CDC20在间充质干细胞成骨向分化中的应用

本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及cdc20在间充质干细胞成骨向分化过程中的应用。

背景技术：

由创伤、先天畸形、感染和肿瘤所导致的骨缺损需要进行骨组织再生重建。随着人口的老龄化，骨缺损再生修复的需求越来越大。近年来间充质干细胞联合组织工程学技术促进组织再生的应用成为前沿且重要的科学问题。人间充质干细胞是骨组织工程技术中极具吸引力的一种成体干细胞来源，在口腔颌面部各种骨缺损修复和骨再生治疗中具有重要的应用价值和良好的应用前景。人间充质干细胞具有向骨，软骨，脂肪，肌肉，肌腱等组织分化的潜力，许多临床前和临床研究显示人间充质干细胞是干细胞组织工程中产生新骨的重要种子细胞。深入研究人间充质干细胞成骨向分化的机制，阐明在此过程中发挥关键作用的生物分子，对快速高效开启人间充质干细胞成骨向分化，诱导骨再生具有重要意义。

间充质干细胞成骨向分化是一个复杂的过程，多种转录因子，信号通路及表观遗传调控因素均在这一过程中发挥重要的作用，精确控制细胞命运。近年来，越来越多的研究证据表明，泛素蛋白酶体系统对骨再生具有重要调控作用。泛素蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的主要通路，对维持细胞及整个生物体的正常供能具有重要作用。目前对于泛素蛋白酶体系统在骨稳态中作用的研究多涉及泛素连接酶，阐明泛素连接酶在骨形成过程中的作用及其分子生物学机制具有重要意义。

丝裂原调控子20(cdc20)是一个细胞周期检查点的调控因子，是泛素连接酶apc/c复合体的激活因子，在有丝分裂的g1期和m期扮演重要的角色。活跃的apc/c复合体包括至少16个单独的亚单元，包括共同激活蛋白cdc20和cdh1，它们包括c-box,kilr,ir区域，与apc/c的核心相结合。许多研究报道了cdc20在脑发育，纤毛解体和调节细胞凋亡中的生物学功能，且cdc20在许多癌症中表达升高，与肺、膀胱、结肠、乳腺癌和口腔鳞状细胞癌的不良预后相关，但cdc20对骨形成的作用尚不清楚。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了cdc20在间充质干细胞成骨向分化过程中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了cdc20在制备促进间充质干细胞的成骨向分化和/或骨组织再生功能的增强剂中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述间充质干细胞包括人骨髓来源间充质干细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，cdc20促进碱性磷酸酶活性。

在本发明的一些具体实施方案中，cdc20增强成骨相关的转录因子runx2，ocn的表达。

在本发明的一些具体实施方案中，cdc20通过促进nf-κb通路下游基因调节间充质干细胞成骨向分化。

在本发明的一些具体实施方案中，cdc20通过降解nf-κbp65调节间充质干细胞成骨向分化。

本发明发现了一个关键的成骨向分化增强剂---cdc20。cdc20过表达能够增强间充质干细胞成骨向分化能力。本发明揭示了cdc20对人间充质干细胞命运选择的调控作用，并探索泛素化修饰调控干细胞定向分化的具体分子生物学机制；一方面为研发小分子化学工具调控干细胞定向分化提供全新的作用靶点，另一方面为以干细胞为基础的骨组织工程技术的临床转化应用奠定坚实基础。cdc20基因促进剂可以用于加速间充质干细胞成骨向分化，从而克服细胞移植来源少的问题。在各种刺激如炎症，感染作用下，nf-κb通路激活，cdc20可以通过降解nf-κbp65调节间充质干细胞成骨向分化，利于炎性状态下骨愈合。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1人骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中cdc20的表达量变化图；

图2抑制或过表达cdc20对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响图；

图3敲低cdc20对nf-κb通路下游基因的调控作用图；

图4cdc20调控人骨髓间充质干细胞成骨向分化是否依赖于对nf-κbp65的靶向降解图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如无特别说明，本发明所涉及的技术均为分子生物学或细胞生物学常规技术手段，其中涉及的酶、试剂以及反应条件均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。

下述中英文缩写：

alpalkalinephosphatase碱性磷酸酶

bcabicinchoninincacid二辛可宁酸

cdc20celldivisioncycle20丝裂原调控子20

depcdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯

gapdhglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase甘油醛-3-磷酸脱氢酶

nf-κbp65nuclearfactor-κbp65核因子κbp65

ocnosteocalcin骨钙素

qrt-pcrquantitativereversetranscriptionpcr逆转录定量聚合酶链式反应

runx2runt-relatedtranscriptionfactor2runt相关转录因子2

tnf-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子α

实施例1人骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中cdc20的表达量变化

细胞培养：

人骨髓间充质干细胞购于美国sciencellresearchlaboratories(carlsbad,ca,usa)。人骨髓间充质干细胞收集于三名不同的供体，获得北京大学口腔医院伦理委员会的审核批准。增殖培养基为α-mem培养液(包括10％胎牛血清，100u/ml青霉素,100μg/ml链霉素)。成骨向分化培养基包括增殖培养基加0.2mm维生素c,10mmβ-磷酸甘油钠和100nm地塞米松。细胞被接种于培养皿中37℃、5％co2条件下培养，每3d换液1次。倒置显微镜下观察细胞生长至80％汇合状态时，使用0.25％胰蛋白酶消化传代，加入培养基中培养。

