血液中dc细胞及cik种子细胞的冻存方法及制备的细胞与用图
【专利摘要】本发明公开了一种血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法及制备的细胞与用途，将外周血或者脐带血中的单个核细胞通过适当的处理后，冻存在自体血清中，配合细胞冻存保护剂使细胞的存活率达到80％。复苏后的细胞能够满足同时制备DC?细胞和CIK细胞，并最终制备成能够满足临床应用需求的DC?CIK细胞制剂。这样就能够实现单次采血进行多次DC?CIK临床治疗的需求，从而为免疫细胞治疗的规模化发展提了支持。
【专利说明】
血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法及制备的细胞与用途
技术领域
[0001]本发明涉及生物领域，尤其是一种血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法及制备的细胞与用途。
【背景技术】
[0002]免疫细胞治疗作为目前公认的对抗肿瘤的第四种医疗手段，因其安全，有效、无副作用等优势而逐渐被主流医学界所接受。目前的免疫细胞制备方法主要是采集患者的外周血，分离外周血单个核细胞并进行体外培养扩增。这种方法存在的最大问题是每次治疗均需要采集外周血，这就为患者带来重复的损伤，并且在某些情况下患者是不适宜采集外周血的。所以，这就需要一种能够单次采集后长期保存细胞，并能够满足多次使用的细胞存储的方法。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用自体血清的血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法及制备的细胞与用途。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法，将外周血或者脐带血中的单个核细胞通过处理后，配合细胞冻存保护液冻存在自体血清中。
[0005]包括以下步骤:
[0006]I)自体血清的制备:
[0007]a.采集80_120ml外周血或者脐带血，按照体积比1:1的比例加入生理盐水，混合均匀后通过Ficol I淋巴细胞分离液处理分离出血浆和单个核细胞；
[0008]b.将血浆在55-58°C条件下灭活30min，灭活后的血浆在4500g-6000g的条件下离心8-12min，以0.22um滤膜过滤上清并最终制备出自体血清；
[0009]2)单个核细胞的冻存:
[0010]a.分离出的单个核细胞以含体积分数I %FBS的生理盐水清洗一次后，以免疫细胞培养基重悬细胞并计数；
[0011]b.配制DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含体积分数5-8%的FBS，终浓度50-100IU/ml 的 IL-4、终浓度 500-1500IU/ml 的 GM-CSF ；
[0012]c.按照细胞计数结果取(1-2) X 17个细胞接种于T-175细胞培养瓶中，并加入40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后孵育；
[0013]d.诱导培养0.5-2h后轻轻吸取培养上清及未贴壁的细胞至50ml离心管中，300-320g条件下离心8-10min，将离心上清重新加入到DC细胞培养瓶中，诱导培养；
[0014]e.细胞冻存液的配制:将制备的自体血清与DEX-40细胞冻存液按照体积比4:1的比例混合均匀后放置在4 V冰箱中备用；
[0015]f.离心的沉淀细胞加入到未使用的单个核细胞中，混合均匀后计数，然后300-320g条件下离心8-10min，离心后弃掉上清，按照细胞计数的结果以细胞冻存液重悬细胞，使细胞的终浓度达到I X 107/ml，按照3-4ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80°C中，12-72h后将细胞转移到液氮中长期保存；
[0016]g.DC细胞诱导培养的第3-5天，将培养上清以及悬浮细胞转移到50ml离心管中，以PBS清洗细胞并将清洗液转移到另一个50ml离心管中，以Tryple消化液消化细胞3-7min，以PBS冲洗并将消化的细胞转移到离心管中，将两个离心管300-320g条件下离心8-10min，弃上清并以细胞冻存液重悬细胞，调整细胞浓度至2 X 1Vml，按照2-3ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80°C中，12-72h后将细胞转移到液氮中长期保存。
[0017]所述的血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法得到的DC细胞和CIK种子细胞。
[0018]所述的血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法得到的DC细胞和CIK种子细胞复苏后制备DC-CIK制剂的用途。
