一种新型氨肽酶及其可溶性表达方法

本发明属于蛋白酶筛选及重组表达
技术领域：
，具体涉及一种氨肽酶及其可溶性表达方法。
背景技术：
：氨肽酶是一类能从蛋白质和多肽n端选择性切除氨基酸残基产生游离氨基酸的外切蛋白酶。氨肽酶在食品工业和制药工业有广泛应用，在食品工业中氨肽酶被用来进行食物脱苦，改善食品风味，也可以与其他蛋白酶一起作为蛋白测序的工具酶。基于常用的merops数据库(https://www.ebi.ac.uk/merops/)的经典分类方法，以氨肽酶活性位点对抑制剂的敏感性，氨肽酶包含有丝氨酸氨肽酶，半胱氨酸氨肽酶以及金属氨肽酶等家族。众所周知，蛋白的活性位点决定了其催化底物的特异性，所以迫切需要开发具有不同底物结合活性位点的氨肽酶，以获得具有不同降解特性的氨肽酶来满足应用需求。在金属氨肽酶m1家族中，氨肽酶o(aminopeptidaseo,ampo)是一类未表征过的新型的氨肽酶。与氨肽酶o最相似的两个家族分别为氨肽酶b(aminopeptidaseb，apb)和白三烯a4水解酶(leukotrienea-4hydrolase，lta4h)，相似度分别为23.5％和20％。以上氨肽酶都包含三个结构域，分别为m1的n端结构域(具有引导折叠的功能)，m1结构域(催化域)和白三烯水解结构域。催化域包括hexxhx18e和gxmenx保守模块；在其他金属氨肽酶中，hexxhx18e在金属氨肽酶上被证明为锌离子的结合域。其中的两个组氨酸和后面的谷氨酸被认为与锌离子直接发生相互作用，前面的谷氨酸是酸碱催化的活性中心；在氨肽酶o中被认为参与底物结合和与底物稳定有关系的保守序列变为lgmasp，除了蛋氨酸具有保守性，其他氨基酸残基有明显的差异(图1)，提示对底物特异性和底物与酶的结合状态有影响。但迄今为氨肽酶o还不能在大肠杆菌中进行可溶性表达，这大大限制了其在产业的应用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种氨肽酶o及其可溶性表达方法，从而弥补现有技术的不足。本发明首先提供一种氨肽酶o，其氨基酸序列为：metqldpmkddlplmantsymlvkhyildldvdfeskviegiivlffetgsrykktsstgkgscqsqfgetckmraselchtpvtnvsacsskteyndfavcgkgeedtsdkngnhsnkeqasgissskdccdienhgnkdfllvldccdlsvlkveevdvaavsgiekftrsaeltdvskelenlrnqivhelvtlpadrwkeqlyyftrcsqapgcgellfttgtwsleirksgiqtptdfphairiwyktkpegrsvtwttdqsgrpcvytmgspinnralfpcqeppialstwqasvrtaagfvvlmsgensaepvqlregslswyyyvtmpmpastftiavgcwqevkqqsftaaiqtniefslpssqadfrwheeicghleypcrfqnpaarlqavipyrvfapwclmehceecllqlipqclsaayttlgthpfsrldvlivpsnfsslgmasphiiflsqsvlpggshlcgtrlcheiahawfglaigardwteewisegfatfledifwaraqqgallrwrrlrdevqnseeelqvlrpkkestgelsesgasvvkhglkaekifmqvhylkgyfllrslartigeasylaslrkfvhrfhgqlvlsqdflcmlledipeqkkseltvesifqnwldtsgipkplleegetwkecqlvrqvsgevtkwiqtnqrirksgkkkrkqdevvfqkllpdqlvllleylleektlcprilqclektyqlreqdaevrhrwcelvvkhkyvpgygdvekflredqamgvylygelmvnedakqqelahkcfaaarehmdassakvvaemlf(seqodno:1)；本发明还提供用于编码上述氨肽酶o的基因，其一种核苷酸序列如下：atggaaacccagcttgatccgatgaaagatgacctgccgctgatggcgaacacctcttatatgctggttaaacactacatcctggacctggacgttgattttgaatctaaagtgattgaaggcatcattgttctgtttttcgaaactggttcccgttataaaaagacctctagcaccggtaaaggtagctgccagagccagttcggcgaaacctgcaaaatgcgtgcgtctgaactgtgccacaccccggtgaccaacgttagcgcttgctctagcaaaaccgaatacaacgacttcgcggtttgtggtaaaggtgaagaagatacctccgataaaaacggtaaccactctaacaaagaacaggcgtctggcattagcagcagcaaagactgctgcgatattgaaaaccacggtaacaaagacttcctgctggtgctggattgctgcgacctgagcgtcctgaaagttgaagaagttgacgttgctgccgttagcggcattgaaaaattcacccgctccgcggaactgaccgatgtgagcaaagaactggaaaacctgcgtaaccagatcgtgcatgaactggtgactctgccggcggaccgctggaaagaacagctgtactactttactcgctgcagccaggcaccgggctgcggcgaactgctgttcaccaccggcacctggtctctggaaatccgtaaatctggcatccagaccccgaccgattttccgcacgctattcgtatttggtacaaaaccaaaccggaaggtcgtagcgtaacctggaccactgatcaatccggccgtccgtgcgtctacaccatgggttccccgatcaacaaccgtgcgctgttcccgtgccaggaaccaccgatcgcactgagcacctggcaggcctccgtgcgtaccgcagcaggctttgttgttctgatgagcggtgaaaactctgcggaaccggtgcagctgcgtgaaggttcccttagctggtactattacgttactatgccgatgccagcttccaccttcaccatcgccgtgggttgttggcaggaagttaaacagcagtctttcaccgcggcgatccagactaacatcgaattctccctgccgagctctcaggcagacttccgttggcacgaagaaatctgcggccacttggaatacccgtgccgcttccagaacccggcggcgcgcctgcaggcggtgatcccgtatcgtgtgtttgcgccgtggtgtctgatggaacactgtgaggaatgcctgctgcagctgattccgcaatgtctgagcgcggcttacaccacactgggcacccacccgtttagccgcctggatgtgctgatcgttccgagcaacttcagctctctcggtatggcgtccccgcatatcattttcctgtctcagtccgttctgccgggcggttctcacctgtgcggcactcgtctgtgccacgaaatcgcacatgcatggttcggcctggctattggcgcgcgtgactggaccgaagaatggattagtgaaggcttcgcgacctttctggaagatatcttctgggcacgtgctcagcagggcgcactgctgcgttggcgtcgtctgcgcgacgaagttcagaacagcgaagaagaactgcaggtgctgcgtccgaaaaaagaatccaccggtgaactgtcggaatctggtgcgagcgttgtgaaacatggcctgaaagcagaaaaaatctttatgcaggttcactacctgaaaggctacttcctgctgcgctctctggcgcgcaccatcggtgaggcgtcctacctggcttccctgcgtaaattcgttcatcgctttcacggccagttggtgctgagccaggatttcctgtgcatgctgctggaagatatcccggaacagaaaaaatccgaactgaccgttgaatctatcttccagaactggctggataccagcggtatcccgaaaccgctgctggaagaaggcgaaacttggaaagaatgccagctggttcgtcaggttagcggcgaagttaccaaatggattcagaccaaccagcgcatccgtaaatctggcaaaaagaaacgtaaacaggatgaagtagttttccagaaactgctgccggatcagctggtgctgctgctggaatatctgctggaagaaaaaactctgtgcccgcgcatcctgcagtgtctggaaaaaacttatcagctgcgtgaacaggatgcggaagtgcgtcaccgctggtgtgaactggttgttaaacataaatatgttcctggctacggtgatgttgaaaaattcctgcgtgaagatcaggctatgggtgtttacctgtacggtgaactgatggttaacgaagatgcgaaacagcaggaactggcacataaatgcttcgcagcagcgcgtgaacacatggacgcaagcagcgcaaaagttgtggcggaaatgctgttc(seqidno:2)；本发明还提供一种重组表达载体，是将编码上述氨肽酶o的核苷酸片段插入到载体中构建的；所述的载体，为原核表达载体pmcsg9载体；本发明还提供一种表达上述氨肽酶o的方法，是在宿主菌中转入上述的重组表达载体后进行发酵，重组表达上述的氨肽酶o；所述的宿主菌为大肠杆菌。