一种外周血miRNA肺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒

一种外周血mirna肺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术和分子生物学领域，具体涉及一种用于诊断肺癌的外周血mirna标志物组合、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.肺癌是肺部最常见的原发性恶性肿瘤。2018年，globocan数据库新增大约209万例肺癌感染者和176万例肺癌死亡者。全球男性肺癌发病率居所有癌症之首，女性肺癌发病率居第二位，男女死亡率均居首位。肺癌的发病因素主要包括吸烟、空气污染、电离辐射、职业性致癌物、遗传和基因改变等。在我国肺癌发病率和死亡率近年来持续上升。部分患者因临床症状不明显而未重视，就诊时常常处于肺癌中晚期。同时由于肺癌临床早期诊断不足，75％的患者在治疗时已经处于肺癌晚期，导致肺癌患者整体生存率较低。因此提高患者的生存率，必须提倡早发现、早诊断、早治疗。
3.目前临床上肺癌的早期诊断技术主要包括影像、病理学检查和外周血肿瘤标志物检测。影像学包括胸部x线检查、胸部ct和mri。其中胸部x线分辨率低，不易检出微小和隐匿病灶。低剂量ct可以发现早期肺癌，是较敏感的肺癌筛查和诊断手段，但ct假阳性高对人体有辐射。病理学检查则需微创技术借助支气管镜、胸腔镜、纵隔镜等，在检查中常引起患者的不适故不适用于早期诊断。而外周血肿瘤标志物(癌胚抗原cea、神经特异性烯醇化酶nse、细胞角蛋白19片段cyfra21
‑
1、胃泌素释放肽前体progrp)缺乏高敏感性和特异性。近些年来，非侵入性、依从性相对较高的检查手段逐渐应用于肺癌的早期筛查，研究发现肿瘤细胞中的某些癌基因可通过多种途径出现在外周血中，这些癌基因是理想的液体活检肿瘤早期标志物，在肺癌的早期筛查和诊断中有着重要作用。
4.微小核糖核酸(microrna，mirna)是一种短(包括20～24个核苷酸)的非编码的单链rna，大约可调控至少一半的人类转录组的表达，控制多种生物过程包括分化、增殖、代谢和凋亡，因此mirna与癌症的形成和演变息息相关。mirna可作为肿瘤标志物的优点是：首先mirna可以通过肿瘤细胞坏死或外泌体释放进入血液循环中，导致肿瘤人群外周血mirna表达谱和健康人相比存在显著差异。其次mirna在血浆或血清中稳定存在，它可以作为肿瘤标志物应用于癌症的筛查和诊断。大量研究已表明mirna检测更早期、更方便、更准确，因此本发明的研究旨在筛查准确特异的肺癌mirna标志物。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种外周血mirna肺癌诊断标志物组合、试剂盒及其应用，本发明提供外周血mirna肺癌诊断标志物组合、试剂盒能够简单有效且无创的对肺癌进行检测。
6.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案。
7.一种用于肺癌诊断的外周血mirna标志物组合，所述的mirna标志物组合包括以下mirna中的一种或者其中至少两种的组合：hsa
‑
mir
‑
29b
‑1‑
5p、hsa
‑
mir
‑
96
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
135b
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
296
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
376a
‑
5p、hsa
‑
mir
‑
376c
‑
5p和hsa
‑
mir
‑
499a
‑
3p。
8.优选采用其中任意两种、三种、四种、五种、六种或者七种的组合。
9.优选地，所述mirna标志物组合为hsa
‑
mir
‑
29b
‑1‑
5p、hsa
‑
mir
‑
96
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
135b
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
296
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
376a
‑
5p、hsa
‑
mir
‑
376c
‑
5p和hsa
‑
mir
‑
499a
‑
3p的组合。
10.进一步地，所述的用于肺癌诊断的外周血mirna标志物组合在肺癌诊断中的应用。
11.进一步地，所述的用于肺癌诊断的外周血mirna标志物组合在制备肺癌检测试剂或工具中的应用。
12.进一步地，所述的用于肺癌诊断的外周血mirna标志物组合在制备肺癌检测试剂盒中的应用。
13.一种用于肺癌检测试剂盒，包括所述的外周血mirna标志物组合的qpcr扩增引物和试剂，进行反转录及qpcr扩增。
14.进一步地，所述的引物序列如seq id no.1
‑
7所示，作为内参的u6的qpcr扩增引物。
15.进一步地，所述的试剂为poly
‑
a加尾法反转录试剂和qpcr法检测试剂。
16.进一步地，所述的用于肺癌检测试剂盒还包括阳性质控品、阴性质控品、poly
‑
