一种芦丁对呲柔比星诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法

本发明涉及抗癌技术领域,具体是一种芦丁对呲柔比星诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法。

背景技术：

蒽环类药物是多种实体肿瘤和血液淋巴系统恶性肿瘤的基础性治疗药物,然而,临床观察和研究显示蒽环类药物可诱导心脏毒性发生,且往往呈进展性和不可逆性。2011版中国临床肿瘤学会(csco)专家共识指出,给予蒽环类药物后6年超过50％的患者可发生左心室组织和功能亚临床心脏超声变化。呲柔比星(pirarubicin,thp)是蒽环类药物的一种,其所致心脏毒性等不良反应低于其他蒽环类药物,因此临床中广为应用。但在接受thp化疗的患者依然会出现不同程度的心脏毒性反应。右雷佐生(右丙亚胺；dzr)是美国食品药品管理局(fda)批准的唯一蒽环类药物心脏保护剂,被美国肿瘤临床实践及国内外其他多种指南推荐,广泛应用于蒽环类药物心脏毒性的预防和治疗。但有学者提出该药可能会降低蒽环类药抗癌药效,并且骨髓抑制患者应用dzr会更多引起严重粒细胞减少、血小板减少等不良反应^[1]。因此,寻找对心脏毒性具有良好防治效果的药物显得尤为重要。

通过近年一直对rut的心血管系统的保护及抗肿瘤的作用进行研究,证实其能够抑制异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化；进而对rut保护thp诱导的心脏毒性进行了研究,并预测可能与微小rna(microrna,mirna)调节有关。mirna通过调控下游靶基因,从而发挥生物学功能,为深入了解rut对thp诱导心脏毒性的保护作用提供了新思路。通过分析mirna-靶基因的表达相关性及其互作关系,揭示rut在改善thp所致心脏毒性中发挥作用的机制,对肿瘤化疗患者在使用蒽环类药物过程中减轻心脏毒性并增强抗癌疗效具有极其重要的临床现实意义,因此提出了一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种芦丁对呲柔比星诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法,以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的,本发明提供如下技术方案：

一种芦丁对呲柔比星诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法,具体分为以下步骤：

s1、将小鼠hl-1心肌细胞系、人乳腺上皮细胞mcf10a和人乳腺癌细胞系mda-mb-231在高糖培养基(dmem；10％胎牛血清(fbs；hyclone)中培养；

s2、在dmso中制备1mol/l的rut储备溶液,并在-20℃下保存,用无血清培养基稀释溶液,并将dmso的浓度控制在0.1％以下,将细胞以5×10⁴细胞/ml的密度接种在96孔板中24小时,然后用不同浓度的rut(0–800μm)处理,与rut孵育6小时,12小时和24小时后,向每个孔中添加10μl细胞计数试剂盒8,在37℃下温育2小时后,使用bioradpolarstar酶标仪测量450nm处的吸光度；

s3、用无血清dmem稀释thp溶液；

s4、mir-129-1-3pmimics,mimics阴性对照(mimicsnc),mir-129-1-3p模拟物在5'端用fam绿色荧光料标记,mmu-mir-129-1-3pmimics,forward:aagcccuuaccccaaaaaguau,reverse:acuuuuugggguaagggcuuuu；mimicsnc,forward:uucuccgaacgugucacgutt,reverse:acgugacacguucggagaatt,使用lipofectamine2000在无血清培养基中转染细胞8小时,转染完成后,将无血清培养基替换为新鲜正常培养基,转染效能以阳性核数与总核数之比计算；

s5、使用dcfh-daros测定试剂盒测定细胞内ros水平；

s6、s5步骤处理后,将细胞固定在4％多聚甲醛中,并在0.1％triton-x100中透化,使用tunel细胞凋亡检测试剂盒评估细胞凋亡,用dapi对细胞进行复染,并在bx43荧光显微镜下以100倍放大率进行分析,以tunel阳性细胞核与总细胞核的比率计算凋亡率；

s7、使用公共领域数据库进行go分析和kegg通路富集分析,通路调控网络使用cytoscape软件映射可视化,使用targetscan数据库筛选鉴定了mir-129-1-3p的潜在靶标；