本发明还提供所述的氨肽酶o的应用，是用于降解多肽来产生谷氨酸glu；glu是常见的呈味氨基酸酸中鲜味最强的氨基酸，因此具有降解glu的氨肽酶在风味食品加工中具有独特的应用潜力。本发明实现了氨肽酶o在大肠杆菌中的可溶性表达，从而能够促进氨肽酶o在产业上的应用。相对于真核表达体系，大肠杆菌是一种常见的原核体外重组表达体系，其具有发酵周期短，生产制备成本低等优势；而且可溶性表达有活性的氨肽酶可以有效的避免因包涵体复性带来活性损失和复杂的包涵体复性步骤，从而降低酶的制备成本。附图说明图1：m1肽酶家族部分肽酶和锌离子作用相关序列(paampo片段403-550)比较图，前四个蛋白来源生物为人，名称前标识码为酶在uniprot数据库标识码，后为对应的名称(rnpl1：aminopeptidasernpepl1,似氨肽酶b肽酶)；xp_009326408.1为ncbi阿德利企鹅氨肽酶o序列标识码。三个黑粗线标记前后分别为gxmenx和hexxhx18e保守基序以及对比ncbi氨肽酶关键模块，黑点标记为已经证明与底物结合和活性相关的关键氨基酸；图2：paampo预表达与诱导条件优化图，其中(a)pet28a载体表达paampo，m为marker，1为诱导前，2为诱导后，3为可溶性蛋白，4为包涵体蛋白；(b)pmcsg9载体优化表达paampo，m为marker，诱导条件为od600＝0.4iptg0.4mm；1-1为包涵体，1-2为可溶性蛋白。图3：mbp-paampo融合蛋白表达和酶学检测图，其中图a是pmcsg9-paampo粗酶，mbp-paampo的预测大小为140kda；m为marker，泳道1为可溶蛋白，泳道2为包涵体，泳道3为粗酶；图b是paampo粗酶对arg-pna、leu-pna和glu-pna的活性，对照为空载粗酶，相对活性＝粗酶活性/空载粗酶活性。图4：q柱洗脱和对glu-pna活性图，其中(a)q柱线性洗脱蛋白的sds-page，m是marker,泳道1粗酶即上样前，泳道2结合后流出，泳道3为200mmnacl洗脱蛋白，泳道4-10为200-500mmnacl线性洗脱蛋白分别命名为q1-q7。条带为质谱检测的切胶条；(b)200-500mm线性洗脱样品(q1-q7)对glu-pna的活性变化。图5：蛋白shotgun质谱检测特征肽覆盖图，全序列为paampo的完整序列，斜体有背景为检测片段。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。实施例1对阿德利企鹅基因组数据进行分析，重新拼接预测后获得了一条新的氨肽酶，命名为ampo_pygoscelisadeliae(paampo)，其氨基酸序列为seqidno:1。氨肽酶paampod的氨基酸序列与ncbi上的蛋白序列(xp_009326408.1)相比，在催化结构域m1结构域缺少12个氨基酸残基(图1)，推测其对于酶的表达和活性将有着重要影响。优化后的paampo编码基因的核苷酸序列与ncbi上核苷酸序列genbank：xm_009328133)具有的73.94％序列同源性。实施例2：不同表达载体筛选和优化考虑到氨肽酶表达的困难和产业化应用的需要,对不同的表达标签和表达条件进行了筛选,其中表达标签为his标签和mbp标签合成基因：根据优化的核酸序列信息合成paampo的基因，并且通过分析序列酶切位点信息和备选载体信息设计在合成基因前端加上bamhⅰ酶切序列，后端的终止密码子后加上xhoⅰ酶切序列。表达菌株构建：利用bamhⅰ/xhoⅰ消化带有酶切序列的paampo，琼脂糖电泳后切胶，使用gelextractionkit(omega)回收，利用t4连接酶(takara)克隆至pet28a和pmcsg9载体构建pet28a-paampo和pmcsg9-paampo,条件为16℃，4h，转化e.coilbl21(de3)。而后分别使用卡那霉素(kan)和氨苄青霉素(amp)的固体lb培养基筛选，挑选单克隆，菌落pcr验证，扩增酶使用2×pcrmix(东盛生物)检测，引物使用pet28a和pmcsg9的通用引物(t7&t7ter,生工)，体系如下表1。并将筛选正确的菌株培养后，保存至20％甘油中，贮存在-80℃。