一种产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基的制作方法

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基及其应用。

背景技术：

我国畜牧业发展迅猛，抗生素在治疗动物疾病和促进动物生长等方面有强大的优势，但由于药物残留、耐药性等不利因素使其在世界范围内的使用逐步受到限制。因此，研究开发安全有效的抗生素替代品成为当前畜禽养殖相关企业迫切需要解决的热点和难点问题。

随着人们对环境保护和动物产品安全性意识的增强，抗生素替代品已成为热点，番茄红素凭借其能有效地抑制动物内有害的氧化作用发生，防治癌症，抑制肿瘤细胞增殖、抗辐射，调节脂类代谢，提高动物免疫力等功能，在动物生产中的研究逐渐增多。因此用番茄红素替代部分抗生素，可增强动物的健康，减少畜牧业的损失，同时减少因饲料安全隐患而带来的食品安全问题，使畜禽养殖逐渐走向精细化、节约化、高效化。

番茄红素生产方法主要有天然提取法、化学合成法和微生物发酵法三种。从生产成本及原料、产品活性和纯度等方面考虑，微生物发酵法具有明显的优势，是番茄红素非常理想的产业化生产方法。目前利用基因工程菌生产番茄红素已成为研究的热点。在基础研究和一些工业化生产中，酿酒酵母多采用酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextractpeptonedextrose，yepd)培养基，其培养基成分未能针对特定的酿酒酵母菌株进行优化。因此，需要根据酿酒酵母的碳氮源利用模式，采用原料来源广泛且价格低廉的营养成分，开发适合大规模工业生产，优化酿酒酵母菌中番茄红素合成的整体代谢网络，提高番茄红素在酿酒酵母菌中的合成能力。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中酿酒酵母的番茄红素产率较低的不足，提供一种产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基及其应用，利用该培养基，能够有效地获得较高密度菌体量，提高番茄红素的产量。

本发明的产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基，其含有甘蔗糖蜜液30-40g/l，玉米浆干粉20-25g/l，磷酸二氢钾1.5-2g/l，mgso4^.7h2o3-3.5g/l，硫酸钾5-6g/l，余量为水。

优选，所述的产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基，其含有甘蔗糖蜜液35g/l，玉米浆干粉20g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，mgso4^.7h2o3g/l，硫酸钾5g/l，余量为水。

本发明还提供所述的产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基的应用。

优选，所述的应用，是将酿酒酵母pdc-erg9接种于所述的产番茄红素酿酒酵母的高密度发酵培养基中进行发酵培养，所述的酿酒酵母pdc-erg9，其保藏编号为gdmccno：61352。

优选，所述的应用，包括以下步骤：

a.将保存的酿酒酵母pdc-erg9在yepd培养基平板上活化，挑取单菌接种于yepd液体培养基中，28℃摇床震荡培养12小时后，按1％接种量将菌液转接于yepd液体培养基中，培养12小时后作为种子培养液；

b.按5％的接种量将种子培养液接种于高密度发酵培养基中，发酵条件：温度28℃，转速500rpm，ph值5.5-6.5，通气量1.1:1；发酵24小时，当ph低于5.5时加入naoh进行调整；

c.当发酵液od值在600nm波长下吸收值达到1后，继续发酵3-5小时，然后补料；

d.继续发酵96小时，然后收集和分离番茄红素。

优选，所述的补料，补料液含有蔗糖200g/l，玉米浆干粉250g/l，余量为水。

优选，所述的yepd液体培养基含有酵母膏10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，余量为水。

本发明还提供一株酿酒酵母pdc-erg9，其保藏编号为gdmccno：61352。

本发明提供的用于酿酒酵母高密度发酵培养基，所用材料和工艺均以大规模产生番茄红素为目的。采用上述培养基培养酿酒酵母，有利于酿酒酵母的快速生长，同时酵母中番茄红素含量较高，番茄红素浓度可达280mg/l。本发明中培养基采用蔗糖和甘蔗糖蜜作为碳源，玉米浆干粉作为氮源，降低了发酵成本，采用此技术发酵活菌数达到1.51×10⁹cfu/ml，这是目前技术较难达到的发酵标准，较普通的yepd培养基大大降低了生产成本，实现了高密度发酵。

本发明的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)pdc-erg9是由酿酒酵母为宿主，可用于表达次级代谢产物番茄红素，番茄红素具有非常优良的抗氧化特性。