[0019]本发明的有益效果是:本发明从外周血或者脐带血中分离出自体血清以及单个核细胞，通过将单个核细胞进行分别处理后重悬于自体血清及细胞冻存保护液配制的冻存试剂中，并将细胞在-196°C液氮中进行长期保存的方法。以这种方法冻存的细胞，复苏后的细胞回收率能够达到80% ο并且能够满足多次制备达到临床治疗标准的DC-CIK制剂的需求。并且，在单个核细胞的存储过程中自体血浆是副产物，一般会废弃，本发明通过简单的方法制备自体血清并用于单个核细胞的冻存，既避免了 FBS的使用，又能够更好的提高单个核细胞的回收效率。
【附图说明】
[0020]图1是诱导7天的DC细胞及CIK细胞(左图是DC细胞，右图是CIK细胞)。
[0021]图2是CIK细胞生长曲线。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明:
[0023]自体血清的制备:
[0024]采集80_120ml外周血或者脐带血，按照体积比1:1的比例加入生理盐水，混合均匀后通过Ficol I淋巴细胞分离液处理分离出血浆和单个核细胞；
[0025]将血浆在55-58°C条件下灭活30min，灭活后的血浆在4500g-6000g的条件下离心8-12min，以0.22um滤膜过滤上清并最终制备出自体血清；
[0026]单个核细胞的冻存:
[0027]1.分离出的单个核细胞以含I %FBS的生理盐水清洗一次后，以免疫细胞培养基重悬细胞并计数；
[0028]2.配制DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含体积分数5-8%的FBS，终浓度50-100IU/ml 的 IL-4、终浓度 500-1500IU/ml 的 GM-CSF ；
[0029]3.按照细胞计数结果取1-2*107个细胞接种于T-175细胞培养瓶中，并加入40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后孵育；
[0030]4.诱导培养0.5-2h后轻轻吸取培养上清及未贴壁的细胞至50ml离心管中，300-320g条件下离心8-10min，将离心上清重新加入到DC细胞培养瓶中，诱导培养；
[0031 ] 5.细胞冻存液的配制:将制备的自体血清与DEX-40细胞冻存液按照体积比4:1的比例混合均匀后放置在4 V冰箱中备用；
[0032]6.离心的沉淀细胞加入到未使用的单个核细胞中，混合均匀后计数，然后300-320g条件下离心8-10min，离心后弃掉上清，按照细胞计数的结果以细胞冻存液重悬细胞，使细胞的终浓度达到l*107/ml，按照3-4ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80°C中，12-72h后将细胞转移到液氮中长期保存；
[0033]7.DC细胞诱导培养的第3-5天，将培养上清以及悬浮细胞转移到50ml离心管中，以PBS清洗细胞并将清洗液转移到另一个50ml离心管中，以Tryple消化液消化细胞3-7min，以PBS冲洗并将消化的细胞转移到离心管中，将两个离心管300-320g条件下离心8-10min，弃上清并以细胞冻存液重悬细胞，调整细胞浓度至2*106/ml，按照2-3ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80°C中，12-72h后将细胞转移到液氮中长期保存；
[0034]DC-CIK细胞的复苏、培养:
[0035]1.CIK细胞诱导培养基的配制:免疫细胞培养基中含有体积分数4-8%的FBS，终浓度200-1000IU的IL-2;
[0036]2.在一个T-175细胞培养瓶中加入5ml含有5-10ng CD3Mab的CIK细胞诱导培养基，
4°C冰箱包被过夜；
[0037]3.复苏一支冻存的单个核细胞，将融化后的细胞悬液加入到15_20ml的免疫细胞培养基中，300-320g条件下离心8-10min，弃上清并加入CIK细胞诱导培养基至终体积45ml，重悬细胞后加入预先包被的T-175细胞培养瓶中，并按照300-1000IU/ml的终浓度加入IFN-r，混合均勾后开始诱导培养；
[0038]4.按照每隔一天加入培养体系中等体积的CIK细胞诱导培养基的方法对CIK细胞进行扩增培养；
[0039]5.在CIK细胞诱导的第4天复苏一支冻存的DC细胞，将融化后的细胞悬液加入到15-20ml的免疫细胞培养基中，300-320g条件下离心8-10min，弃上清并加入DC细胞诱导培养基至终体积40ml，重悬细胞后加入T-175细胞培养瓶中诱导培养，24-36h后在DC细胞诱导体系中按照终浓度400-1200IU/ml加入TNF-a，24-48h后将诱导的DC细胞收集后加入到CIK细胞诱导体系中共培养；
[0040]6.在CIK细胞诱导的第14-16天收集所有细胞。
[0041 ] 实施例1:
[0042]自体血清的制备:
[0043]1.采集120ml外周血，按照体积比1:1的比例加入生理盐水，混合均匀后通过Ficol I淋巴细胞分离液处理分离出血浆和单个核细胞；
[0044]2.将血浆在56°C条件下灭活30min，灭活后的血浆在4500gg的条件下离心12min，以0.22um滤膜过滤上清并最终制备出223ml自体血清；
[0045]单个核细胞的冻存:
[0046]1.分离出的单个核细胞以30ml含1%FBS的生理盐水清洗一次后，以20ml免疫细胞培养基重悬细胞，计数获得1.98*108个细胞；
