一种非编码RNA生物标志物lnc-Wdr5的应用

一种非编码rna生物标志物lnc
‑
wdr5的应用
技术领域
1.本发明涉及一种非编码rna生物标志物lnc
‑
wdr5的应用，具体为lnc
‑
wdr5在诊断2型糖尿病中的应用，属于细胞生物学和生物医学技术领域。


背景技术：

2.长链非编码rna(long non
‑
coding rna,lncrna)是一种长度大于200bp的非编码rna。它们能以rna的形式在表观遗传水平、转录水平及转录后水平对基因进行调控。lncrna参与基因组印迹、dna甲基化、x染色体失活等生命过程
[1,2]
。因为lncrna具有和mrna类似的polya尾端，较为稳定，因此可以在组织、血清和尿液中检测出来
[3
‑
5]
。
[0003]
lncrna逐渐成为控制代谢组织发育和功能的重要调控元件
[6]
。代谢和葡萄糖稳态的调节是基本的生化过程，该过程包括从肠道吸收糖，从胰腺分泌胰岛素，在肝脏产生葡萄糖，以及脂肪、肌肉和其他组织对葡萄糖的摄取。胰腺通过分泌关键的内分泌激素(胰岛素和胰高血糖素)，在调节全身性葡萄糖代谢中起关键作用。其中胰岛素是合成代谢的主调节剂，它控制周围以及中枢神经系统相关的代谢。胰岛素合成和分泌功能异常、代谢器官对胰岛素敏感度异常是2型糖尿病发病机理的基础。lncrna的发现为调节网络增加了新的复杂性
[7]
。一些gwas研究报告了lncrna被定位到糖尿病易感基因座
[8
‑
11]
，所有这些都暗示了lncrna在胰岛素抵抗，糖尿病及其相关并发症中的关键作用。
[0004]
胰岛是研究人员了解糖尿病的病理生理学的重要中心节点
[12]
。据报道，另一种lncrna meg3在1型糖尿病和2型糖尿病小鼠模型的胰腺组织中被下调，其表达在min6和原代小鼠胰岛细胞中受到葡萄糖的动态调节
[13]
。cunnington
[14]
等发现，当anril(antisense non
‑
coding rna in the ink4 locus，ink4基因座的反义非编码rna，anril)的表达量下降时可导致包括糖尿病在内的多种疾病发生。以上研究提示，lncrna在维持胰岛细胞功能稳态发挥着重要作用，有可能成为诊断2型糖尿病的生物标志物。
[0005]
发明人课题组长年致力于糖尿病相关lncrna的研究，于2018.04.08申请发明专利《胰岛长链非编码rna 1810019d21rik及其应用》，于2019.04.02申请发明专利《一种2型糖尿病的诊断引物及试剂盒、以及非编码rna分子标志物的应用》，并于2020.12.21申请发明专利《一种非编码rna生物标志物lnc
‑
βfaar的应用》。这些均是发明人课题组关于胰岛β细胞相关lncrna的已有研究成果，未来还会有更多的研究来揭示与胰岛β细胞相关的lncrna，现在发明人课题组以最新获得的研究成果申请本专利。


技术实现要素：

[0006]
本发明的主要目的是：针对现有技术存在的问题，基于发明人课题组的研究成果，提出一种非编码rna生物标志物lnc
‑
wdr5的应用，具体包括：2型糖尿病的诊断引物及其用途，基于该诊断引物的诊断试剂盒及其用途，生物标志物lnc
‑
wdr5的检测方法，生物标志物lnc
‑
wdr5的用途。
[0007]
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
[0008]
一种2型糖尿病的诊断引物，其特征是，包括lnc
‑
wdr5正向引物seq id no:2以及lnc
‑
wdr5反向引物seq id no:3。
[0009]
上述lnc
‑
wdr5正向引物和反向引物可用以检测非编码rna分子标志物lnc
‑
wdr5的表达水平，从而为诊断2型糖尿病提供依据。
[0010]
本发明还提出：
[0011]
一种2型糖尿病的诊断试剂盒，其特征是，包括前文所述的诊断引物。
[0012]
优选地，所述诊断试剂盒还包括：作为阳性对照的非编码rna分子标志物，所述非编码rna分子标志物为序列如seq id no:1所示的lnc
‑
wdr5。
[0013]
采用该试剂盒，可通过检测lnc
‑
wdr5的表达水平为诊断2型糖尿病提供依据。
[0014]
本发明还提出：
[0015]
一种非编码rna分子标志物的检测方法，其特征是，采用前文所述的诊断引物，或采用前文所述的诊断试剂盒；所述非编码rna分子标志物为序列如seq id no:1所示的lnc
‑