s8、使用来自hl-1细胞的基因组dnapcr扩增了含有mir-129-1-3p假定结合位点的grin2d的野生型3′-非翻译区(utr),相应的3'-utr突变体是通过改变mir-129-1-3p结合位点的种子区域而产生的,将野生型和突变型3′-utrs亚克隆到萤光素酶基因下游的psicheck-2萤光素酶载体中,两种构建体均通过dna测序验证,hl-1细胞与mir-129-1-3p模拟物或mir-129-1-3p抑制剂以及包含野生型或突变型3′-utr的荧光素酶质粒在24孔板中共转染,转染后48小时,使用双重荧光素酶报告基因测定系统确定荧光素酶活性,并标准化至海肾活性；

s9、使用荧光ca²⁺敏感染料fluo-3am测量细胞内钙水平,在用pbs洗涤之后,在37℃下向细胞加入5μmfluo-3am30分钟,并在bx43荧光显微镜下以100倍放大率进行检查,细胞内ca²⁺积累评估为fluo-3am阳性核与总核的比率；

s10、待mda-mb-231细胞单层融合度接近孔底的100％时,用200μl的黄枪头垂直在细胞上划线,将漂浮的细胞用pbs洗去,继续培养；

s11、使用transzol提取总rna；

s12、统计方法采用spss23.0统计软件处理数据,数据符合正态分布并经方差齐性检验,数据以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova),组间两两之间比较采用snk-q检验,p<0.05为差异有统计学意义。

作为本发明进一步的方案：所述步骤s1中的细胞培养环境为37℃、含5％co2的潮湿环境。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤s3中具体步骤为：将心肌细胞以5×104细胞/ml的密度接种在96孔板中24小时,并用不同浓度的rut(0-800μm)预处理1h,然后再用thp(5μm)处理24小时,对照组的细胞在正常条件下在dmem中培养,最后,如上所述使用cck8方法检测细胞活力。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤s5中测定具体步骤为：将细胞以5×10⁴细胞/孔的密度接种在六孔板中,并培养24小时,随后将细胞用thp(5μm)处理24小时,除去培养基,并加入1.5ml的dcfh-da(10μm),将细胞在37℃下孵育30分钟,并在bx43荧光显微镜下以100倍放大率进行分析。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤s10中继续培养的具体步骤为：将mda-mb-231细胞放置于37℃的co2恒温培养箱中,24h后收样,在显微镜下观察细胞划痕愈合情况,拍照保存。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤s11中具体步骤为：使用transstarttopgreenqpcrsupermix试剂盒将每个rna样品反转录为cdna,通过qrt-pcr确定grin2dmrna和gapdhmrna的水平,使用sanprep色谱柱microrna微型制备试剂盒,分离总mirna,使用micrornafirststrandcdnasynthesiskit将每个mirna样品反转录为cdna,使用microrna定量pcr试剂盒通过qrt-pcr确定mirna-129-1-3p和u6snrna的水平。

与现有技术相比,本发明的有益效果是：

本发明通过go分析和kegg通路富集分析确定mir-129-1-3p表达影响的途径,将mir-129-1-3p与ca²⁺信号通路联系起来,通过targetscan数据库显示在grin2d的3'-utr端有一个与mir-129-1-3p结合位点,grin2d是n-甲基-d-天冬氨酸受体钙通道的一个亚基,双荧光素酶报告证实mir-129-1-3p直接调控grin2d,在hl-1(小鼠)心肌细胞中,thp可以引起氧化应激钙超载和细胞凋亡而mir-129-1-3p过表达可以改善thp诱导的变化,相反mir-129-1-3p敲低可以使其加重mir-129-1-3-p在人正常乳腺细胞mcf10a中呈高表达,而在人乳腺癌细胞mda-mb-231中表达明显下降。并且过表达mir-129-1-3-p可以抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,并且同样与ca²⁺信号通路密切相关,进而确定mir-129-1-3p是通过下调grin2d介导的ca²⁺通路来保护thp诱导的心肌细胞凋亡和促进乳腺癌细胞凋亡,揭示了芦丁保护心肌并增敏呲柔比星抗乳腺癌的作用及机制,mir-129-1-3p/ca²⁺信号通路可作为开发新的心脏保护药物以控制thp诱导的心脏毒性及增强抗癌效果的靶点。