蛋白质印记实验

(1)收取六孔板中细胞：每孔加入适量ripa裂解液及蛋白酶抑制剂，细胞充分裂解后，使用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞收集至离心管中；

(2)冰上放置30min，使细胞完全裂解；

(3)4℃，12000g离心20分钟，吸取上清，使用bca法检测蛋白浓度，99℃煮5min，即得到蛋白样品；

(4)配置10％sds-page胶，每孔加入等量蛋白样品；

(5)恒压100v电泳，待电泳条带完全跑出浓缩胶时，将电压调整至120v，直至溴酚蓝完全跑出分离胶；

(6)按照海绵—滤纸—分离胶—膜—滤纸—海绵放置转膜夹，250ma电转1.5h；

(7)电转结束后，将pvdf膜取出置于5％的脱脂奶粉中，摇床封闭1h；

(8)按照蛋白大小，将runx2、cdc20和gapdh蛋白条带剪下，孵育相应的一抗，4℃，摇床封闭过夜；

(9)使用tbst洗膜3次，每次10min，孵育二抗，室温摇床孵育60min；

(10)使用tbst洗膜3次，每次10min，洗好后，进行曝光，得到的结果如图1a所示。

rna提取

(1)将人骨髓间充质干细胞接种至培养板中，加入成骨分化培养基，分别在第0d，7d和14d(每组设置3个重复)加入1mltrizol收集细胞，转移至1.5ml离心管中，室温放置5min；加200μl氯仿,混匀后将离心管置于低温高速离心机中，12000rpm离心15min，取上清400μl；

(2)将上清加入到等体积预冷异丙醇混匀，放置10min；将离心管置于低温高速离心机中，12000rpm离心10min，小心去除上清；

(3)将1ml75％乙醇加入到沉淀中，颠倒混匀后，将离心管置于低温高速离心机中，12000rpm4℃，离心5min；小心去除上清，静置至乙醇完全蒸发；

(4)加入depc水溶解沉淀，测定rna纯度和浓度。

逆转录反应

逆转录反应参照反转录试剂盒primescriptrtreagentkit(takara,tokyo,japan)。

逆转录反应体系：5×primescriptrtmastermix2μl；rna模板0.5μg；rnasefree水至10μl。

逆转录反应条件：37℃15min；85℃5s；4℃冷却。

实时荧光定量pcr

实时荧光定量pcr按照powersybrgreenpcrmastermix试剂盒进行扩增，反应条件：95℃120s；95℃30s，60℃45s35个循环。

按照2^-δδct方法处理实时定量pcr数据，计算cdc20及成骨相关基因的表达变化，实验结果如图1b-d所示。在扩增过程中引物序列如下:

实验结果

图1示发明实施例提供的人骨髓间充质干细胞在成骨培养0d,7d,14d后cdc20及成骨相关指标表达上升。图1a示westernblot结果显示，在成骨培养过程中，cdc20蛋白及runx2蛋白的表达量均上调；图1b-d示qrt-pcr结果显示，在成骨过程中，cdc20,runx2,ocn基因的表达量均上调。

实施例2

抑制或过表达cdc20对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响

质粒表达，sirna及慢病毒转染：

过表达质粒载体vector及过表达cdc20质粒wt-cdc20购买于addgene公司。在细胞生长至70％-80％汇合状态时，将质粒用转染试剂lipo3000按照说明书方法转入间充质干细胞中，24-36小时后收集细胞用于后续实验。sirna(小干扰rna)用来沉默基因的表达，对照sirna及cdc20si购于上海吉玛公司,在细胞生长至30％-50％汇合状态时，将sirna用转染试剂lipo3000按照说明书方法转入间充质干细胞中，在合适时间收集细胞用于后续实验。慢病毒可整合至基因组中进行基因干扰，敲低对照及cdc20sh购于上海吉玛公司。转染后72h，用lμg/ml的嘌呤霉素筛选3天后获得稳定转染细胞。

sirna序列如下：

cdc20-si15’-gcaaauccaguuccaagguuu-3’(seqidno:9)

3’-accuuggaacuggauuugcuu-5’(seqidno:10)

cdc20-si25’-ccuuguggauuggaguucuuu-3’(seqidno:11)