本发明的酿酒酵母菌高密度发酵的培养基可以高密度发酵重组酿酒酵母，能够有效地获得较高密度菌体量，提高目的次级代谢产物的表达量，大大降低了生产成本，提高生产效率。

本发明的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)pdc-erg9具有良好的产番茄红素的能力，适应力强，该菌株生长状况良好且稳定，菌浓度可达到1.51×10⁹cfu/ml，番茄红素浓度达到280mg/l，且发酵原料为工业副产物，提升了利用价值，在番茄红素生产中有较大的应用潜力。

保藏说明：

本发明的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)pdc-erg9于2020年12月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号：gdmccno：61352。

附图说明

图1是不同碳源对发酵液中番茄红素含量的影响；

图2是不同氮源对发酵液中番茄红素含量的影响。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制

本发明通过对一株酿酒酵母进行基因工程改造，获得了一株高产产番茄红素的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)pdc-erg9。本发明的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)pdc-erg9于2020年12月7日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号：gdmccno：61352。

以下实施例中所用的甘蔗糖蜜液购自网址：https://shop104245111.taobao.com/？spm＝2013.1.1000126.d21.65151274zqzaf8；甘蔗糖蜜液是甘蔗提炼红糖或白糖剩下的没办法结晶的副产物，含多种单糖多糖，总含糖量42％-50％，并含有甘蔗中的维生素、矿物质和微量元素等。

以下实施例中所用的玉米浆干粉购自济南青玉元新材料有限公司，产品生产批号20190522；其蛋白含量(干基)46.8％，水分8.1％，酸度11.4，亚硫酸盐0.17％，溶磷11200μg/g，碳水化合物8.6％。

以下实施例中所用的酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextractpeptonedextrose，yepd)液体培养基组成：酵母膏10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l。

实施例1：培养基中最适碳源和最适氮源摇瓶发酵单因素试验结果对比

最适碳源的确定

基础发酵培养基1组成：碳源2％，蛋白胨2％，kh2po40.1％，ph7.0。分别将甘蔗糖蜜液、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉或麦芽糖作为碳源(2％)替换添加至基础发酵培养基1中。

最适氮源的确定

发酵培养基2组成：甘蔗糖蜜液2％，氮源2％，kh2po40.1％，ph7.0。在选取的最适碳源(甘蔗糖蜜液)基础上添加适量的氮源。分别将蛋白胨、玉米浆干粉、豆粕粉、麸皮粉、硫酸铵或尿素作为氮源(2％)替换添加至发酵培养基2中。

培养基配制方法是：将上述培养基对应的各成分混合均匀，使用蒸馏水溶解，将配置好的培养基装入250ml三角瓶中，搅拌均匀，于115℃高温高压灭菌20min。

为达到培养基的最佳效果，使用上述的培养基发酵酿酒酵母时，发酵过程如下：

(1)将冷冻保存的酿酒酵母pdc-erg9在yepd琼脂平板上活化，挑取单菌落接种于yepd培养基液体试管，28℃培养12小时后，以v/v计，按1％的比例接种于yepd培养基液体试管中，培养12小时后作为种子培养液；

(2)按照培养基配方，配制基础发酵培养基1/发酵培养基250ml装入250ml三角瓶中，灭菌后将温度降至28℃；

(3)以v/v计，按5％的比例的接种量将得到的种子培养液接种于三角瓶中；

(4)发酵条件设定为：温度28℃，转速200rpm，发酵96小时，将发酵完成后的菌体进行收集。

分别以甘蔗糖蜜液、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉或麦芽糖为碳源的发酵液中番茄红素浓度结果(图1)显示，含有甘蔗糖蜜液的发酵液的番茄红素含量最高，因此确定甘蔗糖蜜液作为碳源。

分别以蛋白胨、玉米浆干粉、豆粕粉、麸皮粉、硫酸铵或尿素为唯一氮源的结果(图2)显示，玉米浆干粉最有利于番茄红素的积累，尿素等无机氮源不利于番茄红素的产生和积累，因此确定玉米浆干粉为氮源。

实施例2：发酵培养基1的配置和发酵结果对比

酿酒酵母高密度发酵培养基组成：按每升的比例，甘蔗糖蜜液35g/l，玉米浆干粉20g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，mgso4^.7h2o3g/l，硫酸钾5g/l。

