一种靶向卵巢癌的钌-LHRH偶联诊疗探针及其制备方法和应用

本发明公开的是一种靶向卵巢癌的钌-lhrh偶联诊疗探针及其制备方法和应用，所公开的偶联物由肿瘤靶向多肽黄体生成素释放激素(lhrh)为识别分子，和具有荧光和杀伤肿瘤细胞功能的钌配合物ruc二者偶联组成。所公开的偶联物可作为新的特异性靶向卵巢癌细胞的诊疗探针。

背景技术：

金属钌(ruthenium)配合物和以顺铂为代表的其它金属化疗药物相比，它的细胞毒性更高且毒副作用更小，发展前景广阔，目前已经由三种钌配合物已经进入)临床研究，而我国金属钌类抗肿瘤药物的研发尚处于起步阶段(anal.bioanal.chem.,2013,405:1791-1808.)。以往的研究结果显示，钌配合物对肿瘤细胞毒性高于健康细胞，但这并不能完全避免其对正常细胞的毒性，在动物体内实验中发现该类钌配合物对裸鼠的组织器官有一定的毒副作用，所以提高该类钌配合物的特异性靶向杀伤能力成为需要进一步研究解决的问题(j.biol.inorg.chem.,19:335-348,2014.)。把具有肿瘤靶向识别功能的靶向导航配体与靶向性差的小分子细胞毒药物偶联，可将药物主动靶向至肿瘤发生部位，避免其在健康组织蓄积，减少对正常组织或器官的损害，提高靶向抗肿瘤效果(j.biomol.struct.dyn.,6:1-12,2016.)。

黄体生成素释放激素(lhrh)可以和lhrh受体特异性结合，而lhrh受体在前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌均大量表达，而其他器官或造血干细胞均不表达，由于这种细胞间的表达差异，lhrh可作为药物运输载体，通过与lhrh受体的特异性结合,增加细胞毒类药物在肿瘤组织中的局部浓度，从而使正常细胞免受损害(gynecoloncol,,119(3):457-461,2010.)。lhrh作为新的靶向偶联配体有以下优势：(1)相对于叶酸等小分子，与其对应的受体整合时有更高的亲和力或特异性，且整合素在肿瘤细胞和正常组织的差异化表达更高；(2)相对于抗体大分子，其性能更稳定且容易制备。(3)免疫原性较低；能快速被肾脏消除，使其对骨髓和肝脏的毒性更低。加拿大aeternazentaris公司研发了lhrh与多柔比星偶联的新药aezs-108(an-152)，通过lhrh的靶向导航作用实现多柔比星对子宫内膜癌、结直肠癌、黑色素瘤、淋巴瘤和肉瘤等lhrh受体高表达肿瘤的靶向递药。而且动物试验及临床i期研究表明该药不会诱导肿瘤细胞中多药耐药(mdr-i)基因表达，故有可能克服化疗药耐药问题(gynecoloncol,,119(3):457-461,2010.)。

金属钌配合物不仅具有良好的抗肿瘤特性，还具有高荧光强度、大的stokes位移、光稳定性好等出色的光化学物理性质，所以钌(ii)配合物荧光探针被广泛应用于荧光成像及生物传感器等方面的研究。(biomaterials,2014,35:1572-1583.)故其与lhrh肽偶联，不仅能够达到靶向抗肿瘤的作用，还可作为肿瘤细胞的特异性荧光探针，在实现对肿瘤进行治疗的同时，还能够对治疗效果进行实时的评估，达到诊断和治疗的双重作用。

综上所述，利用肿瘤细胞与正常细胞膜表面的lhrh受体表达量的差异，把特异性的靶向导航配体lhrh与金属钌配合物偶联，通过配体与受体的特异性结合，增加药物在肿瘤细胞膜上的积聚，利用受体介导的细胞内化方式，加大肿瘤细胞摄取药物的速度与数量，增加靶/非靶细胞杀伤比值，从而实现靶向。通过这种差异性的靶向识别模式，使该类配合物最终特异性杀伤肿瘤细胞而对健康细胞影响较小。另外，由于钌配合物优秀的光化学物理特性，在治疗肿瘤的同时，又能对疗效进行实时监测与评估，为开发可用于动态监测肿瘤识别及杀伤的“诊疗一体化”的双功能靶向抗肿瘤药物建立研究基础并满足了高效低毒的设计要求。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种靶向卵巢癌的钌-lhrh偶联诊疗探针及其制备方法和应用。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供偶联物ruc-lhrh在体外靶向肿瘤细胞及抑制肿瘤细胞增殖的效果。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种钌配合物ruc，其由配体l1和配体l2制备得到，其反应式如下所示：