3’-agaacuccaauccacaagguu-5’(seqidno:12)

p65-si5’-gcacactgtgttgcccacuu-3’(seqidno:13)

3’-acccctggatgacggtacac-5’(seqidno:14)

negativecontrol5’-uucuccgaacgugucacguuu-3’(seqidno:15)

3’-acgugacacguucggagaauu-5’(seqidno:16)

慢病毒的dna序列如下：

cdc20-sh1(seqidno:17)gcactggacaacagtgtgtac

cdc20-sh2(seqidno:18)gcagaaacggcttcgaaatat

negativecontrol(seqidno:19)ttctccgaacgtgtcacgt

alp染色

(1)转染前24h将间充质干细胞接种于6孔板中；

(2)弃去培养基，加入无血清培养基，将质粒和sirna按照lipofectamine3000说明书进行转染，或者加入慢病毒进行转染，每组设置3个重复；

(3)过夜培养后，更换为有血清培养基，即得到相应的间充质干细胞。加入成骨分化培养基，培养7d,根据需要中间可加转染一次；

(4)弃去培养基，用pbs洗涤3次，每孔加入4％多聚甲醛，室温固定30min；

(5)弃去多聚甲醛，用pbs洗涤3次；

(6)每孔加入碱性磷酸酶染液，室温避光染色直至有差异时终止；

(7)用pbs洗涤3次，进行拍照。

alp酶活性检测

(1)转染前24h将间充质干细胞接种于6孔板中；

(2)弃去培养基，加入无血清培养基，将质粒和sirna按照lipofectamine3000说明书进行转染，或者加入慢病毒进行转染，每组设置3个重复；

(3)过夜培养后，更换为有血清培养基，即得到相应的骨髓间充质干细胞。加入成骨分化培养基，培养7d,根据需要中间可加转染一次；

(4)弃去培养基，用pbs洗涤3次，每孔加入200μltritonx-100，在冰上处理30min；

(5)将裂解后的细胞转移至离心管中，4℃，12000rpm，离心5min，收集上清液；

(7)在96孔板中，每孔加入10μl的上清液，50μl显色底物和40μl检测缓冲液；

(8)轻轻的摇匀，然后将96孔板放入到酶标仪中，405nm下检测od值。

图2是本发明实施例提供的cdc20的低表达抑制人间充质干细胞成骨向分化能力及cdc20的高表达增强人间充质干细胞成骨向分化能力的示意图；其中，图2a-2b示慢病毒敲低cdc20后显著降低了alp染色及活性，其矿化能力较对照组降低；图2c-2d示过表达cdc20质粒后显著升高了alp染色及活性，其矿化能力较对照组升高。

实施例3

敲低cdc20对nf-κb通路下游基因的调控作用

实验用qrt-pcr方法如上所述。用于扩增的引物信息如下：

图3示发明实施例提供的cdc20的低表达促进nf-κb下游基因的高表达。图3a-3d示在tnf-α作用0.5小时后，qrt-pcr结果显示，cdc20敲低组nf-κb下游基因il-8,il-6,icam1的表达量显著增高。

实施例4

cdc20调控人骨髓间充质干细胞成骨向分化是否依赖于对nf-κbp65的靶向降解

实验用蛋白质印记及alp染色定量方法如前所述。

图4示发明实施例提供的cdc20对人骨髓间充质干细胞成骨向分化作用依赖于cdc20对nf-κbp65的靶向降解调控作用。图4a示westernblot结果显示，cdc20敲低后，nf-κbp65的表达量明显上调；图4b示westernblot结果显示，cdc20过表达后，nf-κbp65的表达量明显下调，且在蛋白酶抑制剂mg132处理后，其表达量回复，提示cdc20通过泛素蛋白酶体途径降解nf-κbp65；图4c-4d示alp染色及定量结果显示在敲低cdc20的细胞系中敲低nf-κbp65可以回复其降低的成骨向分化能力。

综上所述，本发明证明cdc20在间充质干细胞成骨向分化过程中表达量逐渐升高；cdc20的敲低可抑制间充质干细胞成骨向分化，反之亦然；cdc20的抑制可以促进nf-κb下游基因的表达；cdc20调控间充质干细胞成骨向分化是依赖于对nf-κbp65的靶向降解作用，且通过泛素蛋白酶体途径。本发明揭示了cdc20的过表达能够增强间充质干细胞成骨向分化能力，并探索出泛素化修饰调控的具体分子生物学机制。在促进间充质干细胞小分子靶点的应用开发和以间充质干细胞为基础的骨组织工程技术的临床转化应用提供新的思路。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>北京大学口腔医学院

<120>cdc20在间充质干细胞成骨向分化中的应用

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<170>siposequencelisting1.0

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