本发明属于生物材料制备领域，具体涉及一种纳米粒子表面季铵盐修饰材料用于快速分离银耳多糖的方法。
背景技术：
银耳别名白木耳，属于真菌类银耳科银耳属。含有亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸等17种氨基酸。蛋白质6.7％～10％、脂肪0.6％～12.8％、碳水化合物65％～71.2％(其中银耳多糖60％～70％)。因其具有滋阴润肺、补脾开胃、益气清肠的功效，被人们称为“菌中之冠”。
多糖是银耳的主要成分，也是最有效、最富活性的重要成分之一。银耳多糖主要包括酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖等四种多糖。银耳多糖主链为由α-(1-3)-糖苷键组成的甘露聚糖，主链的2，4，6位上连接有葡萄糖、木糖、岩藻糖及普通糖醛酸等残基组成的侧链，其活性中心是α-(1-3)-甘露聚糖这一共同结构部分。银耳多糖的分子量达到130-170万。
现有银耳多糖的提取分离方法主要包括：银耳多糖的溶出-脱除蛋白-脱色-醇沉等步骤，其中脱除蛋白常采用三氯乙酸、鞣酸、sevage等有机溶剂或者酶法联合sevage试剂法，这些方法均是利用有机溶剂使蛋白质变性沉淀，需要大量使用有机溶剂，造成溶剂的残留，进一步加剧银耳多糖与杂质分离的困难。脱色法主要采用过氧化氢法、吸附法和离子交换法，这些方法存在脱色成本高，容易造成银耳多糖降解等问题。综上，银耳多糖的提取，杂质的分离脱除是银耳多糖提取的关键。张燕[1]等采用季铵盐沉淀法纯化荚膜多糖，极大减少了后续纯化步骤；杨其林[2]通过正交实验确定了ctab沉淀法提取茶多糖的最佳工艺条件，离心时间12min，ctab加入量25ml，沉淀时间6h，该条件下多糖得率为1.34％。但这些方法均存在后期需要将ctab等季铵盐与多糖分子进行分离，由于ctab等季铵盐具有表面活性剂性能，在分离过程中容易气泡，这造成了多糖在工程提取过程中的极大困难，并且ctab对皮肤和肠道具有较强的刺激性，即使极少量的残留都会对产品品质和功能产品不可挽回的伤害，因此，开发无季铵盐残留的季铵盐沉淀多糖提取方法，对多糖提取产业降低成本，提高效率具有重要的意义。
[1]张燕，李轻舟，杜连祥，戚薇，陈锦英，肺炎克雷伯氏菌夹膜多糖的提取纯化及其对细胞免疫活性的影响，生物工程学报，2005，21(3)：461-464.
[2]杨其林，刘钟栋，任健，孟庆华，采用ctab沉淀法提取茶多糖，食品与发酵工艺，2004，30(10)：139-142.
技术实现要素：
针对以上技术问题，本发明提供了一种提取过程简单，生产成本低，产品品质高的银耳多糖的分离纯化方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种纳米粒子表面季铵盐修饰材料用于快速分离银耳多糖的方法，包括：
将纳米氧化物在搅拌下加入到醇溶液中，并按纳米氧化物与季铵盐的质量比为1-50:1加入季铵盐，加热反应，待反应完成后，蒸除溶剂、干燥处理，得到表面季铵盐修饰的纳米氧化物；
银耳提取液通过季铵盐修饰的纳米氧化物，使季铵盐修饰的纳米氧化物与银耳多糖结合产生沉淀，通过反复洗涤，将银耳多糖沉淀与银耳中的蛋白质、色素、脂肪等其他组分相分离，再加入强离子盐，使银耳多糖与纳米粒子分离，利用膜过滤去除强离子盐及其余小分子物质，得到银耳多糖溶液，经干燥得到银耳多糖粉。
作为进一步优选的，所述纳米无机氧化物选用纳米tio2、sio2、al2o3、c、mgo、高岭土、蒙脱石、膨润土中的任意一种或几种，包括多种化合物的混合或者复合。