附图说明

图1为一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法的不同浓度芦丁保护thp诱导的心肌细胞效果示意图。

图2为一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法的mir-129-1-3p的水平发挥缓解thp诱导的心肌损伤和抗乳腺癌细胞增殖的作用示意图。

图3为一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法的mir-129-1-3p成功转染至hl-1和mda-mb-231示意图。

图4为一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法的芦丁和mir-129-1-3p均能抑制thp导致的心肌细胞损伤示意图。

图5为一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法的mir-129-1-3p通过直接靶向grin2d与ca²⁺通路相关示意图。

图6为一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法的rut和mir-129-1-3p抑制thp诱导的心肌细胞钙超载示意图。

图7为一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法的mda-mb-231细胞划痕愈合情况示意图。

图8为一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法的rut和mir-129-1-3p抑制细胞grin2dmrna的表达示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。

一种rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用研究方法,具体分为以下步骤：s1、将小鼠hl-1心肌细胞系、人乳腺上皮细胞mcf10a和人乳腺癌细胞系mda-mb-231在高糖培养基(dmem；10％胎牛血清(fbs；hyclone)中培养；s2、在dmso中制备1mol/l的rt储备溶液,并在-20℃下保存,用无血清培养基稀释溶液,并将dmso的浓度控制在0.1％以下,将细胞以5×10⁴细胞/ml的密度接种在96孔板中24小时,然后用不同浓度的rut(0–800μm)处理,与rut孵育6小时,12小时和24小时后,向每个孔中添加10μl细胞计数试剂盒8,在37℃下温育2小时后,使用bioradpolarstar酶标仪测量450nm处的吸光度；s3、用无血清dmem稀释thp溶液；s4、mir-129-1-3pmimics,mimics阴性对照(mimicsnc)mir-129-1-3p模拟物在5'端用fam绿色荧光料标记,mmu-mir-129-1-3pmimics,forward:aagcccuuaccccaaaaaguau,reverse:acuuuuugggguaagggcuuuu；

mimicsnc,forward:uucuccgaacgugucacgutt,reverse:acgugacacguucggagaatt,使用lipofectamine2000在无血清培养基中转染细胞8

小时,转染完成后,将无血清培养基替换为新鲜正常培养基,转染效能以阳性核数与总核数之比计算；s5、使用dcfh-daros测定试剂盒测定细胞内ros水平；s6、s5步骤处理后,将细胞固定在4％多聚甲醛中,并在0.1％triton-x100中透化,使用tunel细胞凋亡检测试剂盒评估细胞凋亡,用dapi对细胞进行复染,并在bx43荧光显微镜下以100倍放大率进行分析,以tunel

阳性细胞核与总细胞核的比率计算凋亡率；s7、使用公共领域数据库进行go分析和kegg通路富集分析,通路调控网络使用cytoscape软件映射可视化,使用targetscan数据库筛选鉴定了mir-129-1-3p的潜在靶标；s8、使用来自hl-1细胞的基因组dnapcr扩增了含有mir-129-1-3p假定结合位点的grin2d的野生型3′-非翻译区(utr),相应的3'-utr突变体是通过改变mir-129-1-3p结合位点的种子区域而产生的,将野生型和突变型3′-utrs亚克隆到萤光素酶基因下游的psicheck-2萤光素酶载体中,两种构建体均通过dna测序验证,hl-1细胞与mir-129-1-3p模拟物或mir-129-1-3p抑制剂以及包含野生型或突变型3′-utr的荧光素酶质粒在24孔板中共转染,转染后48小时,使用双重荧光素酶报告基因测定系统确定荧光素酶活性,并标准化至海肾活性；s9、使用荧光ca²⁺敏感染料fluo-3am测量细胞内钙水平,在用pbs洗涤之后,在37℃下向细胞加入5μmfluo-3am30分钟,并在bx43荧光显微镜下以100倍放大率进行检查,细胞内ca²⁺积累评估为fluo-3am阳性核与总核的比率；s10、待mda-mb-231细胞单层融合度接近孔底的100％时,用200μl的黄枪头垂直在细胞上划线,将漂浮的细胞用pbs洗去,继续培养；s11、使用transzol提取总rna；s12、统计方法采用spss23.0统计软件处理数据,数据符合正态分布并经方差齐性检验,数据以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova),组间两两之间比较采用snk-q检验,p<0.05为差异有统计学意义。

