一种促生复合微生物菌剂及其应用

本发明属于微生物技术领域，涉及一种促生复合微生物菌剂及其应用。

背景技术：

当前土壤中出现的通透性不强、保水保肥性差、地力差等问题严重影响农业可持续发展。因此，改良土壤、提升地力、改善土壤生态环境、提高农作物产量和品质已成为当前农业工作的重点。微生物在土壤中物质和能量的输入输出中扮演着非常重要的角色，是物质循环链上的重要环节。它能够活化土壤有机与无机养分，分解有机物，释放养分，增加养分的有效性。微生物在其繁殖和代谢过程中，可以降解土壤中残留的化肥、有机农药、重金属和其他污染物等，在其理化反应中对上述污染物质进行分解、转化、固定、转移以及新的无害化合成，把他们分解成低害甚至无害的物质，降低土壤污染的程度。此外，土壤中的微生物，例如抗生性微生物，它们能够分泌抗生素，抑制病原微生物的繁殖，这样就可以防治和减少土壤中土传微生物对作物的危害，提高作物品质和产量。微生物菌剂是微生物经过工业化生产后获得固体菌粉，再通过一定的载体吸附获得微生物菌剂固体制剂；而利用工业发酵后的单一微生物发酵液，或多种微生物发酵液按照一定比例混合则制成为微生物菌剂液体制剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种促生复合微生物菌剂及其应用。所述促生复合微生物菌剂的组成菌种具有较强的解磷解钾固氮作用，能够在植物体内定殖。所述促生复合微生物菌剂能够提高植物叶绿素含量，提高植物生物酶活性，促进植物生长发育。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种促生复合微生物菌剂，包括贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01。

所述促生复合微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的固体菌粉或发酵液的质量比为（3~5）:（3~6）:（3~8）。

上述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis），已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏编号为：cgmccno.20900。

上述克什米尔小陌生菌bqb-b04，其分类命名为克什米尔小陌生菌（advenellakashmirensis），已于2021年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏编号为：cgmccno.21796。

上述高地芽孢杆菌zlb-c01，其分类命名为高地芽孢杆菌（bacillusaltitudinis），已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏编号为：cgmccno.20898。

所述促生复合微生物菌剂中的总活菌浓度为（5~8）×10⁸cfu/ml或（2~3）×10⁹cfu/g。

所述促生复合微生物菌剂为液体制剂或固体制剂。

所述促生复合微生物菌剂固体制剂的制备方法为：贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的固体菌粉按质量比混合，制成固体混合菌粉；载体与固体混合菌粉以100:2~5的质量比混合后获得促生复合微生物菌剂固体制剂，所述载体为麸皮。

所述促生复合微生物菌剂液体制剂的制备方法为：贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的发酵液按照质量比为（3~5）:（3~6）:（3~8）的比例混合获得。

本发明提供了所述的促生复合微生物菌剂在促进植物生长中的应用。

本发明的有益效果：

本发明的促生复合微生物菌剂的组成菌种具有较强的解磷解钾固氮作用，能够在植物体内定殖。所述促生复合微生物菌剂能够提高植物叶绿素含量，提高植物生物酶活性，对调节植物生长和发育具有重要促进作用。将促生复合微生物菌剂通过灌根接种植物幼苗，能够明显提高叶片叶绿素含量，提高过氧化氢酶（cat）、过氧化物酶(pod)和超氧化物歧化酶(sod)含量，与对照相比，差异显著；能够促进植物生长发育，株高显著性提高。因此，本发明提供了一种对植物具有强促生功能的复合微生物菌剂。

附图说明

图1促生复合微生物菌剂液体制剂1处理后油菜叶片spad值的变化。

图2促生复合微生物菌剂液体制剂1处理后油菜叶片cat活性的变化。

图3促生复合微生物菌剂液体制剂1处理后油菜叶片pod活性的变化。

图4促生复合微生物菌剂液体制剂1处理后油菜叶片sod活性的变化。

图5促生复合微生物菌剂液体制剂1处理后对油菜生长的影响。

图6促生复合微生物菌剂液体制剂2处理后上海青叶片spad值的变化

图7促生复合微生物菌剂液体制剂2处理后上海青叶片cat活性的变化。

图8促生复合微生物菌剂液体制剂2处理后上海青叶片pod活性的变化。

图9促生复合微生物菌剂液体制剂2处理后上海青叶片sod活性的变化。

图10促生复合微生物菌剂液体制剂2处理后对上海青生长的影响。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进一步说明。