作为进一步优选的，所述季铵盐包括3-(三甲氧基硅基)丙基-十八烷基二甲基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基二甲基叔胺、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵。
作为进一步优选的，所述的醇溶液包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙二醇、丙三醇溶液。
作为进一步优选的，所述的强离子盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化锌。
作为进一步优选的，所述过滤膜选用可截留分子量大于1000kda的pvdf卷式膜或陶瓷膜。
其中，所述银耳提取液的制备方法如下：
银耳经充分浸泡后，以银耳：水＝1:1-50比例加入到破壁机中，破壁完成后，采用80目压滤布过滤，滤液稀释后，得到银耳提取液。
作为进一步优选的，所述季铵盐修饰的纳米氧化物加入层析柱中，银耳提取液通过过层析柱的方式，使季铵盐修饰的纳米氧化物与银耳多糖结合产生沉淀。
与现有技术相比较，本发明的有益效果如下：
本发明以无机金属氧化物为载体，在载体表面修饰季铵盐，以季铵盐修饰的氧化物为固定相，利用季铵盐吸附沉淀多糖的特点，将银耳多糖沉淀后与银耳的色素、蛋白质等杂质分离。沉淀的银耳多糖在强离子盐溶液的作用下，从固定相中脱离，而固定相中的季铵盐不会脱落，从而实现了季铵盐与多糖的分离，并且固定相可以重复使用。银耳多糖中的强离子盐，由于分子量小，通过简单的膜过滤即可与多糖分离。提取银耳多糖过程简单，生产成本低，产品品质高。生产过程中不会破坏银耳多糖结构，保持了银耳多糖特有的结构和功效；同时，纳米粒子季铵盐修饰后，季铵盐具有的抗菌性能，可有效降低多糖提取过程中的微生物量，避免生产过程微生物对产品品质的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的银耳多糖的分离纯化方法，其主要包括以下步骤：
1、季铵盐修饰的氧化物纳米粒子固定相的制备
取一定量的纳米氧化物，加入圆底烧瓶中，加入95％乙醇/丙二醇/异丙醇，激烈搅拌后，并按纳米氧化物与季铵盐的质量比为1-50:1加入季铵盐，加热反应，旋转蒸发去除溶剂，最后在60-120℃下干燥，得到季铵盐修饰的纳米氧化物粒子，季铵盐修饰后的纳米氧化物加入一定量的水，用玻璃棒不断搅拌，赶走纳米粒子中的气泡，用玻璃棒引流，沿着玻璃棒倒入层析柱中，用玻璃管敲击柱子，赶走层析柱中的气泡，打开活塞，流出水，让纳米粒子自然沉降，等到柱子快干时关闭活塞。
2、固定相吸附沉淀银耳多糖
银耳经充分浸泡后，以银耳：水＝1:1-50比例加入到破壁机中，破壁完成后，采用80目压滤布过滤，滤液经稀释，经蠕动泵泵送入层析柱中，打开层析柱活塞，使银耳溶液流过层析柱，泵送完成后，溶液由银耳溶液却换成去离子水作为流动相，继续泵送直至流动相流出液清澈透明。
3、银耳多糖的脱落、纯化和干燥
切换流动相为10％氯化钠或氯化钾等强离子盐溶液，直至银耳多糖完全被洗脱出来，将洗脱液导入膜过滤系统，选用截留分子量为300kda的pvdf卷式膜或陶瓷膜，将氯化钠与银耳多糖分离，同时去除低分子量的银耳多糖，保留中高分子量银耳多糖。将得到的银耳多糖经过旋转蒸发后干燥，最后得到分子量大于1000kda的银耳多糖。
实施例1