wdr5。
[0016]
优选地，所述检测方法包括以下步骤：
[0017]
s1.提取血清样本或脂肪样本的总rna；
[0018]
s2.采用s1提取到的总rna，经逆转录获得cdna；
[0019]
s3.采用诊断引物，以实时荧光定量pcr法检测s2所得cdna中lnc
‑
wdr5的表达量；所述实时荧光定量pcr法采用染料法。
[0020]
本发明还提出：
[0021]
前文所述诊断引物的用途，其特征是，所述用途为用于制备预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于筛选预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于制备或筛选诊断2型糖尿病的产品。
[0022]
前文所述诊断试剂盒的用途，其特征是，所述用途为用于制备预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于筛选预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于制备诊断2型糖尿病的医疗工具。
[0023]
一种非编码rna分子标志物的用途，其特征是，所述非编码rna分子标志物为序列如seq id no:1所示的lnc
‑
wdr5；所述用途为用于制备预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于筛选预防或治疗2型糖尿病的药物，或者为用于制备或筛选诊断2型糖尿病的产品，或者为用于制备诊断2型糖尿病的检测标志物。其中，所述产品包括前文所述诊断引物、或前文所述诊断试剂盒；所述药物的作用包括调节胰岛素的合成或分泌。
[0024]
优选地，所述药物为原料药、药物制剂；所述产品为制剂、芯片、试剂、试剂盒。
[0025]
发明人经调研发现，血液中存在着上万种非编码rna，其具有含量丰富、性质稳定、便于检测、且与特异性疾病存在着显著关联性等特点。血液中的非编码rna由组织分泌，因此，血液中的非编码rna的含量应能间接反映组织中的表达水平；在此基础上，通过无创性或低创性抽取血样的手段，以快速、灵敏、特异性的定量检测方法，筛选2型糖尿病患者血液中特异性表达或异常表达的循环非编码rna作为分子标志物，应能作为糖尿病早期的辅助诊断技术手段，从而为遏制当前爆发性的糖尿病发病趋势贡献重要的社会价值。
[0026]
发明人在实践研究中发现，lnc
‑
wdr5是不同糖尿病模型小鼠胰岛组织中差异表达的lncrna之一，具有调控胰岛β细胞合成、分泌胰岛素的功能；而后研究发现，在小鼠胰岛β
细胞系min6细胞内过表达lnc
‑
wdr5能显著抑制胰岛素合成和分泌；进而研究发现，lnc
‑
wdr5在2型糖尿病患者血清样本和脂肪样本中的表达量远低于正常人，表明lnc
‑
wdr5在2型糖尿病的发生、发展中发挥一定作用，为临床检测诊断及治疗2型糖尿病提供新的生物靶标。通过上述研究，发明人最终得出了前文所述的检测方法、诊断引物、诊断试剂盒以及相关的用途。
[0027]
与现有技术相比，本发明可利用诊断引物/诊断试剂盒，通过检测非编码rna分子标志物lnc
‑
wdr5来诊断2型糖尿病，具有检测方法操作简单、灵敏度高、特异性强、对受检者的创伤性小等优点，可用于早期和不同阶段2型糖尿病的诊断，具有明显的临床应用价值。
附图说明
[0028]
图1为本发明实施例1中的分析结果图，具体为：lnc
‑
wdr5在肥胖模型(hfd)以及糖尿病模型(db/db)小鼠胰岛组织中rna
‑
seq和qrt
‑
pcr的结果验证图。其中ncd为hfd小鼠的对照小鼠，db/
‑
为db/db的对照小鼠。
[0029]
图2为本发明实施例1中lnc
‑
wdr5在ncd及hfd小鼠不同组织中的表达水平检测示意图。
[0030]
图3为本发明实施例2中lnc
‑
wdr5在min6细胞系内的转染效率验证结果示意图。
[0031]
图4为本发明实施例2中lnc
‑
wdr5过表达48小时后，qrt
‑
pcr检测胰岛素基因(ins1、ins2)合成结果示意图。
[0032]
图5为本发明实施例2中lnc
‑
wdr5过表达48小时后，小鼠胰岛素elisa试剂盒检测胰岛素分泌结果示意图。
[0033]
图6为本发明实施例3中qrt
‑
pcr检测2型糖尿病患者及正常人血清样本中lnc
‑
wdr5的表达差异结果示意图。
[0034]
图7为本发明实施例3中qrt
