一种罗汉果蛋白酶的分离纯化方法

1.本发明涉及罗汉果提取技术领域，尤其是一种罗汉果蛋白酶的分离纯化方法。


背景技术：

2.罗汉果属植物的成熟果实，为葫芦科植物罗汉果的果实，秋季果实由嫩绿色变深绿色时采收。常生于山坡林下及河边湿地、灌木丛中，分布于江西、湖南、广东、广西、贵州等地。其营养价值很高，含丰富的维生素c及糖苷、果糖、葡萄糖、蛋白质和脂类等。
3.罗汉果为卫生部首批公布的药食两用名贵中药材，其所含罗汉果甜甙比蔗糖甜300倍，不产生热量，是饮料、糖果行业的名贵原料，是蔗糖的最佳替代品。罗汉果营养价值高，有清热、润肺、止咳、化痰、益肝、健脾和提神生津等功效；现代医学证明，罗汉果对支气管炎、高血压、咽喉炎、支气管哮喘、百日咳、胃热、便秘、急性扁桃体炎等疾病有显著疗效，还能起到防治冠心病、血管硬化、肥胖症的作用。
4.罗汉果除了被广泛用于医药外，还主要用于生产罗汉果甜苷，罗汉果甜苷是一种低热型甜味剂，是罗汉果中主要的有效成分，由于近年来罗汉果甜苷广泛应用于饮料和食品产品，从而使罗汉果行业得到了快速发展，而罗汉果甜苷中的主要成分是罗汉果甜苷v。在实际生产中也是用罗汉果甜苷v含量来衡量罗汉果甜苷的质量。另外，新鲜罗汉果中含有对酪蛋白高水解活性的蛋白酶。相同条件下， 罗汉果蛋白酶的活性是木瓜蛋白酶活性的 10 倍以上，所以罗汉果蛋白酶具有较高的研究开发价值。
5.至今已报道的罗汉果蛋白酶分离方法有硫酸铵盐析法和超滤膜分离法等。在实际应用这些方法时，由于受到罗汉果中甜苷的沾粘性质的影响，使分离罗汉果蛋白酶的过程变得困难，且分离得到的蛋白酶难以完全除去罗汉果甜苷，而使得到蛋白酶中含有甜味，不利于该酶在食品中的应用。
6.因此，除去罗汉果汁中的罗汉果甜苷，将罗汉果蛋白酶和罗汉果皂苷分离，对罗汉果蛋白酶的开发具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明公开了一种罗汉果蛋白酶的分离纯化方法，能很好的将罗汉果汁中的罗汉果蛋白酶与罗汉果甜苷v分离，且能较好的保留 罗汉果蛋白酶的活性。
8.为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种罗汉果蛋白酶的分离纯化方法，包括以下步骤：s1.获取新鲜罗汉果的鲜果汁，经d101大孔树脂柱分离，收集流出的无甜味的分离酶汁，待酶汁完全流出后，用水冲洗d101大孔树脂柱，得冲洗液，合并冲洗液和分离酶汁，得粗酶汁；s2.采用冷冻干燥法或硫酸铵分级沉淀法纯化，得罗汉果蛋白酶或罗汉果蛋白酶液。
9.进一步的，新鲜罗汉果的鲜果汁的获取方法选自以下方法中的一种：
（1）新鲜罗汉果榨汁，或通过离心脱水机离心，得到一级果汁，再使用水多次浸泡果渣，得浸泡液，合并浸泡液和一级果汁，得鲜果汁；（2）新鲜罗汉果捣碎或压烂，用水多次浸泡，得浸泡液，浸泡液过滤或离心，弃去果渣，得鲜果汁。
10.进一步的，所述步骤s2中，所述冷冻干燥法具体为：温度≤
‑
50℃，真空度≤10pa。
11.进一步的，所述步骤s2中，所述硫酸铵分级沉淀法具体为：将粗酶汁加入固体硫酸铵使其饱和度为50~100%，静置，冷冻离心，沉淀用0.03~0.06mol/l、ph为6.5~7.5、含有0.5~1.5mmol/l edta的tris
‑
hcl缓冲液溶解，再用溶解沉淀后的tris
‑
hcl缓冲液透析至用 1 %的 bacl
2 溶液检测不到沉淀，然后冷冻离心，取上清液，得罗汉果蛋白酶液。
12.更进一步的，所述透析具体为：将溶解沉淀后的tris
‑
hcl缓冲液装入透析袋于纯水中4℃透析，多次更换透析液，至用1 %的bacl2溶液检测不到沉淀。
13.更进一步的，所述tris
‑
hcl缓冲液为0.05mol/l，ph为7.0，含有1mmol/l edta。
