一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，属于一种激素的提取方法，具体为一种华北豹 粪便类固醇激素的提取方法。


背景技术：

2.类固醇激素(steroidhormone)是一类脂溶性激素，它们在结构上都是环戊烷 多氢菲衍生物。类固醇激素的分子质量较小，且是脂溶性的，可通过扩散或载 体转运进入靶细胞，激素进入细胞后先与胞浆内的受体结合。类固醇激素具有 极重要的医药价值；在维持生命、调节性功能，对机体发展、免疫调节、皮肤 疾病治疗及生育控制方面有明确的作用。
3.采用非损伤采样方法，采集华北豹的粪便样品。利用粪便样品提取生殖激 素代替血液样品提取生殖激素，具有很多其自身的优点：
4.一、有效的避免捕捉、麻醉或静脉穿刺而使动物产生应激反应，确保了动 物在自然状态下的激素分泌水平，减少对动物的伤害，同时确保了实验数据的 准确性和可靠性；
5.二、粪便样本采集过程既省时又省力，可以降低采集样品的成本。


技术实现要素：

6.针对上述问题本发明提供了一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法。
7.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
8.本发明提供一种华北豹粪便类固醇激素的提取方法：
9.(1)所述类固醇激素包括雌二醇和孕酮；
10.(2)所述雌二醇和孕酮提取的最佳方法为乙醇加热法，具体包括以下步骤：
11.步骤1，称取1g粪便加入10ml体积百分比浓度为80％的乙醇溶液中；
12.步骤2，在70℃水浴振荡15min后，冷却至4℃，4 000rpm/min离心15min， 取上清液；
13.步骤3，残渣加入5ml体积百分比浓度为80％的乙醇溶液重新悬浮，涡旋 震荡1min，3 000rpm/min离心15min，取上清液；
14.步骤4，合并步骤2和步骤3所得的上清液，经60℃水浴空气吹干；
15.步骤5，加1ml 0.05mol/l的pbs溶液复溶，
‑
20℃保存，备检。
16.(3)所述雌二醇和孕酮提取的方法还包括甲醇加热法和乙醇蒸馏水法。
17.进一步，所述用于雌二醇和孕酮提取的甲醇加热法，包括以下步骤：
18.(1)称取1g粪便加入10ml体积百分比浓度为90％的甲醇溶液；
19.(2)在涡旋震荡仪上充分震荡1min，置于60℃的恒温水浴锅中温浴20 min；
20.(3)4 000rpm/min离心10min，取上清液，置于
‑
20℃下保存，备检。
21.进一步，所述用于雌二醇和孕酮提取的乙醇蒸馏水法，包括以下步骤：
22.(1)称取1g粪便加入10ml体积百分比浓度为90％的甲醇中；
23.(2)超声波振荡30min，3000r/min离心10min，取上清液；
24.(3)加入2ml乙醇，超声波振荡30min，3 000r/min离心10min，取上 清液；
25.(4)合并步骤(2)和步骤(3)的上清液，37℃水浴蒸发干燥；
26.(5)依次缓慢加入3ml甲醇、1ml蒸馏水、2ml乙醚，静置30min， 此时溶液分成上下两层。
27.(6)从下层中取2ml溶液，37℃水浴蒸发干燥后，加入1ml 0.05mol/l 的pbs缓冲液，37℃水浴振荡30min，置于
‑
20℃下保存，备检。
28.与现有技术相比本发明具有以下优点：
29.本发明采用非损伤采样方法，既省时又省力，还降低了采集样品的成本。 有效的避免了捕捉、麻醉或静脉穿刺而使华北豹产生应激反应，确保了华北豹 在自然状态下的激素分泌水平，确保了实验数据的准确性和可靠性；本发明提 供的乙醇加热法、甲醇加热法和乙醇蒸馏水法操作简便，均可实现一次同时提 取雌二醇(e2)和孕酮(p)，提取效率高，使用最佳的提取方法
‑
乙醇加热法测 得雌二醇的含量为7 660.25
±
1 546.11pg/ml，孕酮的含量为3.26
±
0.35ng/ml。
具体实施方式
30.下面结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的 说明。
31.实施例1
32.乙醇加热法(ethanol
‑
heating method)提取华北豹粪便类固醇激素
33.(1)用电子秤称取1g华北豹粪便于离心管中，加入10ml体积百分比浓 度为80％的乙醇；
34.(2)然后在70℃振荡水浴15min，之后，冷却至4℃，离心(4 000rpm/min， 15min)，取上清液至玻璃试管中；
35.(3)残渣继续加入5ml体积百分比浓度为80％乙醇重新悬浮，涡旋震荡 1min后，离心(3 000rpm/min，15min)，取上清至玻璃试管中；
36.(4)合并(2)和(3)的上清液，将含有乙醇的上清液60℃水浴空气吹干；
37.(5)加1ml0.05 mol/l的pbs复溶，
‑
20℃保存，备检。
38.实施例2
39.甲醇加热法(carbinol
‑
heating method)提取华北豹粪便类固醇激素