‑
pcr检测2型糖尿病患者及正常人脂肪样本中lnc
‑
wdr5的表达差异结果示意图。
具体实施方式
[0035]
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
[0036]
实施例1
[0037]
本实施例为小鼠实验研究。
[0038]
一、主要实验材料
[0039]
小鼠：8周龄的c57bl/6j小鼠(ncd小鼠)、8周龄的db/db小鼠(糖尿病模型小鼠)、8周龄的db/
‑
小鼠、以及hfd小鼠(c57bl/6j小鼠经高脂饮食喂养16周形成的肥胖模型小鼠)。
[0040]
主要试剂：hβss(10x)(invitrogen公司)，胶原酶
ⅴ
(sigma公司)，trizol裂解液(invitrogen公司)，rneasy plus universal mini kit(qiagen公司)。
[0041]
二、实验方法
[0042]
具体实验过程如下：
[0043]
2.1、不同模型小鼠胰岛组织的提取
[0044]
脱颈椎处死小鼠，置于体视显微镜下，于剑突下作横向切口，暴露肝脏、胃、十二指
肠和脾脏。镊子夹起十二指肠，暴露出十二指肠大乳头(白色凸起)和胆囊。从胆囊向下找到胆管、肝管和胰管交汇的y型三角区。在y型区靠近胰腺部位结扎一次，并在结扎处上方2mm处再次结扎防止灌注时漏液。用2.5ml注射器吸取2ml配好的胶原酶v溶液，从十二指肠肠管进针，再从肠内壁刺入十二指肠大乳头，并轻轻插入胰总管约0.8
‑
1cm，保持针头平直，轻推注射器活塞将胶原酶注入胰腺导管。此时胰腺应逐渐膨胀，胰尾开始充盈。注射完毕后，从胰尾开始轻轻分离胰腺包膜。将与胃体、十二指肠、小肠各部位相连的胰腺轻轻分离，置入含有3ml胶原酶v溶液的50ml离心管中。于37℃，60rpm消化28min，至均匀细沙状(颗粒小于1立方毫米)终止消化。加入5ml含10％胎牛血清hanks液终止消化。倒入10cm皿中，在倒置显微镜下手工挑取胰岛，将得到的较纯净的胰岛置入适当容器中备用。
[0045]
2.2、rna提取
[0046]
将获取的各组织按照rneasy plus universal mini kit(qiagen公司)试剂盒的要求提取：
[0047]
(1)样本中加入900μl qiazol lysis reagent，室温静置5min，加入100μl gdna eliminator solution剧烈混匀15s。
[0048]
(2)加入180μl三氯甲烷，剧烈涡旋混匀15s，室温静置2
‑
3min。
[0049]
(3)4℃12000g离心15min，吸取上层水相。
[0050]
(4)加入1倍体积(上清体积)的70％乙醇，充分混匀。
[0051]
(5)分次将液体加入rneasy mini spin colum收集管，每次最大体积为700μl，8000g室温离心1min。
[0052]
(6)在吸附柱内加入700μl buffer rwt，8000g室温离心1min。
[0053]
(7)加入500μl buffer rpe到吸附柱内，8000g室温离心1min，重复一次。
[0054]
(8)将吸附柱放入一个新的收集管，加入30μl无rna酶的水洗脱，即得总rna提取物。
[0055]
2.3、lncrna逆转录获得cdna
[0056]
(1)20μl体系：a：在rnase
‑
free ep管中加入下列溶液：1.2μl基因特异引物(mix)，rna样品；b：在rnase
‑
free ep管中加入下列溶液：4μl 5
×
mmlv rt buffer，0.75μl dntp，0.2μl mmlv reverse transcriptase；a、b两者混合后以rnase
‑
free h2o补至20μl。
[0057]
(2)rt
‑
pcr程序：a溶液置于70℃的金属浴中加热5min，置于冰上马上加入b溶液，混合均匀后于pcr仪内继续反应，反应程序为：42℃加热45min，85℃加热5min。完成后4℃备用。
[0058]
2.4、染料法检测lnc
‑
wdr5的含量
[0059]
(1)按照以下表格配制qrt
‑
pcr反应体系：
[0060]
表1、lnc
‑
wdr5的qrt
‑
pcr反应体系
[0061][0062]
(2)上述试剂混合完毕后，于roche480ii型qrt
‑
pcr仪上执行qrt
‑
pcr反应：预变性为95℃孵育3min，变性为95℃孵育12s，退火为62℃孵育40s。退火时采集荧光信号。变性和退火两步进行35次循环。
