一种提高乳酸链球菌素效价的培养工艺的制作方法

本发明属于微生物发酵技术领域，具体的涉及一种提高乳酸链球菌素效价的培养工艺。

背景技术：

乳酸链球菌素(nisin)是由乳酸链球菌(lactococcuslactis)发酵产生的多肽类物质，内含34个氨基酸。它能有效抑制革兰氏阳性细菌及其芽孢的繁殖，食用后会被人体很快消化吸收，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂，因而被广泛应用在乳制品、肉制品、罐头制品、果汁和酒精饮料等多种食品中。

乳酸链球菌在发酵生产乳酸链球菌素过程中存在2个问题：一是会产生大量副产物乳酸，导致ph降低，抑制菌体生长，也抑制nisin的合成。二是由于发酵周期较短，营养利用速度快，发酵后期效价涨幅降低或基本不涨，而nisin作为初级代谢产物，其发酵配方相对较简单，其碳源和氮源为主要影响因素，常用的碳源为葡萄糖、蔗糖，氮源为酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆等，均用于菌体生长和产物合成。葡萄糖能够提供能量和碳骨架，酵母浸粉、玉米浆等能够提供氨基酸、维生素、生长因子等营养物质。

有报道酵母菌和乳酸链球菌混菌发酵解除乳酸抑制，但乳酸链球菌抑菌能力较强，混菌发酵营养成分要求较高，原材料成本增大，不适于工业化生产；也有报道培养基中加入caco3调控ph，但不利于后续提取分离纯化。

中国专利cn104789624b(申请号cn201510190841.8)公开了一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，通过流加一定浓度氢氧化钙悬浊液的方式控制发酵液ph，发酵结束时效价达到12300-13030iu/ml。

采用流加ca(oh)2的方法控制ph，虽然能够解除部分乳酸抑制，但大大增加了发酵液浑浊度，在提取过滤过程中，不能完全截留效价，造成提取收率的降低；同时由于ca(oh)2溶液是悬浊液，在使用过程中需要增加搅拌装置不断搅拌，保持混匀悬浮状态，增加了设备投资和动力成本，降低了生产效率。

综上如何解除乳酸对发酵的抑制对提升效价有较大影响，同时如何优化使得菌体能够最大化生长和产物，提高后期菌体活力，促进效价增加也至为关键。

技术实现要素：

本发明为解决现有技术问题，提供了一种能够提升效价，解除乳酸抑制，同时提供适合菌体生长和产素的营养配比，改善发酵液性质，便于提取分离操作，降低设备投资，减少动力成本，提高生产效率的发酵生产工艺。

本发明采用的技术方案为：一种提高乳酸链球菌素效价的培养工艺，包括以下步骤：首先向发酵培养基中加入一定浓度的cacl2，再用ca(oh)2调节ph至7.0-7.2；再对发酵培养基进行消毒，消毒结束后向发酵培养基中接入种子液进行发酵培养；在发酵培养过程中通过流加液碱控制发酵液ph6.0-6.3，同时在对数生长初期乳酸链球菌素的合成启动后，变速流加葡萄糖和玉米浆，发酵培养周期为20-30h结束，得到乳酸链球菌素发酵液。

进一步地，所述种子液的制备方式为：将乳酸链球菌种液接入装有种子培养基的种子罐中，经过两级扩大培养，料液稀释5倍于od600nm下检测，当吸光值达到0.6以上，ph值6.0-6.5时移种。

进一步地，所述向发酵培养基中接入种子液的接种量为：种子液占发酵培养基的百分比为5-8％，发酵培养周期为22-26h。

进一步地，所述种子培养基成分按重量百分比为：葡萄糖0.5-1.0％，牛骨蛋白胨0.5-1.0％，酵母浸粉0.5-1.0％，kh2po40.3-0.7％，nacl0.1-0.3％，mgso4·7h2o0.01-0.03％，余量用去离子水补齐。

进一步地，所述发酵培养基的成分按重量百分比为：葡萄糖1.0-1.5％，酵母浸粉0.5-1.0％，kh2po40.1-0.3％，cacl2或caso40.5-1.0％，mgso4·7h2o0.01-0.03％，玉米浆干粉0.2-0.8％，吐温-800.1-0.2％，余量用去离子水补齐。

进一步地，所述发酵培养基的消毒条件为：温度为95-100℃，时间为10min。

进一步地，所述ca(oh)2的浓度为20-25％。

进一步地，所述发酵培养的条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005mpa，4h后泄压0mpa培养，温度30±1℃。