40.(1)用电子秤称取1g粪便于离心管中，加入体积百分比浓度为90％的甲 醇10ml；
41.(2)在涡旋震荡仪上充分震荡1min，置于60℃的恒温水浴锅中温浴20 min；
42.(3)之后在离心机中以4 000rpm/min离心10min，取上清液于新的离心管 中，置于
‑
20℃下保存，备检。
43.实施例3
44.乙醇蒸馏水法(ethanol
‑
distilled
‑
water method)提取华北豹粪便类固醇激素
45.(1)用电子秤称取1g粪便于离心管中，加入体积百分比浓度为90％的甲 醇10ml；
46.(2)超声波振荡30min，离心(3000rpm/min，10min)，取3ml上清液；
47.(3)再加入2ml乙醇，超声波振荡30min，离心(3 000rpm/min，10min)， 取3ml上清液；
48.(4)合并两次上清液置玻璃瓶中，37℃水浴蒸发干燥。
49.(5)然后向玻璃瓶中依次缓慢加入3ml甲醇、1ml蒸馏水、2ml乙醚， 静置30min，此时溶液分成上下两层。
50.(6)从下层中取2ml溶液，37℃水浴蒸发干燥后，加入0.05mol/l的pbs 缓冲液1ml，37℃水浴振荡30min，置于
‑
20℃下保存，备检。
51.实施例4
52.类固醇激素的含量检测：
53.将实施例1
‑
3中3种方法提取的样品，平衡到室温，摇晃均匀。分别各取 500μl于10ml离心管内，用pbs溶液进行10倍稀释确保其检测结果处于相 应试剂盒的允许检测范围之内，将稀释后的样品利用放射免疫分析法(ria)测 定类固醇激素(雌二醇和孕酮)的含量。
54.1、取离心管若干支，标记好处理组(样品管)与对照组(nsb管)、标准 管(s0‑
s6管，s0‑
s6管添加梯度浓度的标准品)。按照表1中的加样程序加样， 混匀，置于室温孵育30min，在转速为3500r/min离心10min，弃上清液，在 放射免疫计数器上计算沉淀放射性计数。
55.表1.e2放射免疫测定加样程序
56.管名标准品样品蒸馏水抗体125i
‑
e2分离剂总t管————————100——nsb管100(s0)——100——100500s0～s6管100————100100500样品管——100——100100500
57.2、标准曲线的绘制
58.利用放射性免疫法测得s0‑
s6管的免疫沉淀数cpm后，在坐标纸上以s0‑
s6管标准品浓度为横坐标，标准管的放射性沉淀数(cpm)/零标准管(s0管)放 射性沉淀数(cpm)的百分比即(bi/b0％)为纵坐标绘制标准曲线。
[0059][0060]
式中，b0表示管s0测得的沉淀值；bi表示si管测得免疫沉淀值。nsb管 为对照组即空白处理组/空白计数管。
[0061]
3、样品激素浓度计算
[0062]
将样品管测得的放射性沉淀数代入上述标准曲线，计算样品激素含量，得 到激素的含量为x ng/ml，原始粪便样品各激素的浓度为雌二醇(e2)＝8x ng/g， 孕酮(p)＝8x ng/g。每个样品重复六次。
[0063]
4、检测结果
[0064]
(1)雌二醇(e2)含量检测结果：
[0065]
从表2可以看出，甲醇加热法测得雌二醇(e2)的含量为2 815.47
±ꢀ
297.47pg/ml，乙醇加热法测得雌二醇(e2)的含量为7 660.25
±
1 546.11pg/ml， 乙醇蒸馏法测得雌二醇(e2)的含量为1 937.83
±
231.71pg/ml。以抽提方法为 组内因子，对粪便中雌二醇含量检测结果进行单因素重复测量方差分析，结果 表明，甲醇加热法与乙醇蒸馏法2种提取方法
的测定结果间无明显差异，甲醇 加热法和乙醇蒸馏法与乙醇加热法测定结果间差异显著。
[0066]
(2)孕酮(p)含量检测结果：
[0067]
从表2可以看出，甲醇加热法测得孕酮(p)的含量为3.26
±
1.72ng/ml， 乙醇加热法测得孕酮(p)的含量为3.26
±
0.35ng/ml，乙醇蒸馏法测得孕酮(p) 的含量为0.31
±
0.11ng/ml。以抽提方法为组内因子，对粪便中孕酮含量检测结 果进行单因素重复测量方差分析，结果表明，甲醇加热法与乙醇加热法2种提 取方法的测定结果间无明显差异，甲醇加热法和乙醇加热法与乙醇蒸馏法测定 结果间差异显著。
[0068]
表2不同方法提取粪样中e2和p含量的测定结果(mean
±
sd)
[0069]
抽提方法重复数雌二醇(pg
·
ml
‑1)孕酮(ng
·
ml
‑1)甲醇加热法62 815.47
±
297.47
a
3.26
±
1.72
a
乙醇加热法67 660.25
±
1 546.11
b
3.26
±
0.35
a
乙醇蒸馏法61 937.83
±
231.71
a
0.31
±
0.11
b
[0070]
通过对比发现：乙醇加热法是提取华北豹粪便中雌二醇的一种高效率提取 方法，而乙醇加热法和甲醇加热法均可作为提取华北豹粪便样品中孕酮的理想 提取方法。
[0071]
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些 改进应视为本发明的保护范围。