表1：pcr的反应体系表2×pcrmix5μl引物t7(10μm)1μl引物t7ter(10μm)1μl双蒸水3μl预表达与表达优化：将己构建好的表达菌株接种到含有相应抗生素的液体培养基(pet28a对应kan，pmcsg9对应amp)中，37℃振荡培养至菌液od600为0.6-0.8，加入终浓度为0.4mmiptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，半乳糖类似物)诱导，将培养温度降至20℃，过夜培养。3000×g离心30min收集菌体，加入裂解缓冲液(20mmtris-hclph8.0)，悬沉后超声破碎后，12000×g离心30min，上清部分为可溶性蛋白，沉淀为包涵体蛋白。检测结果提示，pet28a-paampo表达在包涵体中(图2a)。而pmcsg9-paampo中有明显的可溶性表达(图2b)。对pmcsg9-paampo进行表达的条件如下：37℃培养至od600为0.6-0.8，加入iptg终浓度为0.4mm诱导后转移至20℃,过夜培养。实施例3：paampo蛋白的活性检测为检测重组蛋白活性，按照检测氨肽酶活性的一般方法，以aa-pna(氨基酸对硝基苯胺)作为底物，根据氨基酸的酸碱性，以酸性氨基酸谷氨酸对硝基苯胺(glu-pna),中性氨基酸亮氨酸对硝基苯胺(leu-pna),碱性氨基酸精氨酸对硝基苯胺(arg-pna)作为检测活性和确定底物的特异性的底物。1、重组蛋白表达:按照上文优化条件表达，3000×g离心30min收集菌体，加入裂解缓冲液(20mmtris-hclph8.0)，将菌悬液置于超声波粉碎仪上按照超声2s，停4s按50％功率共15min的程序进行菌体超声波(新芝jy92-ⅱn)破碎，12000×g离心30min，收集上清可溶性蛋白，在裂解缓冲液中透析2h，12000×g离心10min后蛋白液视为粗酶见图3(a)。2、底物溶解：glu-pna终浓度为2.5mm溶于20mmtris-hclph8.0；arg-pna和leu-pna溶于水，终浓度为10.0mm。3、活性检测：按以下200μl反应体系检测活性：50mmtris-hclph8.0，200mmnacl，0.25mmaa-pna，20μl粗酶。37℃反应30min，检测405nm的光吸收。pmcsg9空载表达的可溶性蛋白按相同的方法和菌体量制备的粗酶(下文定义为空载粗酶)，见图3(b)，paampo对glu-pna的活性与对照差别最大，这也提示粗酶有异于空载粗酶，说明paampo对glu-pna的活性，是一种具有glu底物特异性的氨肽酶。4、离子交换色谱纯化与质谱鉴定：得到了对glu-pna有特异性的粗酶，需要提高纯度；通过质谱进一步确定paampo的可溶性表达。色谱柱确定：通过网站(https://web.expasy.org/protparam/)预测paampo和mbp-paampo的pi均小于7，在ph为8的缓冲液中，所以选用强阴离子交换色谱柱：hitrapqxl(1ml,ge)。5、hitrapqxl层析：层析过程全部在akta快速蛋白纯化仪(pure25，ge)上完成的。首先使用10倍柱体积(cv)结合缓冲液平衡色谱柱；按上文步骤制备粗酶后，经0.22μm的滤膜过滤后以1ml/min上样；使用结合缓冲液清洗色谱柱直至uv280基线水平以除去与层析柱未结合或结合不紧密的蛋白；然后使用洗脱缓冲液1(20mmtris-hclph8.0，200mmnacl)洗脱色谱柱，并收集蛋白洗脱液(200粗酶)；待基线水平后，按照200mm-500mmnacl线性洗脱色谱柱5cv，每管0.5ml分管收集蛋白(q1-q7)。保留关键步骤的样品电泳，结果见图4(a)。测活性确定活性集中在200mm-500mm线性洗脱样品中，结果见图4(b)。但预测大小组分(140kda)未包含在该组分，推测其大部分是折叠错误的融合蛋白。根据mbp(42kda)分子大小出有明显增多，推测在mbp-paampo被降解产生约100kda不含mbp的paampo蛋白(图4(a)条带)。蛋白质shotgun质谱检测：为了鉴定“条带”组分是否为paampo组分，对“条带”进行蛋白质shotgun质谱检测。聚丙烯酰胺电泳后切下考马斯染色胶条，胰蛋白酶酶解后产物质谱检测，用内置软件sequestht的proteomediscoverer2.4(thermoscientific)查库鉴定分析，搜索目标为paampo的整条序列，丢失的酶切位点小于等于2，标注特征肽。质谱结果显示条带中检测的特征肽有37条，对paampo的覆盖率为41％(如图5)，能证明paampo表达在该条带所在的位置。综上，本发明首次在大肠杆菌中实现氨肽酶o的可溶性表达，确定氨肽酶o对glu-pna的活性，这异于与其序列相似度最高的氨肽酶b和白三烯a4水解酶。