进一步地，所述葡萄糖流加速率为：4-10h7.0-10.0ml/l/h，10-16h3.5-5.0ml/l/h，16-发酵结束1.25-2.5ml/l/h；所述玉米浆流加速率为：4-12h0.25-0.4ml/l/h，12-16h0.08-0.24ml/l/h。

进一步地，所述葡萄糖浓度为40-60％；玉米浆浓度为20-30％，其中玉米浆总氨基酸含量≥50％。

本发明获得的有益效果为：本发明确定了提高乳酸链球菌素效价的培养工艺，发酵培养基中加入一定浓度的cacl2，用ca(oh)2调节ph至7.0-7.2，消毒结束后接入种子液，在发酵过程中通过流加液碱控制发酵液ph6.0-6.3，同时在对数生长初期乳酸链球菌素的合成启动后，变速流加葡萄糖和玉米浆，发酵20-30h结束。通过添加少量cacl2，解除乳酸抑制的同时，根据菌体生长和产物合成特性变速流加促进菌体生长和产素的合适补料配比，显著提升了技术水平，乳酸链球菌素生物效价测定在18000iu/ml以上。同时减少了ca离子引入量，便于提取过滤，降低了设备投资，减少了动力成本，提高了生产效率，适用于工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1与对比实施例1的效价对比图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1：

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.5，牛骨蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，kh2po40.3，nacl0.1，mgso4·7h2o0.01，余量用去离子水补齐，消后ph7.0。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

接入乳酸链球菌种液进行两级扩大培养。关闭通气，维持罐压0.04±0.05mpa，培养温度30±1℃。料液稀释5倍于od600nm下检测，吸光值达到0.603，ph值6.09，移种。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0％，酵母浸粉0.5％，kh2po40.1％，cacl20.5％，mgso4·7h2o0.01％，玉米浆干粉0.2％，吐温-800.1％，余量用去离子水补齐。

灭菌：95-100℃煮沸10min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。消毒结束后用20％ca(oh)2将ph调至7.0。

将培养好的种子液接入发酵培养基中，不通气培养，前4h罐压0.04±0.005mpa，4h后泄压0mpa培养，温度30±1℃，发酵1.5h后通过调节液碱控制ph6.0。

补料工艺控制：发酵4h开始补加40％葡萄糖和20％玉米浆，葡萄糖补加速率：4-10h7.0ml/l/h，10-16h3.5ml/l/h，16-发酵结束1.25ml/l/h。玉米浆补加速率：4-12h0.25-0.4ml/l/h，12-16h0.08-0.24ml/l/h。

发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为18172u/ml。

实施例2

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.75，牛骨蛋白胨0.75，酵母浸粉0.75，kh2po40.5，nacl0.2，mgso4·7h2o0.02，余量用去离子水补齐，消后ph6.99。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

接入乳酸链球菌种液进行两级扩大培养。关闭通气，维持罐压0.04±0.05mpa，培养温度30±1℃。料液稀释5倍于od600nm下检测，吸光值达到0.612，ph值6.14，移种。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.25，酵母浸粉0.75，kh2po40.3，cacl20.75，mgso4·7h2o0.03，玉米浆干粉0.5，吐温-800.15，余量用去离子水补齐，消后ph6.86。

灭菌：95-100℃煮沸10min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。消毒结束后用22.5％ca(oh)2将ph调至7.1。

将培养好的种子液接入发酵培养基中，不通气培养，前4h罐压0.04±0.005mpa，4h后泄压0mpa培养，温度30±1℃，发酵1.5h后通过调节液碱控制ph6.15。

补料工艺控制：发酵4h开始补加50％葡萄糖和25％玉米浆，葡萄糖补加速率：4-10h8.5ml/l/h，10-16h4.25ml/l/h，16-发酵结束1.9ml/l/h。玉米浆补加速率：4-12h0.325ml/l/h，12-16h0.16ml/l/h。

发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为18039u/ml。

实施例3

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0，牛骨蛋白胨1.0，酵母浸粉1.0，kh2po40.7，nacl0.3，mgso4·7h2o0.03，余量用去离子水补齐，消后ph6.96。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

接入乳酸链球菌种液进行两级扩大培养。关闭通气，维持罐压0.04±0.05mpa，培养温度30±1℃。料液稀释5倍于od600nm下检测，吸光值达到0.609，ph值6.18，移种。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.5，酵母浸粉1.0，kh2po40.3，cacl21.0，mgso4·7h2o0.03，玉米浆干粉0.8，吐温-800.2，余量用去离子水补齐，消后ph6.92。