所述的配体l1的制备方法如下：称取0.093g的浓度为1mmol的苯胺，0.150g浓度为1mmol的4-甲酰苯甲酸，1.542g浓度为20mmol的醋酸铵，0.21g浓度为1mmol的1,10邻菲罗啉-5,6-二酮，溶于10ml冰醋酸中，氩气保护下回流24小时，反应液冷却后加入50ml水冷却，得黄色沉淀即可。

所述的配体l2的制备方法如下：称取rucl3·3h2o1.56g，4,7-二苯基-1,10-邻菲罗啉2.98g，氯化锂1.56g溶于10mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，氩气保护，160℃反应8h。反应完全后冷却至室温，加入50ml丙酮，沉淀产物并抽滤，沉淀用冰水洗涤完全，得黑色固体。将所得固体溶于300ml乙醇：水＝1:1(v:v)的混合体系中，加热旋蒸除去乙醇，抽滤后静置，待晶体析出。将析出的晶体依次用水、乙醚洗涤，抽滤物真空干燥，可得橘红色微晶。

上述钌配合物ruc的制备方法包括如下步骤：分别称取0.4mmol的配体l1和0.4mmol的配体l2，将二者溶于10ml的dmf中，在氩气保护下150℃反应8小时，可得深红色溶液；待反应液冷却，用15ml水稀释，加入饱和六氟磷酸铵溶液剧烈搅拌，过滤；得到暗红色固体，用少量的水和乙醚多次洗涤，然后真空干燥，用氧化铝柱进行层析纯化，乙腈和乙醇作为流动相，最后除去溶剂，减压旋干得橘红色微晶。

本发明提出的钌-lhrh肽偶联物ruc-lhrh，其结构式如式下所示：

钌-lhrh肽偶联物ruc-lhrh的制备方法包括如下步骤：将钌配合物ruc溶于30ml无水乙腈，剧烈搅拌，然后将0.56mmoln-羟基丁二酰亚胺(nhs)和0.47mmol的n,n'-二环己基碳酰亚胺(dcc)加入溶液中，室温搅拌反应6h；反应产物用硅胶柱纯化，用10％甲醇进行洗脱，产物冻干得暗黄色固体ruc-nhs；将0.018mmol的ruc-nhs溶于4ml无水无氧的dmf，然后加入0.08g的lhrh，室温下搅拌反应24h，在纯水中进行透析，产物经冻干后可得橘红色的固体ruc-lhrh。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：

本发明提供了偶联物ruc-lhrh的合成方法，细胞荧光显像实验发现该偶联物ruc-lhrh能够特异性进入卵巢癌细胞a2780，而几乎不能进入正常细胞l02。细胞毒性实验发现ruc-lhrh能够明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞增殖抑制不明显，可作为靶向卵巢癌的钌-lhrh偶联诊疗探针。

该ruc-lhrh偶联物具有荧光，所以还可作为卵巢癌细胞的特异性荧光探针，在实现对肿瘤进行治疗的同时，对治疗效果进行实时的评估。本发明可以实现对卵巢癌诊断和治疗的双重功能，对于实现肿瘤的个体化治疗和精准治疗具有良好应用前景。

附图说明

图1为偶联物ruc-lhrh靶向进入a2780肿瘤细胞的荧光图像，其中，a，d为细胞在明场下的图像。b，e为细胞荧光图像。c，f分别为a，b和d，e的叠加图像。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

钌-lhrh偶联物ruc-lhrh的合成

所述的偶联物由钌配合物(ruc)和lhrh两部分偶联合成得到。其中钌配合物ruc的结构式为：[ru(dip)2(hpip-cooh)](pf6)2，dip为4,7-二苯基-1,10-邻菲罗啉；hpip为2-羟基苯基咪唑并[4,5–f]邻菲咯。lhrh肽为商品化试剂(lhrh，上海强耀生物)。偶联物ruc-lhrh由钌配合物ruc和lhrh经缩合反应所得。(ruc钌配合物合成流程如式i所示，偶联物ruc-lhrh如式ii所示)：