序列表<110>中国海洋大学<120>一种新型氨肽酶及其可溶性表达方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>815<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1metgluthrglnleuaspprometlysaspaspleuproleumetala151015asnthrsertyrmetleuvallyshistyrileleuaspleuaspval202530aspphegluserlysvalilegluglyileilevalleuphepheglu354045thrglyserargtyrlyslysthrserserthrglylysglysercys505560glnserglnpheglygluthrcyslysmetargalasergluleucys65707580histhrprovalthrasnvalseralacysserserlysthrglutyr859095asnaspphealavalcysglylysglyglugluaspthrserasplys100105110asnglyasnhisserasnlysgluglnalaserglyileserserser115120125lysaspcyscysaspilegluasnhisglyasnlysasppheleuleu130135140valleuaspcyscysaspleuservalleulysvalglugluvalasp145150155160valalaalavalserglyileglulysphethrargseralagluleu165170175thraspvalserlysgluleugluasnleuargasnglnilevalhis180185190gluleuvalthrleuproalaaspargtrplysgluglnleutyrtyr195200205phethrargcysserglnalaproglycysglygluleuleuphethr210215220thrglythrtrpserleugluilearglysserglyileglnthrpro225230235240thrasppheprohisalaileargiletrptyrlysthrlysproglu245250255glyargservalthrtrpthrthraspglnserglyargprocysval260265270tyrthrmetglyserproileasnasnargalaleupheprocysgln275280285gluproproilealaleuserthrtrpglnalaservalargthrala290295300alaglyphevalvalleumetserglygluasnseralagluproval305310315320glnleuarggluglyserleusertrptyrtyrtyrvalthrmetpro325330335metproalaserthrphethrilealavalglycystrpglngluval340345350lysglnglnserphethralaalaileglnthrasnileglupheser355360365leuproserserglnalaasppheargtrphisglugluilecysgly370375380hisleuglutyrprocysargpheglnasnproalaalaargleugln385390395400alavalileprotyrargvalphealaprotrpcysleumetgluhis405410415cysgluglucysleuleuglnleuileproglncysleuseralaala420425430tyrthrthrleuglythrhispropheserargleuaspvalleuile435440445valproserasnpheserserleuglymetalaserprohisileile450455460pheleuserglnservalleuproglyglyserhisleucysglythr465470475480argleucyshisgluilealahisalatrppheglyleualailegly485490495alaargasptrpthrgluglutrpilesergluglyphealathrphe500505510leugluaspilephetrpalaargala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