[0063]
注：此处的lnc
‑
wdr5引物为针对小鼠源lnc
‑
wdr5设计的正向引物和反向引物。
[0064]
三、实验结果与讨论
[0065]
(1)通过cuffdiff(v2.2.1)分析发现lnc
‑
wdr5在肥胖(hfd)及糖尿病(db/db)小鼠中表达量显著降低，随后通过qrt
‑
pcr对lnc
‑
wdr5的测序数据进行验证，发现验证结果与测序数据一致，说明lnc
‑
wdr5在肥胖及糖尿病小鼠中确实为低表达水平(如图1所示)。注：图一中的rna
‑
seq为经分析后的高通量测序数据。
[0066]
(2)提取ncd及hfd小鼠的心脏、肝脏、脂肪、肌肉、胰岛细胞的rna，通过qrt
‑
pcr检测其在不同组织中的表达差异，结果显示其hfd小鼠在胰岛、脂肪、肌肉中表达变化最为明显，说明lnc
‑
wdr5存在组织特异性(如图2所示)。
[0067]
以上述事实为基础，发明人认为后续应继续探讨lnc
‑
wdr5在胰腺中的生物学功能，同时有必要继续研究人源lnc
‑
wdr5在2型糖尿病患者、正常人血清样本及脂肪样本中是否有表达差异。
[0068]
实施例2
[0069]
本实施例为min6细胞(胰岛β细胞系)实验研究。
[0070]
一、主要实验材料
[0071]
细胞：min6细胞(胰岛β细胞系)。
[0072]
主要试剂：trizol裂解液(invitrogen公司)，lipofectamine 2000(thermofisher scientific公司)。
[0073]
二、实验方法
[0074]
具体操作如下：
[0075]
2.1、脂质体转染法转染min6细胞
[0076]
用lipofectamine 2000将lnc
‑
wdr5表达载体瞬时转染min6细胞，同时转染对照质粒pcdna3.1，转染48h后收集细胞。按照实施例1的2.2操作，提取细胞总rna。
[0077]
2.2、染料法检测lnc
‑
wdr5的含量
[0078]
具体方法同实施例1的2.3和2.4。
[0079]
2.3、以葡萄糖刺激胰岛素分泌实验(gsis)
[0080]
具体实施方法如下：
[0081]
(1)min6细胞(20
‑
30代)接种于48孔板中，在含有15％血清，1％双抗，50μmβ
‑
巯基
乙醇的高糖dmem培养基培养24h；
[0082]
(2)利用脂质体转染法将对照质粒pcdna3.1、lnc
‑
wdr5表达载体转染min6细胞，转染48h后弃完全培养基，用300μl洗涤液(2％血清，2.5mm葡萄糖的krbh缓冲液)洗涤3次，弃洗涤液，将min6细胞在200μl饥饿液(10％血清，2.5mm葡萄糖的kreb缓冲液)中孵育12h；
[0083]
(3)饥饿12h后用洗涤液洗涤3次，分别用200μl 2.5mm葡萄糖，33.3mm葡萄糖诱导2h；
[0084]
(4)取细胞上清于12000rpm离心5min，用小鼠胰岛素elisa试剂盒检测胰岛素的含量，同时用胰酶将细胞全部消化，然后用bca试剂盒定量总蛋白含量，将elisa试剂盒检测获得的胰岛素含量除以细胞总蛋白量得到每微克总蛋白中胰岛素的含量。
[0085]
三、实验结果与讨论
[0086]
3.1、lnc
‑
wdr5转染效率验证
[0087]
在min6细胞分别转染lnc
‑
wdr5表达载体和对照质粒pcdna3.1，转染48h后收rna，qrt
‑
pcr检测其表达水平，结果如图3所示，转染lnc
‑
wdr5表达载体形成过表达后，lnc
‑
wdr5表达水平明显升高，这表明转染效率较高。
[0088]
3.2、lnc
‑
wdr5调控胰岛素合成
[0089]
过表达lnc
‑
wdr5后，检测min6细胞内胰岛素的合成，结果如图4所示，当过表达lnc
‑
wdr5时胰岛素基因(ins1、ins2)的mrna表达量显著降低。
[0090]
3.3、lnc
‑
wdr5调控胰岛素分泌
[0091]
过表达lnc
‑
wdr5后，通过小鼠胰岛素elisa试剂盒检测min6细胞内胰岛素的分泌，结果如图5所示，当过表达lnc
‑
wdr5时，min6细胞胰岛素分泌显著降低。
[0092]
3.4、讨论
[0093]
胰岛素是一种蛋白质激素，是由胰岛β细胞受葡萄糖等物质刺激时产生的。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时也能促进糖原、脂肪、蛋白质合成，调节多种代谢过程。综合实施例2可知，lnc
