本发明涉及红曲高产洛伐他汀技术领域，尤其涉及一种红曲高产洛伐他汀的发酵方法。
背景技术：
红曲又称红曲米、丹曲，是以大米为基质，经红曲霉发酵而成的一种红色米曲，自古以来就有药用和食用的价值。本草纲目中记载“红曲主治：消食活血、健脾燥胃、酿酒破血行伤势及产后恶血不尽等”2015版药典上记载：红曲，甘，性微温。归脾、大肠、肝经，具有活血祛瘀、健脾消食、化浊降脂等功效。
目前，酿造用红曲、红曲色素的研究已较为成熟。20世纪70年代以来，对红曲霉的研究已扩展到有关降血脂、降血压等生理功能。功能红曲富含莫纳克林—k，即天然他汀—洛伐他汀，含量≥0.4％，可代替他汀类药物，而且无毒副作用，可长期服用，有效治疗心脑血管疾病。人体胆固醇的合成中，约有25种酶参加反应，其中最为关键的酶是hmg-coa还原酶。由于洛伐他汀能很有力的抑制hmg-coa还原酶，阻止胆固醇的合成。另外，洛伐他汀可以促进胆固醇分解代谢。且研究表明，每天服用含洛伐他汀5-6mg的红曲与每天服用西药洛伐他汀20-40mg的作用效果等同，说明红曲中可能有其他他汀类成分起到协同降脂作用。
同时功能红曲也有抗动脉粥样硬化的作用：动脉粥硬化(as)是人类健康杀手之一，患动脉粥硬化(as)的人血液中会含有甘油三脂、胆固醇等。伴随年龄增长，在胆固醇的作用下会形成“血垢”。最后会堵塞血管，造成脑血栓等疾病的发生。而洛伐他汀可以抑制和促进胆固醇分解代谢，对预防治疗动脉粥硬化(as)有一定的积极作用。
在cn107475301a中，以大米底物添加无机盐离子，在最佳的发酵条件下，洛伐他汀的含量可达2.3-3.3mg/g。在cn105112305a中，以粳米为主要原料，在最佳的发酵条件下，洛伐他汀的含量达到4.64mg/g。在cn109234168a中，以大米为原料，添加甘露醇、麦芽提取物、磷酸二氢钾、谷氨酸后，在最佳的发酵条件下，洛伐他汀的含量达到5.29mg/g。但是洛伐他汀的含量整体偏低；且难以避免红曲发酵中常常产生橘霉素，橘霉素作用于人体肾脏而致癌，国家相关标准对此有着严苛的标准，必须低于50ug/kg，橘霉素的产生一般与菌种和发酵工艺有关，由于橘霉素这一行业瓶颈，限制了功能红曲的发展和运用。但是传统的红曲发酵产业，会不可避免的随着红曲发酵产生橘霉素，橘霉素被誉为红曲发酵界的“克星”。
技术实现要素：
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种采用新的功能红曲菌菌株进行红曲洛伐他汀的发酵方法，其结合先高温发酵再低温发酵的方式，使所得到的发酵物中红曲洛伐他汀的含量在20mg/g以上，且不含有橘霉素。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
本发明提供一种红曲高产洛伐他汀的发酵方法，其包括以下步骤：将功能红曲菌菌菌株丛毛红曲菌培养的菌液，接种在主要含有大米的培养基进行发酵得到的发酵产物为红曲高产洛伐他汀；所述发酵包括第一阶段的高温发酵和第二阶段的低温发酵，所述高温发酵在28～35℃，湿度为75～85％的环境中高温发酵，培养6～8天；所述低温发酵在23～30℃湿度为75～85％环境中低温发酵，培养38～45天，发酵结束。
可选地，功能红曲菌菌菌株为丛毛红曲菌。
可选地，培养基为固体培养基。
可选地，培养基包括以下重量份的组分：粳米粉25～40份、麸皮3～8份、黄豆粉1～2份、蛋白胨0.5～1.5份、白糖1.0～2.5份、酵母浸粉0.5～1份和复合氨基酸0.1～0.2份。
可选地，所述培养基的水分含量30％～40％，ph值为3.5～4.5。
可选地，所述培养基的制备包括以下步骤：将各组分按所述重量份的混合物蒸熟后在125℃灭菌60min后得到培养基。
可选地，所述菌液的制备包括以下步骤：吸取菌丝干重为10g/l红曲霉菌悬液在所述培养基中，32℃、180rpm培养48h后种子液，吸取种子液在32℃、180rpm下继续培养24h得到所述菌液。