培养基配制方法是：将上述各成分混合均匀，使用蒸馏水溶解，将配置好的培养基装入发酵罐中，搅拌均匀，于115℃高温高压灭菌20min。

为达到培养基的最佳效果，使用上述的酿酒酵母高密度发酵培养基发酵酿酒酵母时，发酵过程如下：

本实施例的高密度发酵主要操作步骤如下：

(1)将冷冻保存的酿酒酵母pdc-erg9在yepd琼脂平板上活化，挑取单菌落接种于yepd培养基液体试管，28℃培养12小时后，以v/v计，按1％的比例接种于yepd培养基液体试管中，培养12小时后作为种子培养液；

(2)按照培养基配方，配制酿酒酵母高密度发酵培养基2500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至28℃；

(3)以v/v计，按5％的比例的接种量将步骤(1)得到的种子培养液接种于步骤(2)的发酵罐中；

(4)发酵条件设定为：温度28℃，转速500rpm，ph值5.5-6.5，通气量1.1:1。在此条件下发酵24小时，当ph降低时则自动加入碱性中和剂naoh；

(5)当发酵液od值在600nm波长下吸收值达到1之后3小时开始补料500ml。补料液的组成如下：蔗糖200g/l，玉米浆干粉250g/l；

(6)发酵96小时，将发酵完成后的菌体进行收集。

本实施例方法与现有技术的比较：对照实验培养基和发酵过程；

(1)对照组采用的酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextractpeptonedextrose，yepd)液体培养基；

(2)将冷冻保存的酿酒酵母pdc-erg9在yepd琼脂平板上活化，挑取单菌落接种于yepd培养基液体试管，28℃培养12小时后，以v/v计，按1％的比例接种于yepd培养基液体试管中，培养12小时后作为种子培养液；

(3)配制yepd培养基2500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至28℃；

(4)以v/v计，按5％的比例的接种量将得到的种子培养液接种于发酵罐中；

(5)发酵条件设定为：温度28℃，转速500rpm，ph值5.5-6.5，通气量1.1:1。在此条件下发酵24小时，当ph降低时则自动加入碱性中和剂naoh；

(6)发酵96小时，将发酵完成后的菌体进行收集。

应用本实施例的酿酒酵母高密度发酵培养基及其发酵方法，可以得到酿酒酵母活菌数达1.51×10⁹cfu/ml，番茄红素浓度达280mg/l。而对照组采用yepd培养基及其发酵方法，得到的酿酒酵母活菌数仅为1.37×10⁸cfu/ml，番茄红素浓度102mg/l。实验证明本实施例的酿酒酵母高密度发酵培养基及其发酵方法得到的酿酒酵母活菌数比现有技术提高了约10.0倍，番茄红素浓度提高了1.75倍，实现了酿酒酵母的高密度发酵。

实施例3：发酵培养基2的配制和发酵结果对比

酿酒酵母高密度发酵培养基组成：按每升的比例，甘蔗糖蜜液30g/l，玉米浆干粉20g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，mgso4^.7h2o3g/l，硫酸钾5g/l。

培养基配制方法是：将上述各成分混合均匀，使用蒸馏水溶解，将配置好的培养基装入发酵罐中，搅拌均匀，于115℃高温高压灭菌20min。

为达到培养基的最佳效果，使用上述的酿酒酵母高密度发酵培养基发酵酿酒酵母时，发酵过程如下：

本实施例的高密度发酵主要操作步骤如下：

(1)将冷冻保存的酿酒酵母pdc-erg9在yepd琼脂平板上活化，挑取单菌落接种于yepd培养基液体试管，28℃培养12小时后，以v/v计，按1％的比例接种于yepd培养基液体试管中，培养12小时后作为种子培养液；

(2)按照培养基配方，配制酿酒酵母高密度发酵培养基2500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至28℃；

(3)以v/v计，按5％的比例的接种量将步骤(1)得到的种子培养液接种于步骤(2)的发酵罐中；

(4)发酵条件设定为：温度28℃，转速500rpm，ph值5.5-6.5，通气量1.1:1。在此条件下发酵24小时，当ph降低时则自动加入碱性中和剂naoh；

(5)当发酵液od值在600nm波长下吸收值达到1之后3小时开始补料500ml。补料液的组成如下：蔗糖200g/l，玉米浆干粉250g/l；

(6)发酵96小时，将发酵完成后的菌体进行收集。

本实施例方法与现有技术的比较：对照实验培养基和发酵过程；

(1)对照组采用的酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextractpeptonedextrose，yepd)培养基；