菌种材料：

（1）贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis），已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.20900，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。在本发明中，所述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03是从植物中分离纯化后得到的内生细菌，所述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03的菌落特征及菌体形态为：在na平板上培养24h后形成菌落颜色为淡黄色，无光泽，呈圆形、无流动性，革兰氏染色阳性，有芽孢，无荚膜；菌落直径4-5mm。所述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03的生理生化特征：接触酶反应呈阴性，v．p测定呈阴性，mr测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阴性，硝酸盐还原呈阳性，淀粉水解呈阳性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阴性，产h2s试验试验阳性。所述贝莱斯芽孢杆菌的16srdna序列与genbank数据库中的序列比对，结果表明:yzs-m03与bacillusvelezensis同处于一个分支上，其16srdna序列与bacillusvelezensis（mt509947.1）的相似度达99.86%。结合菌落形态、生理生化特征和16srdna序列分析，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）。

（2）克什米尔小陌生菌bqb-b04，其分类命名为克什米尔小陌生菌（advenellakashmirensis），已于2021年2月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.21796，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。在本发明中，所述克什米尔小陌生菌bqb-b04是从植物中分离纯化后得到的内生细菌，所述克什米尔小陌生菌bqb-b04的菌落特征及菌体形态为：在na平板上培养24h后形成菌落颜色为黄白色，无光泽，呈圆形、表面微凸起、不透明、边缘整齐，革兰氏染色阳性，无芽孢，无荚膜；菌落直径2-3mm。

所述内生解磷解钾固氮克什米尔小陌生菌bqb-b04的生理生化特征：接触酶反应呈阴性，v．p测定呈阴性，mr测定呈阳性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原呈阳性，淀粉水解呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阳性，产h2s试验试验阳性。所述内生解磷解钾固氮克什米尔小陌生菌的16srdna序列与genbank数据库中的序列比对，结果表明:bqb-b04与advenellakashmirensis同处于一个分支上，其16srdna序列与advenellakashmirensis（ku043380.1）的相似度达98.52%。结合菌落形态，生理生化特征和16srdna序列分析，鉴定为克什米尔小陌生菌（advenellakashmirensis）。

（3）高地芽孢杆菌zlb-c01，其分类命名为高地芽孢杆菌（bacillusaltitudinis），已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.20898，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。在本发明中，所述高地芽孢杆菌zlb-c01是从植物中分离纯化后得到的内生细菌，所述促生高地芽孢杆菌zlb-c01的菌落特征及菌体形态为：在na平板上培养24h后形成菌落颜色为乳白色，无光泽，呈圆形、无流动性，革兰氏染色阳性，有芽孢，无荚膜；菌落直径4-5mm。所述促生高地芽孢杆菌zlb-c01的生理生化特征：接触酶反应呈阴性，v．p测定呈阳性，mr测定呈阳性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阴性，硝酸盐还原呈阳性，淀粉水解呈阴性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阴性，产h2s试验试验阳性。所述促生高地芽孢杆菌的16srdna序列与genbank数据库中的序列比对，结果表明:zlb-c01与bacillusaltitudinis同处于一个分支上，其16srdna序列与bacillusaltitudinis（mw474842.1）的相似度达99.86%。结合菌落形态，生理生化特征和16srdna序列分析，鉴定为高地芽孢杆菌（bacillusaltitudinis）。

本发明提供了一种促生复合微生物菌剂，包括贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01；所述促生复合微生物菌剂中贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03，克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的质量比为（3~5）:（3~6）:（3~8）；所述促生复合微生物菌剂中的总活菌浓度为（5~8）×10⁸cfu/ml或（2~3）×10⁹cfu/g。

在本发明中，所述促生复合微生物菌剂优选为液体制剂或固体制剂。当所述促生复合微生物菌剂为固体制剂时，所述促生复合微生物菌剂中包括载体。在本发明中，所述载体为麸皮。所述麸皮与贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01总的质量比优选为100:（2~5）。在本发明中，当所述促生复合微生物菌剂为固体制剂时，通过分别将所述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01发酵液通过冷冻干燥或喷雾干燥制备成固体菌粉后，按比例混合。在本发明中，当所述促生复合微生物菌剂为液体制剂时，通过将发酵后的贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的发酵液按照质量比为（3~5）:（3~6）:（3~8）的比例混合获得。