[0047]2.配制DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含体积分数5 %的FBS，终浓度100IU/ml 的 IL-4、终浓度 1000IU/ml 的 GM-CSF;
[0048]3.按照细胞计数结果取2*107个细胞接种于T-175细胞培养瓶中，并加入40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后孵育；
[0049]4.诱导培养2h后轻轻吸取培养上清及未贴壁的细胞至50ml离心管中，300-320g条件下离心8-10min，将离心上清重新加入到DC细胞培养瓶中，诱导培养；
[0050]5.细胞冻存液的配制:将制备的自体血清与DEX-40细胞冻存液按照体积比4:1的比例混合均匀后放置在4 V冰箱中备用；
[0051 ] 6.离心的沉淀细胞加入到未使用的单个核细胞中，混合均匀后计数，然后300g条件下离心1min，离心后弃掉上清，按照细胞计数的结果以细胞冻存液重悬细胞，使细胞的终浓度达到l*107/ml，按照4ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80°C冰箱中，72h后将细胞转移到液氮中长期保存；
[0052]7.DC细胞诱导培养的第3天，将培养上清以及悬浮细胞转移到50ml离心管中，以PBS清洗细胞并将清洗液转移到另一个50ml离心管中，以3ml Tryple消化液消化细胞5min，以PBS冲洗并将消化的细胞转移到离心管中，将两个离心管300g条件下离心lOmin，弃上清并以细胞冻存液重悬细胞，调整细胞浓度至2*106/ml，按照3ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80°C中，72h后将细胞转移到液氮中长期保存；
[0053]DC-CIK细胞的复苏、培养:
[0054]1.CIK细胞诱导培养基的配制:免疫细胞培养基中含有体积分数5%的FBS，终浓度500IU的IL-2;
[0055]2.在一个T-175细胞培养瓶中加入5ml含有5ng CD3Mab的CIK细胞诱导培养基，4°C冰箱包被过夜；
[0056]3.复苏一支冻存的单个核细胞，将融化后的细胞悬液加入到20ml的免疫细胞培养基中，300g条件下离心8min，弃上清并加入CIK细胞诱导培养基至终体积45ml，重悬细胞后加入预先包被的T-175细胞培养瓶中，并按照1000IU/ml的终浓度加入IFN-r，混合均匀后开始诱导培养；
[0057]4.按照每隔一天加入培养体系中等体积的CIK细胞诱导培养基的方法对CIK细胞进行扩增培养；
[0058]5.在CIK细胞诱导的第4天复苏一支冻存的DC细胞，将融化后的细胞悬液加入到20ml的免疫细胞培养基中，300g条件下离心1min，弃上清并加入DC细胞诱导培养基至终体积40ml，重悬细胞后加入T-175细胞培养瓶中诱导培养，36h后在DC细胞诱导体系中按照终浓度1000IU/ml加入TNF-a，48h后将诱导的DC细胞收集后共获得1.4*107个细胞(图1)，将全部细胞加入到CIK细胞诱导体系中共培养；
[0059]6.在CIK细胞诱导的第16天收集所有细胞，共获得2.82*19个细胞(图2)。
[0060]实施例2
[0061 ]自体血清的制备:
[0062]1.采集80ml外周血或者脐带血，按照体积比1:1的比例加入生理盐水，混合均匀后通过Ficol I淋巴细胞分离液处理分离出血浆和单个核细胞；
[0063]2.将血浆在55°C条件下灭活30min，灭活后的血浆在5000g的条件下离心8min，以
0.22um滤膜过滤上清并最终制备出自体血清；
[0064]单个核细胞的冻存:
[0065]1.分离出的单个核细胞以20ml含I %FBS的生理盐水清洗一次后，以免疫细胞培养基重悬细胞并计数获得1.5*108个细胞；
[0066]2.配制DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含体积分数6 %的FBS，终浓度50IU/ml 的 IL-4、终浓度 500IU/ml 的 GM-CSF ；
[0067]3.按照细胞计数结果取1*107个细胞接种于T-175细胞培养瓶中，并加入40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后孵育；
[0068]4.诱导培养0.5h后轻轻吸取培养上清及未贴壁的细胞至50ml离心管中，300g条件下离心Smin，将离心上清重新加入到DC细胞培养瓶中，诱导培养；
[0069]5.细胞冻存液的配制:将制备的自体血清与DEX-40细胞冻存液按照体积比4:1的比例混合均匀后放置在4 V冰箱中备用；
[0070]6.离心的沉淀细胞加入到未使用的单个核细胞中，混合均匀后计数，然后320g条件下离心Smin，离心后弃掉上清，按照细胞计数的结果以细胞冻存液重悬细胞，使细胞的终浓度达到l*107/ml，按照3ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80°C中，12h后将细胞转移到液氮中长期保存；
