NKG2D及其配体在筛选用于防治缺血性脑损伤疾病的药物中的用途

nkg2d及其配体在筛选用于防治缺血性脑损伤疾病的药物中的用途
技术领域
1.本发明涉及医药领域，具体涉及到nkg2d及其配体在筛选用于防治缺血性脑损伤疾病的药物中的用途。


背景技术：

2.缺血性脑卒中为脑供血不足引起脑组织坏死导致神经功能特别是运动、感觉功能障碍，是新生儿和成年人常见的脑血管疾病。目前，缺血性脑卒中急性期主要采用溶栓治疗，但一般溶栓治疗时间窗狭窄，致使95％以上的患者无法获得有效的治疗。已有研究表明，缺血性脑卒中的发病机制十分复杂，包括钠泵失活、谷氨酸兴奋性毒性、氧化应激、神经炎症反应等。其中，神经炎症反应在缺血性脑卒中的病理过程中发挥关键作用，而小胶质细胞在神经炎症反应过程中扮演重要角色。小胶质细胞是中枢神经系统中固有的巨噬细胞，也是防御中枢神经系统损伤的第一道防线。脑缺血发生后，小胶质细胞能在几分钟内被激活，然后伴随着血源性免疫细胞(如嗜中性粒细胞，巨噬细胞，淋巴细胞等)的浸润，引发后续的炎症级联反应，产生大量的促炎因子(tnf
‑
α、il
‑
1β、il
‑
6等)，介导炎症反应，抑制脑组织损伤恢复，加剧脑损伤。研究表明，toll样受体4(tlr4)介导免疫炎症受体在脑缺血后炎性损伤中发挥作用。但近十年来的基于tlr4受体的抗缺血性脑损伤策略均为取得突破。
3.凝集素样的2型跨膜蛋白(nkg2d及其配体)是表达于nk细胞等多种免疫细胞表面的活性受体。nkg2d及其配体与其配体结合后，上调下游效应分子dap10表达，进而介导免疫炎症反应。但由于nkg2d及其配体受体在不同组织器官及细胞中的表达差异性，以及活化后介导免疫炎症反应功能差异性，这些问题制约了其作为缺血性脑损伤防治药物研发潜在靶标的转化应用。因此，如何筛选适合用于防治缺血性脑损伤药物仍然是一个亟待解决的临床问题，且至今未有关于nkg2d及其配体及其配体在体内外缺血性脑损伤免疫炎症反应中的作用以及在筛选用于防治缺血性脑损伤疾病的药物中的用途的报道。