在本发明中，所述固体菌粉的制备方法优选为包括以下步骤：将所述菌种活化后进行连续两级种子液培养，接入发酵培养基发酵、浓缩获得浓缩菌液，将所述克什米尔小陌生菌bqb-b04的浓缩菌液与保护剂（脱脂奶粉）混合后经冷冻干燥获得所述固体菌粉；将所述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03和高地芽孢杆菌zlb-c01的发酵液与轻质碳酸钙混合后经喷雾干燥获得所述固体菌粉。

在本发明中，将菌种接于nb培养基中培养15~25h获得一级种子液；所述培养温度优选为25~35℃，所述培养的转速优选为150~350r·min^-1。

本发明在获得一级种子液后，将所述一级种子液转接于nb液体培养基中培养10~20h获得二级种子液。本发明中，所述一级种子液转接的接种量优选为0.5%~1.0%（v/v），所述培养优选在发酵罐中进行，所述培养的过程中通入无菌空气，所述发酵罐通气手动调转速和空气流量来调节do（do40%），所述的培养温度为25℃~35℃，所述培养的转速为200~350r·min^-1，所述培养的时间优选为10~20h。在本发明中，所述二级种子液的od600优选为0.6~1.0。

本发明在获得所述二级种子液后，将所述二级种子液接入发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液。在本发明中，所述二级种子液的接种量0.5%~1.0%（v/v），所述发酵培养过程中的罐压维持在0.05mpa；所述培养的过程中通入无菌空气，所述发酵罐通气手动调转速和空气流量来调节do（do40%），所述的培养温度为25℃~35℃，所述培养的转速为200~350r·min^-1，所述培养的时间优选为15~35h。在本发明中，所述二级种子液的od600优选为0.8~1.5。

本发明在获得发酵菌液后，将所述发酵菌液浓缩获得浓缩菌液。在本发明中，所述浓缩菌液的浓缩倍数为5~20倍；所述浓缩的方法，克什米尔小陌生菌bqb-b04的发酵菌液通过高速离心的方法获得浓缩菌液；所述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03和高地芽孢杆菌zlb-c01的发酵菌液通过陶瓷膜过滤的方法获得浓缩菌液。本发明对所述浓缩设备的具体参数设置没有特殊限定，采用常规的参数设置实现上述倍数的浓缩即可。

本发明在获得所述发酵菌液后，将所述克什米尔小陌生菌bqb-b04的发酵菌液通过高速离心机离心获得浓缩菌液，所述浓缩菌液加入保护剂（脱脂奶粉）后通过真空冷冻干燥获得固体菌粉，所述浓缩液与保护剂（脱脂奶粉）的质量比为10:1，所述真空冷冻干燥过程控制条件为3~5h冷至-40℃维持3~5h后抽真空，通热水控温-20℃，升华，去除水份。将所述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03和高地芽孢杆菌zlb-c01的发酵菌液通过陶瓷膜过滤获得浓缩菌液，所述浓缩菌液加入轻质碳酸钙后通过喷雾干燥获得固体菌粉，所述浓缩液与轻质碳酸钙的质量比为100:2~5，所述喷雾干燥过程控制指标为物料进口温度150~200℃，出口80~85℃，物料在塔内干燥时间15~30s。

实施例1制备促生复合微生物菌剂

（1）克什米尔小陌生菌bqb-b04菌液、固体菌粉的制备：

克什米尔小陌生菌bqb-b04一级种子液制备

活化克什米尔小陌生菌bqb-b04菌株，挑取单菌落，接种于150mlnb培养基中（121℃下，灭菌30min），28℃，180r·min^-1条件下振荡培养20h，得到一级种子液。

克什米尔小陌生菌bqb-b04二级种子液制备

将一级种子液接入无菌的种子罐中，接种量为0.5%~1.0%（v/v）；培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节do（do40%），培养温度为25℃~35℃，转速为200~350r·min^-1，罐压0.05mpa；培养的时间10~15h。二级种子液的od600值在0.6~0.8，此时菌种活力最强。

克什米尔小陌生菌bqb-b04发酵液制备：

将克什米尔小陌生菌bqb-b04的二级种子液，按照接种量为0.5%~1.0%（v/v）接入无菌发酵罐中，发酵培养基的组成如下（每升）：酵母抽提浸膏25-50克，麦芽糖浆12-20克。培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节do（do40%），培养温度为25℃~35℃，转速为200~350r·min^-1，罐压0.05mpa；培养的时间15~20h，ph回升至7.5~8.0，od600值0.8~1.0，终止发酵，得到发酵成熟菌液。