灭菌：95-100℃煮沸10min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。消毒结束后用25％ca(oh)2将ph调至7.2。

将培养好的种子液接入发酵培养基中，不通气培养，前4h罐压0.04±0.005mpa，4h后泄压0mpa培养，温度30±1℃，发酵1.5h后通过调节液碱控制ph6.3。

补料工艺控制：发酵4h开始补加50％葡萄糖和25％玉米浆，葡萄糖补加速率：4-10h10ml/l/h，10-16h5ml/l/h，16-发酵结束2.5ml/l/h。玉米浆补加速率：4-12h0.4ml/l/h，12-16h0.24ml/l/h。

发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为18281u/ml。

对比实施例1

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.5，牛骨蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，kh2po40.3，nacl0.2，mgso4·7h2o0.02，余量用去离子水补齐，消后ph7.0。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

接入乳酸链球菌种液进行两级扩大培养。关闭通气，维持罐压0.04±0.05mpa，培养温度30±1℃。料液稀释5倍于od600nm下检测吸光值达到0.617，ph值6.21，移种。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0，酵母浸粉0.75，kh2po40.2，nacl0.2，mgso4·7h2o0.02，玉米浆干粉0.5，吐温-800.1，余量用去离子水补齐，消后ph6.89。

灭菌：100℃煮沸30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将培养好的种子液接入发酵罐中，培养22-26h，发酵结束。发酵培养条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005mpa，4h后泄压0mpa培养，温度30±1℃，全程通过调节液碱控制ph值的变化范围为6.2。

补料工艺控制：

补糖：发酵培养至4h时，葡萄糖降至0.55％，开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

补料工艺控制：发酵4h开始补加50％葡萄糖，葡萄糖补加速率：4-10h5ml/l/h，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为13318u/ml。

对比实施例2

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖0.75，牛骨蛋白胨0.75，酵母浸粉0.75，kh2po40.5，nacl0.2，mgso4·7h2o0.02，余量用去离子水补齐，消后ph6.95。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

接入乳酸链球菌种液进行两级扩大培养。关闭通气，维持罐压0.04±0.05mpa，培养温度30±1℃。料液稀释5倍于od600nm下检测，吸光值达到0.615，ph值6.21，移种。

发酵培养：培养基体积40t。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.25，酵母浸粉0.75，kh2po40.2，nacl0.2，mgso4·7h2o0.02，玉米浆干粉0.5，吐温-800.15，余量用去离子水补齐，消后ph6.9。

灭菌：100℃煮沸30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将培养好的种子液接入发酵罐中，培养22-26h，发酵结束。发酵培养条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005mpa，4h后泄压0mpa培养，温度30±1℃，全程通过调节液碱控制ph值的变化范围为6.2。

补料工艺控制：

补糖：发酵培养至4.5h时，葡萄糖降至0.51％，开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

1.5％玉米浆：发酵培养至8h，以0.3％发酵液体积的速率流加。

发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为13274u/ml。

对比实施例3

种子培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.0，牛骨蛋白胨1.0，酵母浸粉1.0，kh2po40.7，nacl0.3，mgso4·7h2o0.03，余量用去离子水补齐，消后ph7.01。

灭菌：121-125℃灭菌30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

接入乳酸链球菌种液进行两级扩大培养。关闭通气，维持罐压0.04±0.05mpa，培养温度30±1℃。料液稀释5倍于od600nm下检测，吸光值达到0.614，ph值6.13，移种。

发酵培养基以重量百分比计，按照如下配比配制(％)：葡萄糖1.5，酵母浸粉1.0，kh2po40.3，nacl0.3，mgso4·7h2o0.03，玉米浆干粉0.8，吐温-800.2，余量用去离子水补齐，消后ph6.92。

灭菌：100℃煮沸30min后冷却至30±1℃后补入葡萄糖，并用无菌空气保压。

将培养好的种子液接入发酵罐中，培养22-26h，发酵结束。发酵培养条件为：不通气培养，前4h罐压0.04±0.005mpa，4h后泄压0mpa培养，温度30±1℃，全程通过流加ca(oh)2控制ph值的变化范围为6.3。

补料工艺控制：

补糖：发酵培养至4h时，葡萄糖降至0.5％，开始补糖，中间控制糖浓度为0.3-0.5％。

发酵培养结束，发酵周期为22h，检测乳酸链球菌素生物效价为14427u/ml。