14.更进一步的，所述步骤s2中，粗酶汁加入固体硫酸铵，调节饱和度至65%。
15.进一步的，所述步骤s1中，经d101大孔树脂柱分离出的分离酶汁若有甜味，则倒回d101大孔树脂柱再次分离，或用新的d101大孔树脂柱再次分离。
16.以上所述的罗汉果蛋白酶的分离纯化方法，经d101大孔树脂处理后，能很好的将罗汉果汁中的罗汉果蛋白酶与罗汉果甜苷v分离，对分离出的罗汉果蛋白酶具有一定的纯化效果，但仍有少部分罗汉果甜苷v残留于罗汉果蛋白酶溶液中。进一步的，本发明使用冷冻干燥法和硫酸铵分级沉淀法进一步纯化罗汉果蛋白酶，其中：使用冷冻干燥法，蛋白回收率为87.613%，酶活回收率为82.587%，纯化倍数为0.944；使用硫酸铵分级沉淀法；罗汉果蛋白酶回收率最大可达到87.681%，酶活回收率最大可达到93.951%，纯化倍数可达到1.071。
17.通过分离纯化罗汉果蛋白酶，可更好发挥罗汉果蛋白酶水解活性高、结构特别、稳定性好的优点，拓宽罗汉果的开发应用领域，提升罗汉果的开发利用价值。
附图说明
18.图1是蛋白质含量的标准曲线图。
19.图2罗汉果甜苷v标准品色谱图。
20.图3罗汉果样品色谱图。
21.图4是罗汉果甜苷v标准曲线。
22.图5是使用不同饱和度硫酸铵的蛋白回收率和酶活回收率的示意图。
具体实施方式
23.以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
24.实施例1s1.将新鲜罗汉果洗净、称重、榨汁，分离果渣和一级果汁，使用超纯水多次少量浸泡果渣（5次，10g罗汉果:50ml水），弃去果渣，取浸泡液，合并一级果汁和浸泡液，得新鲜罗汉果的鲜果汁，经d101大孔树脂柱分离，不施加压力，收集流出的无甜味的分离酶汁，若流出分离酶汁有甜味，则倒回大孔树脂柱内，再次分离纯化。待分离酶汁完全流出后，使用少
量超纯水冲洗d101大孔树脂，在确保流出冲洗液无甜味的情况下，将吸附在d101大孔树脂上的罗汉果蛋白酶充分洗下，收集的冲洗液采用考马斯亮蓝g250法检测蛋白质含量，当其结果为零时，停止洗柱。合并冲洗液和分离酶汁，得粗酶汁。
25.s2.采用冷冻干燥法，温度
‑
50℃，真空度10pa，得罗汉果蛋白酶。
26.实施例2s1.将新鲜罗汉果洗净、称重、榨汁，分离果渣和一级果汁，使用超纯水多次少量浸泡果渣（5次，10g罗汉果:50ml水），弃去果渣，取浸泡液，合并一级果汁和浸泡液，新鲜罗汉果的鲜果汁，经d101大孔树脂柱分离，不施加压力，收集流出的无甜味的分离酶汁，若流出分离酶汁有甜味，则倒回大孔树脂柱内，再次分离纯化。待分离酶汁完全流出后，使用少量超纯水冲洗d101大孔树脂，在确保流出冲洗液无甜味的情况下，将吸附在d101大孔树脂上的罗汉果蛋白酶充分洗下，收集的冲洗液采用考马斯亮蓝g250法检测蛋白质含量，当其结果为负值时，停止洗柱。合并冲洗液和分离酶汁，得粗酶汁。
27.s2.采用硫酸铵分级沉淀法纯化罗汉果蛋白酶，得罗汉果蛋白酶液；具体为：取200ml粗酶汁稀释至700ml，分成 7 等份，分别加入固体硫酸铵使其饱和度分别达到 0 %、20 %、35 %、50 %、65 %、80 %、100 %，静置，然后冷冻离心（4 ℃，8 000 r/min）15 min，分别将所得沉淀用0.05mol/ltris
‑
hcl（ph= 7）缓冲液（含 1 mmol/l edta）溶解，再将上述缓冲液透析过夜至用 1 %的 bacl
2 溶液检测不到沉淀，然后冷冻离心（4 ℃，8000 r/min）15 min，取其上清液，并以硫酸铵饱和度为 0 的果汁的蛋白质浓度和酶活力为 100%分别测定计算各上清液的蛋白质和酶活性的回收率。