克什米尔小陌生菌bqb-b04菌粉制备：

将上述所得的发酵成熟菌液经过高速离心机离心后，加入保护剂（脱脂奶粉）混合均匀，浓缩菌液与保护剂（脱脂奶粉）的质量比为10:1，得到固液混合物，真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的条件为：3~5h冷至-40℃维持3~5h后抽真空，通热水控温-20℃，升华，去除水份。得到克什米尔小陌生菌bqb-b04固体菌粉，菌粉含水量小于5%（w/w），活菌数为2~5×10¹¹cfu/g。

（2）贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03菌液、固体菌粉的制备：

活化贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03菌株，挑取单菌落，接种于150mlnb培养基中（121℃,下，灭菌30min），28℃，180r·min^-1条件下振荡培养20h，得到一级种子液。

贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03二级种子液制备：

将一级种子液接入无菌的种子罐中，接种量为0.5%~1.0%（v/v）；培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节do（do40%），培养温度为30℃~35℃，转速为200~350r·min^-1，罐压0.05mpa；培养的时间15~20h。二级种子液的od600值在0.6~0.8，此时菌种活力最强。

贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03发酵液制备：

将贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03的二级种子液，按照接种量为0.5%~1.0%（v/v）接入无菌发酵罐中，发酵培养基的组成如下（每升）：酵母抽提浸膏：10-20克，麦芽糖浆：25-35克，氯化镁：0.2-0.5克，氯化钙：0.1-0.4克，氯化锰：0.1-0.4克，磷酸氢二钾：1.0-2.5克。培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节do（do40%），培养温度为30℃~35℃，转速为200~350r·min^-1，罐压0.05mpa；培养的时间30~35h，ph回升至7.5~8.0，od600值1.2~1.5，下罐时间以取样镜检芽孢在90%以上成熟时，终止发酵，得到发酵成熟菌液。

贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03菌粉制备：

将上述所得的发酵成熟菌液经过陶瓷膜过滤后，加入轻质碳酸钙混合均匀，所述浓缩菌液与轻质碳酸钙的质量比为100:2~5，得到固液混合物，喷雾干燥，喷雾干燥的条件为：物料进口温度150~200℃，出口80~85℃，物料在塔内干燥时间15~30s。得到贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03固体菌粉，菌粉含水量小于5%（w/w），活菌数为2~5×10¹¹cfu/g。

所述高地芽孢杆菌zlb-c01菌液、固体菌粉的制备同上。

将上述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的固体菌粉按照质量比为1:1:1混合均匀为固体混合菌粉，再将所述麸皮与上述固体混合菌粉以100:2的质量比混合后获得促生复合微生物菌剂的固体制剂1，总活菌浓度为2×10⁹cfu/g。

将上述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的固体菌粉按照质量比为5:6:8混合均匀为固体混合菌粉，再将所述麸皮与上述固体混合菌粉以100:5的质量比混合后获得促生复合微生物菌剂的固体制剂2，总活菌浓度为5×10⁹cfu/g。

将上述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的固体菌粉按照质量比为4:5:6混合均匀为固体混合菌粉，再将所述麸皮与上述固体混合菌粉以100:3的质量比混合后获得促生复合微生物菌剂的固体制剂3，总活菌浓度为3×10⁹cfu/g。

将上述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的发酵成熟菌液按照质量比为1:1:1的比例混合获得促生复合微生物菌剂液体制剂1，总活菌浓度为5×10⁸cfu/ml。

将上述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的发酵成熟菌液按照质量比为5:6:8的比例混合获得促生复合微生物菌剂液体制剂2，总活菌浓度为8×10⁸cfu/ml。

将上述贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的发酵成熟菌液按照质量比为4:5:6的比例混合获得促生复合微生物菌剂液体制剂3，总活菌浓度为6×10⁸cfu/ml。

实施例2促生复合微生物菌剂液体制剂1对油菜叶片作用效果

将实施例1制备的促生复合微生物菌剂液体制剂1及贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种发酵成熟菌液，分别用无菌水配置成活菌含量为1×10⁸cfu/ml的菌悬液，通过灌根接种油菜幼苗（接种量为20ml/株），每处理10株，3次重复，以清水为对照。接种处理15d后进行叶绿素含量测定，并采集植物叶片各10片，并充分混合作为一个混合样，用于过氧化氢酶（cat）、过氧化物酶（pod）和超氧化物歧化酶(sod)等指标的测定。

