一种靶向钠离子通道蛋白Nav1.4的新型多肽NaV-B及其应用的制作方法

一种靶向钠离子通道蛋白nav1.4的新型多肽nav-b及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向钠离子通道蛋白nav1.4的新型多肽nav-b及其应用。


背景技术：

2.电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channel；nav)广泛存在于人体中，是一种重要的跨膜结构蛋白，通过产生动作电位从而调节神经递质的分泌、血管收缩和骨骼肌兴奋性等多种生理过程。目前发现多种人类疾病同nav通道突变有关，包括癫痫、心律不齐、肌肉麻痹、强直性肌痉挛症、疼痛综合征和自闭症等。其中，电压门控钠离子通道1.4(nav1.4)由scn4a基因编码，特异的在骨骼肌中表达。nav1.4可以控制神经-肌肉接头的端板电位产生和t-tubules膜的去极化扩散，从而启动和调节骨骼肌的收缩。目前至少有五种遗传性病变同nav1.4突变有关，包括高钾周期性瘫痪、低钾周期性麻痹、副肌酸结子、钾加重肌无力和先天性肌无力综合征，因此也是治疗药物的热点靶标之一。
3.多肽因其具有较高的靶向性和安全性，已经成为一种药物分子开发的主流方向。目前，通过分子模拟和对接来预测多肽同靶蛋白之间的结合模式和亲合力，已经成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。
4.因此，急需研究和开发可以特异地靶向钠离子通道蛋白nav1.4，为未来开发成治疗人类相关疾病的新药提供了基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，而提供一种靶向钠离子通道蛋白nav1.4的新型多肽nav-b，该多肽是由主链和二硫键形成的复合卷曲结构，能够稳定地靶向钠离子通道蛋白nav1.4。
6.本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，而提供一种靶向钠离子通道蛋白nav1.4的新型多肽nav-b在制备治疗离子通道相关疾病的药物中的应用。
7.本发明的目的通过以下技术方案实现：
8.提供一种靶向钠离子通道蛋白nav1.4的新型多肽nav-b，所述多肽nav-b的氨基酸序列如seq id no:1所示。
9.上述技术方案中，所述多肽nav-b的三维结构是由主链和二硫键形成的复合卷曲结构，并且保留了核心封闭分子lys
10
、arg
18
和arg
22
。
10.上述技术方案中，所述多肽nav-b可通过lys
10
、arg
18
和arg
22
三个氨基酸位点分别靶向离子通道蛋白nav1.4的四个结构域：asp
406
、glu
409
；lys
1244
、glu
1248
；glu
761
、glu
764
；asp
1539
、asn
1548
。
11.本发明还提供上述一种靶向钠离子通道蛋白nav1.4的新型多肽nav-b在制备治疗离子通道相关疾病的药物中的应用。
12.上述技术方案中，所述疾病包括高钾周期性瘫痪、低钾周期性麻痹、副肌酸结子、
钾加重肌无力和先天性肌无力综合征，以及由于皮下肌肉记忆性紧绷引起的面部及身体皱纹。
13.本发明的有益效果：
14.本发明开发了一种靶向钠离子通道蛋白nav1.4的新型多肽nav-b，其氨基酸序列为ghccgdeyrkwcgkrvcrnkarcc，该多肽nav-b保留了核心封闭分子lys
10
、arg
18
和arg
22
。通过对多肽三维结构的预测结构显示，nav-b是由主链和二硫键形成了复合卷曲的结构，可以靶向钠离子通道蛋白nav1.4，形成稳定的蛋白复合体。本发明的多肽nav-b能够稳定地靶向钠离子通道蛋白nav1.4，且为人工合成设计开发，与天然提取靶向药物相比，具有更高的产率、产量和经济性，从而为未来开发成治疗人类相关疾病的nav通道靶向药物提供了基础，具有非常好的应用前景。
附图说明
15.利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
16.图1为本实施例的多肽nav-b的三维结构示意图。
17.图2为本实施例的多肽nav-b与钠离子通道蛋白nav1.4的分子对接示意图。
18.图3为本实施例的多肽nav-b与nav1.4蛋白复合物对接位点的示意图。
19.图4为本实施例的动力学模拟平均整个蛋白rmsd值变化的示意图。
20.图5为本实施例的动力学模拟各氨基酸残基rmsd值变化的示意图。
具体实施方式
21.结合以下实施例及附图对本发明作进一步描述。
22.1、多肽nav-b的设计：
23.根据已经报道的nav1.4的阻断分子，进行优化组合排列，用vector nti10.3软件对其氨基酸序列进行比对，找出氨基酸序列的同源序列，并用bioedit软件显示和编辑比较结果，获得多肽nav-b的氨基酸序列。