可选地，菌液的接种量为所述培养基重量的13％～18％。
可选地，发酵包括第一阶段的高温发酵和第二阶段的低温发酵，所述高温发酵在28～35℃，湿度为75～85％的环境中高温发酵，培养6～8天；
低温发酵在23～30℃湿度为75～85％环境中低温发酵，培养38～45天，发酵结束。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明提供的一种采用新的功能红曲菌菌菌株进行红曲洛伐他汀的发酵方法，由于采用新的功能红曲菌菌菌株结合先高温发酵再低温发酵的方式，其相对于现有技术而言，使所得到的发酵物中红曲洛伐他汀的含量在20mg/g以上，显著提高了产量，且不含有橘霉素。
其中，由于采用结合先高温发酵再低温发酵的方式，发酵时间由60天缩短至40天，大大提高生产周期与效率，为功能红曲的工业化生产提供良好的理论支撑。
其中，本发明的红曲发酵产物经过高效液相色谱仪检测，红曲发酵产物中完全不含橘霉素，为功能红曲的推广和运用奠定了良好的基础。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
为提高丛毛红曲菌的发酵物(以干燥后的发酵物计)中红曲洛伐他汀的含量在20mg/g以上，且不含有橘霉素，本发明提供一种红曲高产洛伐他汀的发酵方法，其包括以下步骤：将功能红曲菌菌菌株丛毛红曲菌培养的菌液，接种在主要含有大米的培养基进行发酵得到的发酵产物为红曲高产洛伐他汀；所述发酵包括第一阶段的高温发酵和第二阶段的低温发酵，所述高温发酵在28～35℃，湿度为75～85％的环境中高温发酵，培养6～8天；所述低温发酵在23～30℃湿度为75～85％环境中低温发酵，培养38～45天，发酵结束。
本发明的关键点之一在于：采用毛红曲菌采用结合先高温发酵再低温发酵的方式，发酵时间由60天缩短至40天，大大提高生产周期与效率。上述的温度和湿度是必须的。
本发明的功能红曲菌菌菌株，为丛毛红曲菌，其菌落质地松软，菌丝呈绒毛状，颜色为深橙色。
此外，本发明的关键点之一还在于：培养基为固体培养基和培养基的组成成分。培养基包括以下重量份的组分：粳米粉25～40份、麸皮3～8份、黄豆粉1～2份、蛋白胨0.5～1.5份、白糖1.0～2.5份、酵母浸粉0.5～1份和复合氨基酸0.1～0.2份。
其中，培养基的水分含量30％～40％，ph值为3.5～4.5。
其中，培养基的制备包括以下步骤：将各组分按所述重量份的混合物蒸熟后在125℃灭菌60min后得到培养基。
其中，菌液的制备包括以下步骤：吸取菌丝干重为10g/l红曲霉菌悬液在所述培养基中，32℃、180rpm培养48h后种子液，吸取种子液在32℃、180rpm下继续培养24h得到所述菌液。
其中，菌液的接种量为所述培养基重量的13％～18％。
为了更好的理解上述技术方案，下面将更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然以下显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
实施例1
本发明提供一种红曲洛伐他汀的发酵方法，其包括以下步骤：
s1种子液的制备：用无菌的生理盐水刮洗培养好的平皿，吸取3ml红曲霉(命名为s-01)菌悬液(菌丝干重为10g/l)到500ml的种子培养基中，32℃、180rpm培养48h；移取10％的种子液，32℃、180rpm培养24h，作为固态发酵的种子液。
s2培养基配方：按重量份，将30份粳米粉，5份麸皮，1份黄豆粉，1份蛋白胨，1.5份白糖，0.8份酵母浸粉，0.1-0.2份复合氨基酸混合后控制最终湿料水分含量35％，用乳酸调ph4.0；先蒸熟后再冷却粉碎装瓶，每1500ml塑料瓶装料400g，八层纱布加一层牛皮纸覆盖，125℃灭菌60min，趁热拍散，待用；
s3接种：将种子液按照固态基质重量份的15％接种到固态基质中，拍散，使菌液均匀分布在固体基质中；