采用spad-502叶绿素快速测定仪（minolta，japan），选取10片植物叶片，分别在叶基、叶中、叶尖处测得spad值，求出每片叶的平均值，进行3个重复。用spad值表示叶片叶绿素相对值。

采用紫外分光光度法测定植物叶片过氧化氢酶（cat）活性，参照愈创木酚法测定植物叶片过氧化物酶（pod）活性活性，参照氮蓝四唑(nbt)光还原法测定植物叶片超氧化物歧化酶(sod)活性。

促生复合微生物菌剂对油菜叶片叶绿素含量的影响

促生复合微生物菌剂注射接种处理15d时，油菜叶片spad值均高于清水对照处理及施用贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种成熟发酵菌液处理，施用促生复合微生物菌剂的油菜叶片spad值与清水对照相比差异显著。内生细菌处理后的油菜叶片叶绿素含量增加，因叶绿素在光能吸收、传递和转换中起着重要的作用，叶绿素含量的增加能够提高植物的光合作用速率，从而促进其生长，见图1。

促生复合微生物菌剂对油菜叶片过氧化氢酶（cat）活性的影响

由图2可以看出，促生复合微生物菌剂处理对油菜叶片的过氧化氢酶(cat)活性产生了显著的影响，促生复合微生物菌剂处理后的油菜叶片过氧化氢酶活性均高于清水对照处理及贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种发酵成熟菌液处理，与对照处理相比差异显著。经复合微生物菌剂及内生细菌处理后，油菜体内的cat活性能迅速上升并维持在较高的水平。过氧化氢酶（cat）是植物体内重要的酶促防御系统，可以清除h2o2，是植物体内重要的抗氧化酶。

促生复合微生物菌剂对油菜叶片过氧化物酶(pod)活性的影响

促生复合微生物菌剂接种处理15d时，油菜叶片过氧化物酶(pod)活性均高于清水对照处理及施用贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种成熟发酵菌液处理，施用促生复合微生物菌剂的油菜叶片过氧化物酶(pod)活性与清水对照相比差异显著。表明促生复合微生物菌剂可以提高植物叶片过氧化物酶（pod）活性，从而促进植物生长，见图3。

促生复合微生物菌剂对油菜叶片超氧化物歧化酶(sod)活性的影响

促生复合微生物菌剂注射接种处理15d时，油菜叶片超氧化物歧化酶(sod)活性均高于清水对照处理及施用贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种成熟发酵菌液处理，施用促生复合微生物菌剂的油菜叶片超氧化物歧化酶(sod)活性与清水对照相比差异显著。表明施用促生复合微生物菌剂可以提高植物叶片的超氧化物歧化酶（sod）活性，从而促进植物生长，见图4。

促生复合微生物菌剂对油菜株高生长的影响

促生微生物菌剂处理灌根接种处理油菜幼苗后，可以明显促进油菜幼苗株高的生长，与清水对照处理及施用贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种固体菌粉处理，差异显著（图5），表明了接种促生微生物菌剂对植物生长发育促进作用。

实施例3促生复合微生物菌剂液体制剂2对上海青幼苗的作用效果

将实施例1制备的促生复合微生物菌剂液体制剂2及贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种发酵成熟菌液，分别用无菌水配置成活菌含量为1×10⁸cfu/ml的菌悬液，通过灌根接种上海青幼苗（接种量为20ml/株），每处理10株，3次重复，以清水为对照。接种处理15d进行叶绿素含量测定，并采集上海青叶片各10片，并充分混合作为一个混合样，用于过氧化氢酶（cat）、过氧化物酶（pod）和超氧化物歧化酶(sod)等指标的测定。

采用spad-502叶绿素快速测定仪（minolta，japan），选取10片上海青叶片，分别在叶基、叶中、叶尖处测得spad值，求出每片叶的平均值，进行3个重复。用spad值表示叶片叶绿素相对值。

采用紫外分光光度法测定植物叶片过氧化氢酶（cat）活性，参照愈创木酚法测定植物叶片过氧化物酶（pod）活性活性，参照氮蓝四唑(nbt)光还原法测定植物叶片超氧化物歧化酶(sod)活性。

促生复合微生物菌剂对上海青叶片叶绿素含量的影响

促生复合微生物菌剂注射接种处理15d时，上海青叶片spad值均高于清水对照处理及施用贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种成熟发酵液处理，施用促生复合微生物菌剂的上海青叶片spad值与清水对照相比差异显著。内生细菌处理后的上海青叶片叶绿素含量增加，因叶绿素在光能吸收、传递和转换中起着重要的作用，叶绿素含量的增加能够提高植物的光合作用速率，从而促进其生长，见图6。