步骤s1中的细胞培养环境为37℃、含5％co2的潮湿环境,步骤s3中具体步骤为：将心肌细胞以5×10⁴细胞/ml的密度接种在96孔板中24小时,并用不同浓度的rut(0-800μm)预处理1h,然后再用thp(5μm)处理24小时,对照组的细胞在正常条件下在dmem中培养,最后,如上使用cck8方法检测细胞活力,步骤s5中测定具体步骤为：将细胞以5×10⁴细胞/孔的密度接种在六孔板中,并培养24小时,随后将细胞用thp(5μm)处理24小时,除去培养基,并加入1.5ml的dcfh-da(10μm),将细胞在37℃下孵育30分钟,并在bx43荧光显微镜下以100倍放大率进行分析,步骤s10中继续培养的具体步骤为：将mda-mb-231细胞放置于37℃的co2恒温培养箱中,24h后收样,在显微镜下观察细胞划痕愈合情况,拍照保存,步骤s11中具体步骤为：使用transstarttopgreenqpcrsupermix试剂盒将每个rna样品反转录为cdna,通过qrt-pcr确定grin2dmrna和gapdhmrna的水平,使用sanprep色谱柱microrna微型制备试剂盒,分离总mirna,使用micrornafirststrandcdnasynthesiskit将每个mirna样品反转录为cdna,使用microrna定量pcr试剂盒通过qrt-pcr确定mirna-129-1-3p和u6snrna的水平。

黄酮类化合物具有抗氧化还原酶的特性,这使得它们从某种程度上可能抑制蒽环霉素引起的心脏毒性。rut是一种重要的食用黄酮,富含于多种植物、蔬菜和果实中,为槐米的主要活性成分之一,具有抗氧化、抗炎以及抗癌的活性。rut不仅能够清除超氧化物阴离子、单线态氧和脂质过氧游离基,还可以抑制铜催化的氧化反应。已有研究证实,在由活性氧所诱发的心肌病变中,rut可以清除活性氧,抑制激酶的激活。本课题组结合国内外研究现状,发现在rut对thp所致的心脏毒性相关研究尚属空白。自2016年开展本项目相关研究工作,并申请专利2项[rut类药物在制备预防或治疗药物性心脏毒性的药物中的应用,cn201610148329.1；一种含有rut类药物的抗肿瘤药物组合物,cn201610100778.9]。研究表明rut可显著促进thp诱导的体外培养h9c2细胞的增殖,提高细胞存活率,加速细胞周期中s期和g2/m期进程,抑制ros生成；体内研究也发现rut可显著改善thp导致的心肌损伤大鼠的心功能,降低血清心肌酶含量,减轻心肌组织形态学改变；thp可使tgf-β1、cleavedcaspase-3及p38磷酸化表达水平升高,bcl-2/bax表达水平降低,表明thp可以激活tgf-β1/p38mapk信号通路,导致心肌损伤,而rut可下调tgf-β1、cleavedcaspase-3及p38的磷酸化水平,上调bcl-2/bax表达水平,从而抑制心肌损伤。上述研究结果证实,芦丁对thp诱导的心肌损伤具有保护作用,其作用机制是通过调控tgf-β1/p38mapk信号通路实现的；

研究表明,mirna参与调节心脏的生长发育、机械重构和电重构等过程,并与心脏疾病有密切关系。并且,阿霉素毒性与mirna的调控有关,经阿霉素诱导损伤后的心肌细胞可表达一定水平的mirna,如在动物实验中随着药物暴露量的增加,mir-208b、mir-216b、mir-215、mir-34及mir-367在大鼠心肌细胞中均上调。同时,阿霉素亦可使调控心肌细胞存活的mirnas(mir-21、mir-208a、mir-146a及mir-532-3p)上调,例如,mir-21通过调节抗增殖因子-b细胞易位基因2保护阿霉素诱导的心肌细胞凋亡；mir-208a可介导阿霉素依赖性的转录因子gata4下调；mir-146a可通过直接靶向作用于erbb而进一步促进心肌细胞的存活。亦有研究表明,阿霉素上调mir-532-3p,可促使心肌细胞的线粒体分裂,促进心肌凋亡。因此,可以推测,mirna