取50g纳米tio2加入圆底烧瓶中，加入95％乙醇/丙二醇50ml，激烈搅拌后，加入5g3-(三甲氧基硅基)丙基-十八烷基二甲基氯化铵(tsa)，加热80℃下反应回流3h，旋转蒸发去除溶剂后在90℃下干燥2h，得到季铵盐修饰的纳米tio2-tsa，50g将纳米tio2-tsa分散于150g水中，用玻璃棒不断搅拌，用玻璃棒引流，沿着玻璃棒倒入层析柱中，用玻璃管敲击柱子，赶走层析柱中的气泡，打开活塞，流出水，让纳米粒子自然沉降，等到柱子快干时关闭活塞。银耳经充分浸泡后，以银耳：水＝1:2比例加入到破壁机中，破壁完成后，采用80目压滤布过滤，滤液经1：5稀释，经蠕动泵泵送入层析柱中，打开层析柱活塞，使银耳溶液流过层析柱，泵送完成后，溶液由银耳溶液切换成去离子水作为流动相，继续泵送直至流动相流出液清澈透明。继续切换流动相为10％氯化钠强离子盐溶液，直至银耳多糖完全被洗脱出来，将洗脱液导入膜过滤系统，选用截留分子量为300kda的pvdf陶瓷膜，将氯化钠、色素等小分子物质与银耳多糖分离，同时去除低分子量的银耳多糖，保留中高分子量银耳多糖。将得到的银耳多糖经过旋转蒸发后真空冷冻干燥至水分含量3-10％，最后得到分子量大于1000kda的银耳多糖。银耳多糖得率为12.3％，透光度为93.5％，粘度为1.3pa·s。
实施例2
取50g介孔sio2加入圆底烧瓶中，加入95％乙醇/丙二醇50ml，激烈搅拌后，加入3g十二烷基二甲基叔胺(12dma)，加热80℃下反应回流3h，离心分离后，甲醇洗涤3遍，70℃下干燥2h，得到季铵盐修饰的介孔sio2-12dma，30g将纳米sio2-12dma分散于150g水中，用玻璃棒不断搅拌，用玻璃棒引流，沿着玻璃棒倒入层析柱中，用玻璃管敲击柱子，赶走层析柱中的气泡，打开活塞，流出水，让纳米粒子自然沉降，等到柱子快干时关闭活塞。银耳经充分浸泡后，以银耳：水＝1:10比例加入到破壁机中，破壁完成后，采用80目压滤布过滤，滤液经1：1稀释，经蠕动泵泵送入层析柱中，打开层析柱活塞，使银耳溶液流过层析柱，泵送完成后，溶液由银耳溶液切换成去离子水作为流动相，继续泵送直至流动相流出液清澈透明。继续切换流动相为10％氯化钠强离子盐溶液，直至银耳多糖完全被洗脱出来，将洗脱液导入膜过滤系统，选用截留分子量为300kda的pvdf陶瓷膜，将氯化钠、色素等小分子物质与银耳多糖分离，同时去除低分子量的银耳多糖，保留中高分子量银耳多糖。将得到的银耳多糖经过旋转蒸发后50-80℃下热风干燥至水分含量3-10％，最后得到分子量大于1000kda的银耳多糖。银耳多糖得率为22.5％，透光度为96.2％，粘度为1.4pa·s。
实施例3
取200g介孔tio2、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(gta)10g，加入10％氢氧化钠95％乙醇/丙二醇溶液中200ml，在80℃的水浴中搅拌回流6h，离心分离后，用乙醇洗涤3遍，0.1m的hcl溶液洗涤3遍，70℃下干燥6h得到季铵盐修饰的介孔tio2-gta，40g将介孔tio2-gta分散于150g水中，用玻璃棒不断搅拌，用玻璃棒引流，沿着玻璃棒倒入层析柱中，用玻璃管敲击柱子，赶走层析柱中的气泡，打开活塞，流出水，让纳米粒子自然沉降，等到柱子快干时关闭活塞。银耳经充分浸泡后，以银耳：水＝1:20比例加入到破壁机中，破壁完成后，采用80目压滤布过滤，滤液经1：1稀释，经蠕动泵泵送入层析柱中，打开层析柱活塞，使银耳溶液流过层析柱，泵送完成后，溶液由银耳溶液切换成去离子水作为流动相，继续泵送直至流动相流出液清澈透明。继续切换流动相为10％氯化钠强离子盐溶液，直至银耳多糖完全被洗脱出来，将洗脱液导入膜过滤系统，选用截留分子量为300kda的pvdf陶瓷膜，将氯化钠、色素等小分子物质与银耳多糖分离，同时去除低分子量的银耳多糖，保留中高分子量银耳多糖。将得到的银耳多糖经过旋转蒸发后真空冷冻干燥至水分含量3-10％，最后得到分子量大于1000kda的银耳多糖。银耳多糖得率为16.3％，透光度为94.6％，粘度为1.6pa·s。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。