a加尾酶、逆转录酶、dntps、逆转录缓冲液、无rna酶水、qpcr缓冲液、氯化镁、dna聚合酶、sybr green荧光染料中的至少一种。
17.本发明使用的是poly
‑
a加尾法对mirna进行反转录，故反转录引物和ppcr的反向引物均为通用引物，仅通过qpcr的正向引物识别7种mirna标志物及内参u6即可。
18.与现有技术比，本发明的有益效果如下。
19.(1)本发明提供的外周血mirna肿瘤标志物检测属于液体活检范畴，与临床上常规的血液肿瘤标志物相比，具有特异性高、更早期发现、灵敏性度高和微创的特点，是包括肿瘤在内的多种疾病诊断的新型标志物。
20.(2)本发明使用自主设计的qpcr正向引物对上述7种mirna进行半定量分析，其有益之处在于：与茎环法相比，加尾法反转录的优势是仅需通过一个反转录体系可以完成多种mirna的反转录，具有通量高、所需血液样本量少，成本低等多种优势，不足之处在于，引物特异性通常较差。本发明自主设计的qpcr正向引物，在实际应用中已经证实，具有较高特异性、灵敏度及重现性，充分弥补了加尾法反转录的缺点，在实际应用中具有很大优势。
21.(3)本发明提供的外周血mirna肺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒应用反转录
‑
qpcr法，已知u6作为组织细胞中mirna的内参已得到公认，但是u6在血清通常稳定性差，易碎片化，引物扩增产物不稳定，是造成血清u6不能稳定检出的重要原因之一。本发明自主设计的u6正向引物，在可以与市售反转录试剂盒中的通用反向引物完成u6的qpcr反应。并在实际应用中已经证实，具有特异性高、标准差小、重现性好的特点，可以作为肺癌患者与健康人群血清的mirna的内参，在实际应用中具有很大优势。
22.(4)本发明提供的外周血mirna肺癌诊断标志物组合及检测试剂盒应用反转录
‑
qpcr法，在大量肺癌和健康人群的血清中验证和评价了多个mirna，上述mirna组合在肺癌和健康人群的血清中均具有显著差异，一种理想可靠性的肺癌标志物。
23.(5)本发明提供的外周血mirna肺癌诊断标志物组合及检测试剂盒，通过建立的训
练集对测试集的检测结果显示，其诊断效能高达91.6％。对未来临床对的肺癌诊断具有重要意义。
附图说明
24.图1是本发明实施例实施的流程图。
25.图2是本发明提供的7种mirna的联合诊断roc曲线。
26.图3
‑
1至3
‑
2是本发明提供的7种mirna在全部120例样本中的表达情况。
具体实施方式
27.下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，如无特殊说明，均可以通过商业渠道购买获得。在实施例中，本发明使用通用反转录引物和qpcr通用反向引物，为全式金公司市售。
28.一种用于肺癌诊断的外周血mirna标志物组合，所述的mirna标志物组合包括以下mirna中的一种或者其中至少两种的组合：hsa
‑
mir
‑
29b
‑1‑
5p、hsa
‑
mir
‑
96
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
135b
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
296
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
376a
‑
5p、hsa
‑
mir
‑
376c
‑
5p和hsa
‑
mir
‑
499a
‑
3p。
29.本发明所涉及的hsa
‑
mir
‑
29b
‑1‑
5p、hsa
‑
mir
‑
96
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
135b
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
296
‑
3p、hsa
‑
mir
‑
376a
‑
5p、hsa
‑
mir
‑
376c
‑
5p和hsa
‑
mir
‑
499a
‑
3p中的每种mirna的序列见表1。7种mirna标志物的qpcr正向引物序列见表2。
30.表1.本发明提供的7种mirna序列的公共数据库信息。
31.表2.7种mirna标志物的qpcr正向引物序列。
32.本发明实施例实施的流程图如图1所示，具体操作步骤如下。
33.步骤1、候选标志物筛选方案：通过对ncbi
‑
geo数据库和tcga数据库的大数据分析，建立肺癌血清mirna候选标志物。其中的ncbi
‑
geo数据库选取的均为血清样本来源的数据，数据含量为205例肺癌患者及健康志愿者的血清样本分析结果；tcga数据库为组织样本来源的数据，数据含量为477例肺癌组织及51例癌旁组织的mirna差异表达分析。找到肺癌人群血清中及肺癌组织中同步上调的mirna表达谱，然后从中选取预后不良的mirna，得到206种mirna候选标志物。再采用共线性分析，剔除掉共线的mirna，保留非共线的22种mirna候选标志物。采用加尾法反转录，再qpcr的方法，检测血清样本中这7个mirna的表达情况。
34.步骤2、以标准操作程序(sop)采集符合标准的血液样本，收集完整的人口学资料和临床数据，建立标准化样本库和数据库。
35.步骤3、对收集的样本进行检测，通过反转录