‑
wdr5具有调控胰岛β细胞合成、分泌胰岛素的功能。
[0094]
实施例3
[0095]
本实施例为人血清样本、脂肪样本实验研究。
[0096]
采用本发明的诊断引物、诊断试剂盒、以及检测方法。
[0097]
各具体序列如下所示：
[0098]
seq id no:1：
[0099]
ccctttccagccctggtattcccctacaccagggcatcaaacctcctcaggcccaagggctgttcctcccactgatgtccaacaaggccatcctctgccacatatggggccagagccatgggtctctccatgtgtgctctttggttgacagtccggtccccaggagctctgcggggtctgtctggcagtgcccagtagattttcacatcaccgttgcacaattgaaggaagttaggacaagaacctggaggcaggagctggagcagaggtcctgaagaacattgcttactgtcttatttgtgccttagtcattttaagttttcatacctgcctaaaggtggcatcactaactgttgaggccctgtatcattaattaatcaaggaaacgccccgtagatcgctaccggccagtcttaacagaggcatgttctcaagatttccttttt。
[0100]
seq id no:2：cattttaagttttcatacctgcc。
[0101]
seq id no:3：aatcttgagaacatgcctct。
[0102]
一、主要实验材料
[0103]
样本：2型糖尿病患者及正常人群的血清样本及脂肪样本(样本临床信息来自各医
院，且符合相关规定)
[0104]
主要试剂：trizol裂解液(invitrogen公司)，mirneasy serum/plasma kit(qiagen公司)。
[0105]
二、实验方法
[0106]
具体实验过程：
[0107]
2.1、血清样本及脂肪样本总rna提取。
[0108]
(1)血清样本总rna按照mirneasy serum/plasma kit(qiagen公司)试剂盒的要求提取，得总rna提取物。
[0109]
(2)脂肪样本总rna按照实施例1的2.2操作，得总rna提取物。
[0110]
2.2、染料法检测lnc
‑
wdr5的含量
[0111]
具体方法同实施例1的2.3和2.4。其中，采用的lnc
‑
wdr5引物为lnc
‑
wdr5正向引物seq id no:2以及lnc
‑
wdr5反向引物seq id no:3。
[0112]
三、实验结果与讨论
[0113]
3.1、qrt
‑
pcr检测2型糖尿病患者及正常人血清样本中lnc
‑
wdr5的表达差异
[0114]
人血清样本用mirneasy serum/plasma kit(qiagen公司)提取总rna，通过qrt
‑
pcr检测lnc
‑
wdr5的表达差异，结果如图6所示，与正常人血清样本相比，lnc
‑
wdr5在2型糖尿病患者血清样本中的含量显著降低。
[0115]
3.2、qrt
‑
pcr检测2型糖尿病患者及正常人脂肪样本中lnc
‑
wdr5的表达差异
[0116]
人脂肪样本用rneasy plus universal mini kit(qiagen公司)提取总rna。通过qrt
‑
pcr检测lnc
‑
wdr5的表达差异，结果如图7所示，与正常人脂肪样本相比，lnc
‑
wdr5在2型糖尿病患者脂肪样本中的含量显著降低。
[0117]
由以上结果可知：
[0118]
(1)对于未知的人血清样本，检测其中非编码rna分子标志物lnc
‑
wdr5的表达量，并与已获知的正常人血清样本中lnc
‑
wdr5的表达量进行比较，根据比较结果可以诊断该样本是否为或是否可能为2型糖尿病患者。
[0119]
(2)对于未知的人脂肪样本，检测其中非编码rna分子标志物lnc
‑
wdr5的表达量，并与已获知的正常人脂肪样本中lnc
‑
wdr5的表达量进行比较，根据比较结果可以诊断该样本是否为或是否可能为2型糖尿病患者。
[0120]
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
[0121]
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