促生复合微生物菌剂对上海青叶片过氧化氢酶（cat）活性的影响

由图7可以看出，内生细菌处理对上海青叶片的过氧化氢酶(cat)活性产生了显著的影响，促生复合微生物菌剂处理后的上海青叶片过氧化氢酶活性均高于清水对照处理及施用贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种成熟发酵液处理，与对照处理之间差异显著。经复合微生物菌剂及内生细菌处理后，上海青体内的cat活性能迅速上升并维持在较高的水平。过氧化氢酶（cat）是植物体内重要的酶促防御系统，可以清除h2o2，是植物体内重要的抗氧化酶。

促生复合微生物菌剂对上海青叶片过氧化物酶(pod)活性的影响

促生复合微生物菌剂接种处理15d时，上海青叶片过氧化物酶(pod)活性均高于清水对照处理及施用贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种成熟发酵液处理，施用促生复合微生物菌剂的上海青叶片过氧化物酶(pod)活性与清水对照相比差异显著。表明促生复合微生物菌剂可以提高植物叶片过氧化物酶（pod）活性，从而促进植物生长，见图8。

促生复合微生物菌剂对上海青叶片超氧化物歧化酶(sod)活性的影响

促生复合微生物菌剂注射接种处理15d时，上海青叶片超氧化物歧化酶(sod)活性均高于清水对照处理及施用贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种成熟发酵液处理，施用促生复合微生物菌剂的上海青叶片超氧化物歧化酶(sod)活性与清水对照相比差异显著。表明施用促生复合微生物菌剂可以提高植物叶片的超氧化物歧化酶（sod）活性，从而促进植物生长，见图9。

促生复合微生物菌剂对上海青株高生长的影响

促生微生物菌剂处理灌根接种处理上海青幼苗后，可以明显促进上海青幼苗株高的生长，与清水对照处理及施用贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种成熟发酵液处理，差异显著（图10），表明了接种促生微生物菌剂对植物生长发育促进作用。

实施例4促生复合微生物菌剂固体菌剂1对草莓生长的作用效果

将实施例1制备的促生复合微生物菌剂固体制剂1（活化后，用无菌水稀释至1×10⁸cfu/ml液体制剂备用）及贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种发酵成熟菌液，分别用无菌水配置成活菌含量为1×10⁸cfu/ml的菌悬液。选取温室大棚内移栽1个月左右的草莓幼苗，分别施用促生复合微生物菌剂固体制剂1及贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种发酵成熟菌液灌根接种草莓幼苗（接种量为20ml/株），每处理30株，3次重复，30天后再次灌根施用以上菌液（接种量为20ml/株）。以清水处理的草莓为对照，60天后调查结果。试验结果表明，与清水对照组相比，接种促生复合微生物菌剂固体制剂1及贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种发酵成熟菌液处理的草莓长势强壮，叶片大而浓绿；花蕾、开花数量处理与对照偏少，新枝微多；坐果数明显高于对照，且坐果早而大。其中施用复合微生物菌剂固体菌剂1的处理与清水对照处理相比，坐果数增幅为20.19%，草莓糖份提高了0.8，增幅为6.96%。

表1复合微生物菌剂对草莓生长的影响

实施例5促生复合微生物菌剂液体菌剂3对黄瓜生长的作用效果

选取温室大棚内长势均匀，四叶一心的黄瓜秧苗各20m²，分别作为试验组与对照组，各组内黄瓜秧苗株数相同。将实施例1制备的促生复合微生物菌剂液体制剂3及贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种发酵成熟菌液，分别用无菌水配置成活菌含量为1×10⁸cfu/ml的菌悬液，稀释30倍后喷施叶面，15天后灌根施用接种黄瓜秧苗（接种量为20ml/株），以清水处理作为对照。待开始收获时，连续15天统计黄瓜产量、发病率等。试验结果表明，与对清水照组相比，复合微生物菌剂3及贝莱斯芽孢杆菌yzs-m03、克什米尔小陌生菌bqb-b04和高地芽孢杆菌zlb-c01的单菌种发酵成熟菌液处理的黄瓜长势强壮，叶色浓绿；黄瓜瓜形均匀，产量明显高于对照。其中复合微生物菌剂处理与清水对照处理相比，产量增幅16.09%；降低发病率。

表2复合微生物菌剂对黄瓜生长的影响

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。