28.试验验证实施例一、大孔树脂分离纯化罗汉果蛋白酶的试验效果验证1、罗汉果蛋白酶的蛋白质含量及活性测定1.1 考马斯亮蓝g250法测定果汁分离纯化前后蛋白质含量采用考马斯亮蓝g250法检测蛋白质含量（参考祝连彩,唐士金,周丽.考马斯亮蓝g250法测定蛋白质含量的教学实践及方法学探讨.教育教学论坛,2020.23），将收集的酶汁与新鲜罗汉果的鲜果汁同时测定蛋白质含量与酶活性，并计算其回收率。
29.图1为蛋白质含量标准曲线，线性回归方程为：y=0.0148x+0.6953（r2=0.9933），在反应体系蛋白质浓度0.05mg/ml~0.5mg/ml范围内，由图1可见吸光度与蛋白质含量具有良好的线性关系。
30.采用上述标准曲线检测蛋白质含量，具体结果见表1：表1 d101大孔树脂分离纯化前后蛋白质含量测定结果
表1为经d101大孔树脂分离纯化前后蛋白质含量测定数据，结果表明经d101大孔树脂分离纯化后，蛋白质回收率高达85.676%，只有少部分蛋白质被大孔树脂吸附，蛋白质损失少。
31.1.2大孔树脂分离纯化罗汉果蛋白酶的活性测定罗汉果蛋白酶酶活力的测定方法见《工业生产中木瓜蛋白酶的活性检测方法比较》（方焕,生吉萍,吴显荣），以干酪素为底物。酶的活力单位定义：在规定条件下， 1 min 内酶水解酪蛋白释放出相当于 1 μg/ml 酪氨酸 在 275 nm 波长处的吸收度为 1 个活力单位。
32.表2为d101大孔树脂分离纯化前后酶活性测定数据，其中实验组为a，空白组为b，空白组是在与实验组相同时间段，相同环境下，相同的反应试剂及仪器，只改变三氯乙酸加入的顺序，使得蛋白酶变性失活，无法与酪蛋白反应生产出能在波长275nm有吸光度的生成物，从而排除一切除生成物外能在275nm有吸光度的干扰因素。测试结果显示：其酶活回收率达92.270%，纯化倍数为1.077，数据表明经d101大孔树脂分离纯化后的罗汉果蛋白酶仍保持着较高的酶活性，并得到纯化，d101大孔树脂具有良好的分离纯化效果。
33.表2 d101大孔树脂分离纯化前后酶活性测定结果1.3大孔树脂分离罗汉果甜苷v的试验效果研究。
34.1.3.1试验方法1.3.1.1罗汉果甜苷v纯化处理：使用95%乙醇冲洗步骤分离粗酶汁后的d101大孔树脂柱，将大孔树脂吸附的罗汉果甜苷充分洗下，利用hplc法测定标准品和洗脱液内罗汉果甜苷v含量。
35.1.3.1.2色谱条件：分析型hplc柱：agilentzorbaxsb
‑
c18柱；规格：4.6mm
×
150mm，5μm；流动相：甲醇
‑
水(体积比15∶85)；流速：1ml/min；进样体积：10μl；检测波长：203nm；柱温：室温；定量方法：外标法。
36.1.3.1.3线性关系考察：精密称取实验室自制罗汉果甜苷v标准品sgl20110.03mg放入10ml的容量瓶中，用流动相(15%的甲醇水溶液)溶解，定容到刻度，配成浓度为1.000mg/ml的标准样品，分别吸取一定量的标准样品，用流动相稀释，配成质量浓度为0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000mg/ml的对照溶液，分别进行hplc测定，考察线性关系及线性范围，以峰面积y(mv/min)纵坐标，对照溶液的质量浓度x(mg/ml)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。
37.1.3.1.4重现性试验：取一待测样品(p2
‑
2)进行hplc检测，重复6次。
38.1.3.1.5精密度试验：取浓度为0.500mg/ml的对照样品进行hplc检测，6次重复。
39.1.3.1.6待测样品罗汉果甜苷v含量的测试将预留的新鲜罗汉果汁和1.2.1.1中得到的待测样品进样分析，每个样品进样6次，取平均值，外标法定量。
