1,3-丙二醇发酵体系不仅避免了抗生素的滥用，也降低了生产成本，具有重要的工业应用潜力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>清华大学
广东清大智兴生物技术有限公司
<120>一种重组需钠弧菌及其应用
<130>khp201120113.1
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