不仅可以用作评估蒽环类药物相关心脏毒性风险的临床生物标志物,而且还可以用作潜在的治疗靶标。已证明mir-129-1-3p在癌症和免疫抑制中起重要作用。据报道,mir-129-1-3p

通过作用于子卵巢癌和乳腺癌等恶性肿瘤中的不同分子靶标来干扰肿瘤的发展和预后。在之前的研究中,我们建立了rut保护的thp诱导的大鼠心脏毒性模型,使用mirna微阵列技术构建了rut诱导的thp诱导的心肌损伤的mirna表达谱,并筛选了差异表达的mirna。我们发现mir-129-1-3p在thp/对照组中显着下调,而在rut/thp组中显着上调[12]。因此mir-129-1-3p可能在rut对thp诱导的心脏毒性的保护作用中起重要作用。因此,在该体外模型中,我们研究了rut对thp诱导的心肌细胞损伤的保护作用,并进一步探索了mir-129-1-3p与乳腺癌细胞之间的作用及其相互作用机制。

参阅图1,通过cck8结果显示,不同浓度rut对hl-1和mcf10a无影响,而对thp处理过引起损伤的心肌细胞有明显的保护作用,并且可以明显抑制乳腺癌细胞mda-mb-231的增殖,其中以100μm的芦丁浓度为该实验的最佳浓度；

参阅图2,通过qpcr结果显示,thp使hl-1细胞中mir-129-1-3p水平下降,rut可使其水平部分恢复。在乳腺上皮细胞中,与mcf10a细胞相比,mda-mb-231细胞中mir-129-1-3p水平明显降低。而rut作用后,会使mir-129-1-3p水平升高；

参阅图3,使用mir-129-1-3p模拟物转染了hl-1和mda-mb-231细胞。如图3a和3b所示,mir-129-1-3p模拟物已成功转染到细胞中,转染效率为70-85％,

参阅图5,通过检测hl-1细胞内ros水平和细胞凋亡情况,结果显示thp可以显著增加细胞内ros水平,导致细胞大量凋亡,而rut和mir-129-1-3p均可不同程度抑细胞内ros的水平并有效缓解细胞凋亡(图4),mir-129-1-3p对心肌细胞保护作用的分子机制,对mir-129-1-3p进行go富集分析,揭示了mir-129-1-3p与ca²⁺信号通路之间的潜在联系,kegg通路富集分析发现ca²⁺通路是thp诱导的心肌损伤中失调的前20条通路之一。随后在targetscan数据库筛选出grin2dmrna的3'-utr处存在一个潜在的mir-129-1-3p结合位点。考虑到grin2d是nmda受体ca²⁺通道的亚基,推测mir-129-1-3p通过直接靶向grin2d调节thp处理的心肌细胞内ca²⁺内流。并且通过双荧光素酶报告实验证实grin2d是mir-129-1-3p的靶点；

参阅图6,通过心肌细胞内ca²⁺检测结果显示,thp可以引起心肌细胞内ca²⁺超载而导致细胞损伤,而rut和mir-129-1-3p可以减少thp引起的细胞内ca²⁺超载；

参阅图7,通过划痕实验结果显示,thp降低了细胞侵袭转移能力,但并不明显,而rut和mir-129-1-3p可以增强thp抗细胞侵袭转移的能力；

参阅图8,通过qpcr结果显示,在心肌细胞hl-1中,thp可以增加高钙离子通透性的配体门态离子通道grin2d的mrna水平,rut和mir-129-1-3p可以抑制thp导致的grin2d升高(图a)。在乳腺癌细胞mda-mb-231中,thp可以抑制grin2dmrna的表达水平,rut和mir-129-1-3p可以增强grin2d下降的水平。

发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。