(2)将冷冻保存的酿酒酵母pdc-erg9在yepd琼脂平板上活化，挑取单菌落接种于yepd培养基液体试管，28℃培养12小时后，以v/v计，按1％的比例接种于yepd培养基液体试管中，培养12小时后作为种子培养液；

(3)配制yepd培养基2500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至28℃；

(4)以v/v计，按5％的比例的接种量将得到的种子培养液接种于发酵罐中；

(5)发酵条件设定为：温度28℃，转速500rpm，ph值5.5-6.5，通气量1.1:1。在此条件下发酵24小时，当ph降低时则自动加入碱性中和剂naoh；

(6)发酵96小时，将发酵完成后的菌体进行收集。

应用本实施例的酿酒酵母高密度发酵培养基及其发酵方法，可以得到酿酒酵母活菌数达9.45×10⁸cfu/ml，番茄红素浓度达256mg/l。而对照组采用yepd培养基及其发酵方法，得到的酿酒酵母活菌数仅为1.37×10⁸cfu/ml，番茄红素浓度102mg/l。实验证明本实施例的酿酒酵母高密度发酵培养基及其发酵方法得到的酿酒酵母活菌数比现有技术提高了约5.90倍，番茄红素浓度提高了1.51倍，实现了酿酒酵母的高密度发酵。

实施例4：发酵培养基3的配制和发酵结果对比

酿酒酵母高密度发酵培养基组成：按每升的比例，甘蔗糖蜜液40g/l，玉米浆干粉20g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，mgso4^.7h2o3g/l，硫酸钾5g/l。

培养基配制方法是：将上述各成分混合均匀，使用蒸馏水溶解，将配置好的培养基装入发酵罐中，搅拌均匀，于115℃高温高压灭菌20min。

为达到培养基的最佳效果，使用上述的酿酒酵母高密度发酵培养基发酵酿酒酵母时，发酵过程如下：

本实施例的高密度发酵主要操作步骤如下：

(1)将冷冻保存的酿酒酵母pdc-erg9在yepd琼脂平板上活化，挑取单菌落接种于yepd培养基液体试管，28℃培养12小时后，以v/v计，按1％的比例接种于yepd培养基液体试管中，培养12小时后作为种子培养液；

(2)按照培养基配方，配制酿酒酵母高密度发酵培养基2500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至28℃；

(3)以v/v计，按5％的比例的接种量将步骤(1)得到的种子培养液接种于步骤(2)的发酵罐中；

(4)发酵条件设定为：温度28℃，转速500rpm，ph值5.5-6.5，通气量1.1:1。在此条件下发酵24小时，当ph降低时则自动加入碱性中和剂naoh；

(5)当发酵液od值在600nm波长下吸收值达到1之后3小时开始补料500ml。补料液的组成如下：蔗糖200g/l，玉米浆干粉250g/l；

(6)发酵96小时，将发酵完成后的菌体进行收集。

本实施例方法与现有技术的比较：对照实验培养基和发酵过程；

(1)对照组采用的酵母浸出粉胨葡萄糖(yeastextractpeptonedextrose，yepd)培养基；

(2)将冷冻保存的酿酒酵母pdc-erg9在yepd琼脂平板上活化，挑取单菌落接种于yepd培养基液体试管，28℃培养12小时后，以v/v计，按1％的比例接种于yepd培养基液体试管中，培养12小时后作为种子培养液；

(3)配制yepd培养基2500ml装入发酵罐中，灭菌后将温度降至28℃；

(4)以v/v计，按5％的比例的接种量将得到的种子培养液接种于发酵罐中；

(5)发酵条件设定为：温度28℃，转速500rpm，ph值5.5-6.5，通气量1.1:1。在此条件下发酵24小时，当ph降低时则自动加入碱性中和剂naoh；

(6)发酵96小时，将发酵完成后的菌体进行收集。

应用本实施例的酿酒酵母高密度发酵培养基及其发酵方法，可以得到酿酒酵母活菌数达8.22×10⁸cfu/ml，番茄红素浓度239mg/l。而对照组采用yepd培养基及其发酵方法，得到的酿酒酵母活菌数仅为1.37×10⁸cfu/ml，番茄红素浓度102mg/l。实验证明本实施例的酿酒酵母高密度发酵培养基及其发酵方法得到的酿酒酵母活菌数比现有技术提高了约5.0倍，番茄红素浓度提高了1.34倍，实现了酿酒酵母的高密度发酵。