技术实现要素：

4.针对上述不足或缺陷，本发明的目的是提供nkg2d及其配体在筛选用于防治缺血性脑损伤药物中的用途，可有效解决现有技术中筛选适合用于防治缺血性脑损伤药物困难的问题。
5.为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：
6.本发明提供nkg2d及其配体在筛选用于防治缺血性脑损伤疾病的药物中的用途。
7.进一步地，nkg2d及其配体在筛选用于防治缺血性脑损伤药物中的用途，通过将nkg2d及其配体作为药物靶标，来筛选使nkg2d及其配体的mrna水平被抑制的药物，得到适用于防治缺血性脑损伤疾病的药物。
8.进一步地，缺血性脑损伤疾病为缺血性脑卒中。
9.进一步地，配体为h60、mult1和rae
‑
1。
10.进一步地，nkg2d及其配体在筛选用于防治缺血性脑损伤药物中的用途，具体筛选过程为：以nkg2d及其配体作为药物靶标，通过配基的生物学干预系统和药物组合物来筛选。
11.进一步地，配基的生物学干预系统是指通过nkg2d及其配体中的一种或三种配基的rna干扰技术而成的产品。
12.进一步地，药物组合物是指在一种以上物质或组份混和而成的产品基础上，进一步加入一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂制成药学上可接受的药物制剂。
13.本发明具有以下优点：
14.1、本发明提供了nkg2d及其配体在筛选用于防治缺血性脑损伤疾病的药物中的用途，阐明了nkg2d及其配体及其配体(h60、mult1、rae
‑
1)在体内外缺血性脑损伤免疫炎症反应中的作用；具体为：脑缺血可诱导nkg2d受体信号通路活化，加重缺血后炎症性脑损伤，继发神经炎症反应与神经元损伤；
15.2、本发明提供了nkg2d及其配体在筛选用于防治缺血性脑损伤药物中的用途，以nkg2d及其配体作为药物靶标，来筛选使nkg2d及其配体的mrna水平被抑制的药物，具体通过筛选配基的生物学干预系统和药物组合物，从而筛选得到适合用于防治缺血性脑损伤的新型治疗手段或药物，可有效解决现有技术中筛选适合用于防治缺血性脑损伤疾病的药物困难的问题。
附图说明
16.图1为本发明实验例2中中假手术组和脑缺血组的c57小鼠缺血性脑损伤图；
17.图2为本发明实验例2中假手术组和脑缺血组的海马ca1区存活神经元数量结果图；
18.图3为本发明实验例2中假手术组和脑缺血组中nkg2d的mrna水平结果图；
19.图4为本发明实验例2中假手术组和脑缺血组中mult1的mrna水平结果图；
20.图5为本发明实验例2中假手术组和脑缺血组中h60的mrna水平结果图；
21.图6为本发明实验例2中假手术组和脑缺血组中rae
‑
1的mrna水平结果图；
22.图7为本发明实验例2中假手术组和脑缺血组中tnf
‑
α的mrna水平结果图；
23.图8为本发明实验例2中假手术组和脑缺血组中il
‑
6的mrna水平结果图。
具体实施方式
24.以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。
25.实验例1
26.本实验例1提供nkg2d及其配体在体外培养的氧糖剥夺神经元细胞/小胶质细胞炎症反应中的作用的相关实验，具体包括以下过程：
27.细胞选择及培养：小鼠海马神经元细胞系(ht22细胞)，小鼠小胶质细胞系(bv2细胞)，常规培养于含10％牛血清的dmem完全培养基中。
28.氧糖剥夺(ogd)导致神经元细胞损伤模型建立：ht22接种于6孔板，培养24小时后，更换无糖培养基、95％n2和5％co2氧糖剥夺条件下培养19小时，复氧复糖24小时后收集ht22培养基上清(ogd组)，正常条件下ht22培养基上清作为正常组。采用cck
‑
8方法检测氧糖剥夺对神经元细胞的损伤达到60％存活率。
29.氧糖剥夺导致小胶质细胞炎症反应的检测：bv2接种于6孔板，培养24小时后分别更换上述ht22神经元细胞的ogd培养基或正常培养基。继续培养24小时后，收集上清，elisa法检测培养基中促炎因子il
‑
6的含量；收集bv2细胞，参照trizol试剂和说明书提取细胞rna，逆转录为cdna后用于qpcr测定nkg2d及其配体及其配体(h60、mult1、rae
‑
1)的mrna水平。
30.试验结果如表1所示，结果表明，氧糖剥夺的体外缺血缺氧条件，可明显损伤ht22神经元细胞，其培养基上清可明显上调小胶质细胞bv2中nkg2d及其配体受体及其配体(h60、mult1、rae
‑
1)的表达，同时增加il
‑
6含量。
31.表1.nkg2d及其配体在ogd刺激ht22/bv2细胞炎症反应中的作用(均数
±
标准差，n＝6)
[0032][0033]
与正常对照组比较，*p＜0.05；**p＜0.01
[0034]
实验例2
[0035]
本实验例2提供nkg2d及其配体在双侧颈总动脉结扎法建立2vo(大鼠双侧颈总动脉持久性结扎)所致小鼠脑缺血模型神经炎症反应中的作用相关的实验，具体包括以下过程：
[0036]
动物选择及行为学检测：spf级雄性c57bl/6小鼠，6
‑
8周，适应性喂养后，将正常动物纳入后续实验。
[0037]
2vo小鼠模型：c57bl/6小鼠经4％水合氯醛腹腔麻醉后仰卧位固定，暴露双侧颈总动，动脉夹夹闭20分钟后松开再灌注。假手术组仅暴露双侧颈总动脉，不进行夹闭。
[0038]
脑组织标本收集及nissl染色：2vo脑缺血后再灌注72小时，小鼠麻醉下预冷生理盐水、4％多聚甲醛依序心脏灌流，取出大脑于4％多聚甲醛中固定、脱水，oct包埋，20μm冰冻切片，0.5％焦油紫水溶液染色10分钟，镜下分色晾干后，封片。用image
‑
pro plus 6.0软件在显微镜下(
×
400)盲法计数海马ca1区存活神经元总数。
[0039]
脑组织标本收集及qpcr检测：2vo脑缺血后再灌注72小时，小鼠麻醉下预冷生理盐水心脏灌流，取出大脑经液氮急冻，trizol试剂提取组织rna，逆转录为cdna后用于qpcr检测nkg2d及其配体及其配体(h60、mult1、rae
‑
1)、以及促炎因子(tnfa、il
‑
6)的mrna水平。
[0040]
试验结果如图1
‑
8所示，结果表明，2vo脑缺血能够非常明显减少小鼠大脑ca1区锥体神经元细胞数，上调nkg2d及其配体及其配体(h60、mult1、rae
‑
1)、以及促炎因子(tnfa、il
‑
6)的mrna水平；其中，图1中标注有1和2为假手术组测试结果，图1中标注有3和4为脑缺
血组测试结果。
[0041]
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。