其中配体制备方法如下：

(1)配体l1的制备方法：称取0.093g苯胺(1mmol/l)，0.150g4-甲酰苯甲酸(1mmol/l)，1.542g醋酸铵(20mmol/l)，0.21g的1,10邻菲罗啉-5,6-二酮(1mmol/l)，溶于10ml冰醋酸，氩气保护下回流24小时。反应液冷却后加入50ml水稀释，得黄色沉淀。

(2)配体l2的制备方法：参照(inorg.chem.1978,17,3334-3341)的合成方法，称取rucl3·3h2o1.56g，4,7-二苯基-1,10-邻菲罗啉2.98g，氯化锂1.56g溶解于10mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，氩气保护，160℃反应8h。反应完全后冷却至室温，加入50ml丙酮，沉淀产物并抽滤，沉淀用冰水洗涤完全，得黑色固体。然后溶于300ml乙醇：水＝1:1(v:v)的混合体系中，加热旋蒸除去乙醇，抽滤后静置。将析出的晶体依次用水、乙醚洗涤，抽滤物真空干燥，得橘红色微晶。

(3)钌配合物ruc的制备方法：分别称取0.4mmol的配体l1和0.4mmol的配体l2，将二者溶于10ml的dmf中，于氩气保护下150℃反应8小时，可得深红色溶液；待反应液冷却用15ml水稀释，加入饱和六氟磷酸铵溶液剧烈搅拌，过滤；得到暗红色固体，用少量的水和乙醚多次洗涤，真空干燥，使用氧化铝柱层析纯化，乙腈和乙醇作为流动相，最后除去溶剂，减压旋干得橘红色微晶。

(4)偶联物ruc-lhrh如式ii所示，偶联物ruc-lhrh的制备方法如下：

偶联物ruc-lhrh的制备方法，将钌配合物ruc溶于30ml的无水乙腈，剧烈搅拌，然后将0.56mmoln-羟基丁二酰亚胺(nhs)和0.47mmol的n,n'-二环己基碳酰亚胺(dcc)加入溶液中，室温搅拌反应6h；反应产物用硅胶柱纯化，10％甲醇洗脱，产物冻干后得暗黄色固体ruc-nhs；将0.018mmol的ruc-nhs溶于4ml无水无氧的dmf，然后加入0.08g的lhrh，室温搅拌反应24h，在纯水中透析，产物经冻干后可得橘红色的固体ruc-lhrh。

实施例2

偶联物ruc-lhrh可以靶向识别卵巢癌细胞a2780，由于ruc-lhrh具有红色荧光，所以可以通过细胞的荧光情况判断其是否进入细胞。将偶联物ruc-lhrh分别与高表达lhrh受体的a2780细胞和低表达lhrh受体的正常肝细胞l02的共孵育6小时。a2780细胞质呈现明显的红色荧光，而l02细胞几乎未观察到荧光，证明偶联物ruc-lhrh能够靶向识别高卵巢癌细胞a2780，如附图1所示。因此，偶联物ruc-lhrh可用于制备以卵巢癌细胞a2780为靶点的检测或诊断的相关产品。

实施例3

钌-lhrh偶联物ruc-lhrh靶向杀伤a2780肿瘤细胞

未偶联的钌配合物ruc和靶向配体lhrh对于两种细胞杀伤能力都很弱，是由于ruc虽然毒性较强但是比较难于进入细胞，而lhrh虽然可以进入细胞但是其毒性不强。但是偶联后ruc-lhrh对高表达lhrh受体的卵巢癌细胞a2780抑制能力显著升高，而对于正常肝细胞l02杀伤能力很弱，说明是由于偶联了lhrh后增加了ruc进入细胞而产生靶向杀伤效果。如附表1所示。

表1铱配合物对各种细胞的半数抑制浓度

^aic50的单位用μm表示，^bl02:为正常人肝细胞，^ca2780:为卵巢癌细胞。

上述实施例为本发明包含却不仅限于的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。