s4培养：拍散混匀放入30℃，且80％湿度环境中高温发酵，培养7天，每2-3天拍瓶翻曲一次，待培养基上布满种子，彻底拍散，转入23-30度80％湿度环境中低温发酵，每5-7天拍瓶翻曲一次，培养40天，发酵结束得到发酵产物；
s5烘干与粉碎：将发酵产物置于空气能烘干机65℃烘干，粉碎机粉碎；
s6按照《中华人民共和国轻工业标准》qb/t2487中的方法检测粉碎后的红曲发酵产物中的洛伐他汀和橘霉素的含量。
本实施例得到的红曲发酵产物中的洛伐他汀的含量为20mg/g。
实施例2
一种红曲洛伐他汀的发酵方法，其包括以下步骤：
s1种子液的制备：用无菌的生理盐水刮洗培养好的平皿，吸取3ml红曲霉(命名为s-01)菌悬液(菌丝干重为10g/l)到500ml的种子培养基中，32℃、180rpm培养48h后，移取10％的种子液，32℃、180rpm培养24h，作为固态发酵的种子液。
s2培养基配方：按重量份，粳米粉40份、麸皮3份、黄豆粉2份、蛋白胨0.5份、白糖2.5份、酵母浸粉0.5份和复合氨基酸0.2份，控制最终湿料水分含量30％，用乳酸调ph值为4.5；
先蒸熟后再冷却粉碎装瓶，每1500ml塑料瓶装料400g，八层纱布加一层牛皮纸覆盖，125℃灭菌60min，趁热拍散，待用；
s3接种：将种子液按照固态基质重量份的18％接种到固态基质中，拍散，使菌液均匀分布在固体基质中；
s4培养：接种后拍散混匀放入28℃和85％湿度环境中高温发酵，培养6天，每2-3天拍瓶翻曲一次，待培养基上布满种子，彻底拍散，转入30℃的75％湿度环境中低温发酵，每5-7天拍瓶翻曲一次，培养45天，发酵结束得到发酵产物；
s5烘干与粉碎：将发酵产物置于空气能烘干机65℃烘干，粉碎机粉碎；
s6按照《中华人民共和国轻工业标准》qb/t2487中的方法检测粉碎后的红曲发酵产物中的洛伐他汀和橘霉素的含量。
实施例3
一种红曲洛伐他汀的发酵方法，其包括以下步骤：
s1种子液的制备：用无菌的生理盐水刮洗培养好的平皿，吸取3ml红曲霉(命名为s-01)菌悬液(菌丝干重为10g/l)到500ml的种子培养基中，32℃、180rpm培养48h后，移取10％的种子液，32℃、180rpm培养24h，作为固态发酵的种子液。
s2培养基配方：粳米粉25份、麸皮8份、黄豆粉1份、蛋白胨0.5份、白糖2.5份、酵母浸粉0.5份和复合氨基酸0.2份，控制最终湿料水分含量30％，用乳酸调ph值为4.5；
先蒸熟后再冷却粉碎装瓶，每1500ml塑料瓶装料400g，八层纱布加一层牛皮纸覆盖，125℃灭菌60min，趁热拍散，待用；
s3接种：将种子液按照固态基质重量份的13％接种到固态基质中，拍散，使菌液均匀分布在固体基质中；
s4培养：接种后拍散混匀放入35℃和75％湿度环境中高温发酵，培养8天，每2-3天拍瓶翻曲一次，待培养基上布满种子，彻底拍散，转入23℃的85％湿度环境中低温发酵，每5-7天拍瓶翻曲一次，培养45天，发酵结束得到发酵产物；
s5烘干与粉碎：将发酵产物置于空气能烘干机65℃烘干，粉碎机粉碎；
s6按照《中华人民共和国轻工业标准》qb/t2487中的方法检测粉碎后的红曲发酵产物中的洛伐他汀和橘霉素的含量。
本发明实施例1-3得到的橘霉素的含量为零。
本发明实施例1-3中的步骤s1-s4的每一个步骤都是关键，任何一个物质的替换或者温度等参数的调整，步骤的调换，均为极大的降低洛伐他汀的含量。需要注意的是功能红曲菌菌菌株丛毛红曲菌对生长环境的变化尤其敏感，也因此现有技术中洛伐他汀的含量较低，甚至产生橘霉素毒素。本发明实施例1-3从培养基的制备以及发酵过程的组合，极大的提高发酵产物中洛伐他汀的含量，且可以使橘霉素的含量为零，本发明攻克了本领域技术的难题，使丛毛红曲菌发酵洛伐他汀的应用具有更高的市场价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。