24.2、多肽nav-b的三维结构预测：
25.运用modeller软件对多肽nav-b的三维结构进行预测：
26.(1)首先准备好nav-b.ali序列文件和pdb_95.pir文件；
27.(2)运行prf.buid()命令寻找与目的基因相近的pdb模板，nav-bout.prf存放输出结果，前6行记录了modeller构建这个文件的相关参数，后续行对应profile.build()检测到的相似处，选择相似度高和e值比较低的模板；
28.(3)在pdb模板数据库中下载上述候选模板的pdb文件，运行命令for()in()筛选最佳模板；
29.(4)在modeller窗口中运行automodel()命令获取蛋白预测结果；
30.(5)选择dope score最低且ga341 score最高的结果为最佳模型；
31.(6)使用pymol软件打开预测结果，获得多肽nav-b的三维结构图像，如图1所示，其中lys10为第十位的赖氨酸，arg18为第十八位的精氨酸，arg22为第22位的精氨酸，-nh2为
保护基团。
32.3、多肽nav-b与钠离子通道蛋白nav1.4的分子对接分析：
33.运用基于快速傅里叶变换的刚性蛋白对接程序的zdock进行多肽-蛋白对接分析：
34.(1)准备好nav1.4和多肽nav-b的pdb文件；
35.(2)启动discovery studio 4.0，在同一个3d窗口中打开受体和配体蛋白；
36.(3)打开zdock设置对话框，设置旋转角度(angular step size＝15)、zrank＝false、对接构象分簇的参数设置(top poses＝2000、rmsd cutoff＝6.0、interface cutoff＝9.0和maximum number of clusters＝60)，设置并行计算为ture；
37.(4)运行zdock并查看结果，筛选打分最高的模型；
38.(5)使用pymol软件打开对接模型，对活性口袋以及对接位点进行分析。
39.多肽结构、nav1.4蛋白晶体结构以及nav1.4-多肽复合物的对接模型结构如图2所示，其中箭头表示出的位点为活性口袋的分子对接位点。
40.多肽nav-b与nav1.4蛋白的复合物(nav1.4-多肽nav-b)对接位点如图3所示，氨基酸用三字母缩写表示，数字表示对应的氨基酸位置：lys(赖氨酸)，arg(精氨酸)、asp(天冬氨酸)、asn(天冬酰胺)；两个视角展示nav1.4-多肽nav-b复合物的对接方式，d1表示nav1.4结构域1，d2表示nav1.4结构域2，d3表示nav1.4结构域3，d4表示nav1.4结构域4。
41.4、nav1.4-多肽nav-b复合物的动力学模拟分析：
42.运用namd和vmd对nav1.4蛋白晶体和多肽nav-b-nav1.4蛋白复合体的动力学过程进行模拟：
43.(1)在vmd控制面板中调取tk console，cd进入目的文件夹，mol new filename.pdb，用automatic psf builder进行psf文件创建，调用top_all27_prot_lipid_na.inp脚本，加载脚本信息，生成链，完成psf文件的创建；
44.(2)生成了filename.pdb和filename.psf文件，重命名为original.pdb和original.psf，添加solvationbox，boundary设置为1.5；
45.(3)运用已经写好的minimization.namd进行能量最小化，其中脚本中的boundarydata运用findbox.tcl获取，另外准备脚本par_all36_lipid_prot_carb.prm，从cmd命令窗口输入namd2+p4 minimize.namd》dummy.out获得能量最小化；
46.(4)准备好nvt.namd脚本，从能量最小化的文件中进行动力学模拟过程，从cmd命令窗口输入namd2+p8 nvt.namd》dummy.out；
47.(5)对输出结果进行分析，确定动力学模拟过程中的升温结果及动力势能等信息，运用rmsdplot度蛋白的rsmd值进行分析绘图，结果见图4和5。
48.图4中的两条曲线分别表示出nav1.4蛋白晶体以及nav1.4-多肽nav-b复合物的rmsd值变化，从中体现出蛋白骨架在动力学模拟时长中的活跃度。
49.图5中的上图为nav1.4蛋白晶体中各氨基酸残基的rmsd值，下图为nav1.4-多肽nav-b复合物的氨基酸残基rmsd值，横坐标标注了氨基酸残基的位置，rmsd值用标尺所示的颜色表示。
50.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实
质和范围。