40.1.3.2罗汉果甜苷v标准样品及待测样品的hplc色谱图由图2和图3可知，峰b为罗汉果甜苷v，其出峰时间为6.469min、6.391min。
41.1.3.3罗汉果甜苷v标准品标准曲线的绘制图4为罗汉果甜苷v标准品绘制的曲线，线性回归方程为：y=4130.1x+1.0639(r2=0.9998)，峰面积的响应值与罗汉果甜苷v的质量在0.00025~0.01000mg范围内有良好的线性关系。
42.1.3.4重现性试验样品的重现性检验结果见表3。rsd为0.299%(n=6)，保留时间和峰面积响应值重现性良好。
43.表3罗汉果苷v的精密度试验1.3.5精密度试验罗汉果甜苷v的精密度检测结果见表4。rsd为0.962%(n=6)，表明精密度良好。,表4鲜果中罗汉果甜苷v测定重复性情况1.3.6罗汉果样品中罗汉果甜苷v含量测定表5为本实验的鲜罗汉果汁和经d101大孔树脂处理后的罗汉果甜苷样品经hplc法
检测的数据，经d101大孔树脂处理后，大部分罗汉果甜苷v被d101大孔树脂吸附，使用95%乙醇可将其洗下，蒸干称量得4.1957g，通过hplc法测得罗汉果甜苷v回收率达84.625%，数据表明，d101大孔树脂对罗汉果果汁中的甜苷v具有良好的吸附性，能较好的将果汁中的蛋白酶和甜苷v分离，从而具有较好的分离纯化作用。
44.表5罗汉果样品的检测结果2.冷冻干燥罗汉果蛋白酶研究冷冻干燥前后酶比活测定取冷藏存放了一段时间后的粗酶汁进行冷冻干燥。表6为罗汉果蛋白酶干燥前后蛋白质含量测定结果，干燥前总酶活达0.402
×
106u，干燥得粗酶总酶活达0.372
×
106u，酶活回收率达92.537%，纯化倍数为0.944，以上数据表明经冷冻干燥器干燥后，酶活性大部分都得到回收，损失较少，因此使用冷冻干燥器来干燥罗汉果蛋白酶，效果很好。
45.表6罗汉果蛋白酶干燥前后酶活性测定结果3硫酸铵分级沉淀罗汉果蛋白酶研究3.1硫酸铵分级沉淀罗汉果蛋白酶蛋白含量测定用不同饱和度的硫酸铵沉淀罗汉果蛋白酶溶液，并使用考马斯亮蓝g250法检测其蛋白质含量，结果如表7所示。以饱和度为0%的酶汁为对照，当硫酸铵饱和度从20%升至65%时，蛋白质的回收率也逐步上升，当硫酸铵饱和度从65%升至100%时，蛋白质的回收率却逐步降低，数据表明当硫酸铵饱和度为50~100%时，罗汉果蛋白酶溶液的蛋白质回收率较好，当硫酸铵饱和度为65%时，罗汉果蛋白酶溶液的蛋白质回收率最大，达87.681%，说明大部分罗汉果蛋白酶被沉淀回收，蛋白质损失最少。
46.表7 硫酸铵分级沉淀罗汉果蛋白酶蛋白含量测定结果
3.2硫酸铵分级沉淀罗汉果蛋白酶酶比活测定罗汉果蛋白酶酶比活测定，分为实验组和空白组，空白组是在与实验组相同时间段，相同环境下，相同的反应试剂及仪器，只改变三氯乙酸加入的顺序，使得蛋白酶变性失活，无法与酪蛋白反应生产出能在波长275nm有吸光度的生成物，从而排除一切除生成物外能在275nm有吸光度的干扰因素。
47.表8硫酸铵分级沉淀罗汉果蛋白酶酶活性测定结果表8为不同饱和度硫酸铵处理后的罗汉果蛋白酶酶活性测定结果，随着饱和度的增加，在20%~65%范围内，酶活性逐步上升，纯化倍数也在上升，在65%~100%范围内，酶活性却在逐步降低，纯化倍数也在降低，数据表明当硫酸铵饱和度为50~100%时，罗汉果蛋白酶溶液的酶活性损失较少，其中，当硫酸铵饱和度为65%时，其酶活回收率达93.951%，纯化倍数为1.071，酶活性损失最少，纯化倍数最大。
48.不同硫酸铵饱和度对应的蛋白回收率和酶活回收率如图5所示，当硫酸铵饱和度为饱65%时，蛋白回收率为87.681%，酶活回收率为93.951%，纯化倍数为1.071，说明此浓度的硫酸铵能将大部分的罗汉果蛋白酶沉淀回收，并能保持其较高的酶活性，对罗汉果蛋白酶还具有一定的纯化作用。