‑
qpcr的方法验证肺癌血清mirna候选标志物。检测指标为δct值＝ct
mirna
‑
ct
u6
。
36.步骤4、利用roc曲线判定这些mirna对肺癌的诊断效能，最终建立mirna联合诊断标志物组合，并建立发病风险判定公式。
37.步骤5、统计学分析所使用的统计方法包括但不限于χ2检验、t检验、共线性分析、logistics回归及fisher判定。
38.实施例。
39.1.样本收集标准。
40.于2018年至2019年从中国医科大学附属盛京医院收集了大量的肺癌患者和正常
体检人群的血清样本，通过对资料的整理，从中选择了120例样本，其中肺癌60例，健康人群60例，进行检测。所选择的肺癌患者外周样本均为首诊，无手术以及用药史，且住院后经病理确认为肺癌的病人。健康人群为体检中心体检合格的健康人群。系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料。
41.2.血清样本制备。
42.使用5ml带惰性分离胶的采血管采集静脉全血，完成后迅速转移至离心机，离心条件为3000g
‑
4℃
‑
10分钟，吸取上清1ml，转移至无rna酶ep管，放入
‑
80℃冰箱保存至使用前。
43.3.rna提取前样本预处理。
44.从
‑
80℃冰箱取出血清，室温静置至全部融化，至离心机中，离心条件为10000g
‑
6℃
‑
15分钟，取上清200ul，置于新ep管中。
45.4.全自动无细胞血清mirna提取。
46.将样本置于全自动核酸提取仪中，仪器为凯杰(qiagen)公司市售，型号qiacube。该仪器使用qiagen离心柱试剂盒(mirneasy serum/plasma kit)，实现对无细胞血清mirna的全自动提取。所得rna体积为15ul，浓度大于100ng/ul。
47.5.反转录。
48.使用加尾法反转录试剂盒，对mirna进行反转录。反转录总体系为20ul，加入的rna量为200ng/20ul。反转录体系见表3。
49.表3.反转录体系。
50.反转录的反应条件为37℃下60分钟，然后85℃下5秒酶灭活。具体操作参照mirna first
‑
strand cdna synthesis supermix说明书。
51.6.实时荧光定量pcr(qpcr)。
52.扩增反应使用的试剂盒是全式金公司市售transstart tip green qpcr supermix试剂盒，反应体系构成见表4。
53.表4.扩增反应体系构成。
54.扩增反应使用的仪器是赛默飞公司quantstudio 5实时荧光定量pcr仪上进行，反应程序设置见表5，其它设置均为系统默认值。
55.表5.扩增反应程序。
56.使用仪器自带软件quantstudiotm design&analysis software进行结果采集，内参为u6，检测指标为ct值。
57.7.训练集的建立。
58.将全部样本随机分为数量相等的2组，训练集和测试集的人数分别为60例，各含肺癌30例和健康人群30例。
59.(1)总体上采用δδct法来比较各个mirna在肺癌人群和健康人群的表达差异，即δδct＝δct
肺癌
‑
δct
健康
。
60.(2)具体的(2)具体的
61.(3)每种mirna在肺癌人群与健康人群的表达差异＝2
‑
δδct
。
62.利用spss 22.0软件进行统计分析，采用fisher判别法对训练集数据进行分析，得到fisher线性判别公式：y＝
‑
0.593+1.142*δct mir29
‑
1.630*δct mir96+0.427*δct mir135b
‑
8.062*δct mir296+0.872*δct mir376a
‑
0.490*δct mir376c+0.254*δct mir499a。
63.8.测试集的检测结果。
64.测试集数量为60例，其中肺癌30例，健康人群30例。采用与训练集相同的检测操作
得到测试集每个样本中上述7种mirna的δct值。利用上述fisher线性判别公式对测试集每个数据进行判定，所得检测结果数据见表6。
65.表6.测试集的检测结果。
66.根据测试集的检测结果可知，使用本发明所述的一种血清mirna肺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒，对肺癌的真阳性率(敏感性)90.0为％，即漏诊率为10％；真阴性率(特异性)为90.0％，即误诊率为10％；测试集全部60例样本总正确率为90.0％。
67.绘制roc曲线，利用曲线下面积auc评价上述7种mirna标志物对肺癌的诊断效能，如图2所示。
68.auc最大值诊断效能为1.00，本专利所述7种mirna标志物的独立诊断效能在0.638
‑
0.789之间，联合诊断效能高达0.914，见表7。
69.表7.诊断效能。
70.将训练集和测试集全部120例样本的检测结果汇总，可以看出，本专利所述7种mirna在肺癌人群和健康人群均具有显著表达差异，每种mirna在两个人群中血清中的表达量如图3
‑
1至3
‑
2所示，具体数据见表8。
71.表8.本发明提供的7种mirna标志物中每种mirna在两个人群中血清中的表达量。
72.本发明建立了一套完整的操作流程，从收到血清样本开始，通过所述的一种血清mirna肺癌诊断标志物组合及其检测试剂盒，可以较好的区分肺癌病与健康人，为肺癌患者提供特异性且快速、无创伤的检测手段。