[0071]7.DC细胞诱导培养的第5天，将培养上清以及悬浮细胞转移到50ml离心管中，以PBS清洗细胞并将清洗液转移到另一个50ml离心管中，以3ml Tryple消化液消化细胞3min，以PBS冲洗并将消化的细胞转移到离心管中，将两个离心管300g条件下离心lOmin，弃上清并以细胞冻存液重悬细胞，调整细胞浓度至2*106/ml，按照2ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80°C中，12h后将细胞转移到液氮中长期保存；
[0072]DC-CIK细胞的复苏、培养:
[0073]1.CIK细胞诱导培养基的配制:免疫细胞培养基中含有体积分数4%的FBS，终浓度200IU的IL-2;
[0074]2.在一个T-175细胞培养瓶中加入5ml含有1ng CD3Mab的CIK细胞诱导培养基，4°(:冰箱包被过夜；
[0075]3.复苏一支冻存的单个核细胞，将融化后的细胞悬液加入到15ml的免疫细胞培养基中，320g条件下离心8min，弃上清并加入CIK细胞诱导培养基至终体积45ml，重悬细胞后加入预先包被的T-175细胞培养瓶中，并按照300IU/ml的终浓度加入IFN-r，混合均匀后开始诱导培养；
[0076]4.按照每隔一天加入培养体系中等体积的CIK细胞诱导培养基的方法对CIK细胞进行扩增培养；
[0077]5.在CIK细胞诱导的第4天复苏一支冻存的DC细胞，将融化后的细胞悬液加入到20ml的免疫细胞培养基中，320g条件下离心8min，弃上清并加入DC细胞诱导培养基至终体积40ml，重悬细胞后加入T-175细胞培养瓶中诱导培养，24h后在DC细胞诱导体系中按照终浓度500 IU/ml加入TNF-a，24h后将诱导的DC细胞收集后计数共获得1.2*107个细胞，将细胞全部加入到CIK细胞诱导体系中共培养；
[0078]6.在CIK细胞诱导的第14天收集所有细胞，共获得2.2* 19个细胞。
[0079]综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
【主权项】
1.一种血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法，其特征在于，将外周血或者脐带血中的单个核细胞通过处理后，配合细胞冻存保护液冻存在自体血清中。2.根据权利要求1所述的血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)自体血清的制备: a.采集80-120ml外周血或者脐带血，按照体积比1:1的比例加入生理盐水，混合均匀后通过Ficol I淋巴细胞分离液处理分离出血浆和单个核细胞； b.将血浆在55-58°C条件下灭活30min，灭活后的血浆在4500g-6000g的条件下离心8-12min，以0.22um滤膜过滤上清并最终制备出自体血清； 2)单个核细胞的冻存: a.分离出的单个核细胞以含体积分数I%FBS的生理盐水清洗一次后，以免疫细胞培养基重悬细胞并计数； b.配制DC细胞诱导培养基:免疫细胞培养基中含体积分数5-8%的FBS，终浓度50-100IU/ml 的 IL-4、终浓度 500-1500IU/ml 的 GM-CSF ； c.按照细胞计数结果取(1-2)X 17个细胞接种于T-175细胞培养瓶中，并加入40mlDC细胞诱导培养基，混合均匀后孵育； d.诱导培养0.5-2h后轻轻吸取培养上清及未贴壁的细胞至50ml离心管中，300-320g条件下离心8-10min，将离心上清重新加入到DC细胞培养瓶中，诱导培养； e.细胞冻存液的配制:将制备的自体血清与DEX-40细胞冻存液按照体积比4:1的比例混合均勾后放置在4 C冰箱中备用； f.离心的沉淀细胞加入到未使用的单个核细胞中，混合均匀后计数，然后300-320g条件下离心8-lOmin，离心后弃掉上清，按照细胞计数的结果以细胞冻存液重悬细胞，使细胞的终浓度达到I X 107/ml，按照3-4ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入-80°C中，12-72h后将细胞转移到液氮中长期保存； g.DC细胞诱导培养的第3-5天，将培养上清以及悬浮细胞转移到50ml离心管中，以PBS清洗细胞并将清洗液转移到另一个50ml离心管中，以Tryple消化液消化细胞3-7min，以PBS冲洗并将消化的细胞转移到离心管中，将两个离心管300-320g条件下离心8-10min，弃上清并以细胞冻存液重悬细胞，调整细胞浓度至2 X1Vml，按照2-3ml/管加入到细胞冻存管中，将细胞冻存管放入程序降温盒中，再将程序降温盒放入_80°C中，12-72h后将细胞转移到液氮中长期保存。3.如权利要求1或2所述的血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法得到的DC细胞和CIK种子细胞。4.如权利要求1或2所述的血液中DC细胞及CIK种子细胞的冻存方法得到的DC细胞和CIK种子细胞复苏后制备DC-CIK制剂的用途。
【文档编号】A01N1/02GK105831106SQ201610309131
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】韩洪起, 鲁振宇, 刘俊江, 张冰晶, 秦臻, 徐悦
【申请人】天津普瑞赛尔生物科技有限公司