具有抗甲型肝炎病毒活性的多甲氧基黄酮衍生物及其制备方法和用途

1.本发明属于药物化学领域，具体涉及一类具有抗甲型肝炎病毒活性的多甲氧基黄酮衍生物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.甲型病毒性肝炎(hepatitis a，简称甲型肝炎)是由微小核糖核酸病毒科肝病毒属的甲型肝炎病毒(hepatitis a virus,hav)引起的以肝脏损伤为主的急性肠道传染病，临床上主要表现为畏寒、发热、恶心、疲乏、食欲减退、肝肿大、肝功能异常、黑尿和黄疸等症状。尽管hav感染多为自限性，不会造成慢性感染，但严重时会导致死亡。此外，hav通常通过粪口感染，传播范围广，且人体通常无法获得持久的免疫力。每年全球约有2亿人感染甲型肝炎病毒，其中有3000万人会出现发病症状，最终3万例患者死于该病，在全球范围造成了严重的公共卫生问题(human vaccines and immunotherapeutics,2020，7:1
‑
24)。
3.到目前为止，尽管接种甲肝疫苗可有效预防hav的感染和流行，但由于疫苗的生产、保存和运输成本较高以及接种不方便等问题的制约，目前不能通过大范围接种甲肝疫苗根绝hav的感染。而与疫苗相比，抗病毒药物具有可缩短疾病周期、减少缩短症状期、迅速遏制流行病高效等优点，对发病患者进行抗病毒药物的治疗，可大幅增强hav的防治效果。但是，目前国内外尚无已上市的专门用于抗甲型肝炎病毒感染的药物，因而研发安全、有效的新型特异性治疗甲型肝炎的药物是国内外基础研究的热点。
4.黄酮类化合物是一类具有显著抗病毒活性的天然产物，其能够与多种靶蛋白分子结合，在过去的数十年里一直被认为是研发新的抗病毒药物的核心骨架(talanta,2011,85:2639
‑
2642；phytotherapy research,2016,30:160
‑
168；nucleic acids research,2014,42:9399
‑
9409)。但是，由于黄酮类化合物本身的结构特征，使其口服生物利用度非常低以及代谢很不稳定等因素，这限制了天然黄酮类化合物很难被直接开发成药物，黄酮结构上酚羟基的甲基化，可以很大程度地提高其代谢稳定性和细胞膜透过能力，从而促进了吸收并大大提高了生物利用度(enzyme and microbial technology,2016,86:103
‑
116)。但是天然来源的多甲氧基黄酮类化合物的含量十分有限，这限制了其在药物研发中的应用。
5.本发明人通过对多甲氧基黄酮进行全合成，并对其进行必要的结构改造，设计并合成了一系列具有较高抗甲型肝炎病毒活性的多甲氧基黄酮衍生物，以期填补国内外抗甲型肝炎病毒感染药物方面的空白。


技术实现要素：

6.为了解决上述技术问题，本发明制备了一系列具有较高抗甲型肝炎病毒活性的多甲氧基黄酮衍生物或其药学上可接受的盐，并进一步提供了包含所述衍生物或其药学上可接受的盐的药物组合物，以及所述衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法。此外，还提供
了所述衍生物或其药学上可接受的盐或者其药物组合物在制备抗甲型肝炎病毒感染或治疗甲型肝炎的药物中的用途。
7.具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
8.在第一个方面中，本发明提供了具有抗甲型肝炎病毒活性的多甲氧基黄酮衍生物或其药学上可接受的盐，所述衍生物具有式(i)或式(ii)所示的化学结构
[0009][0010]
其中，在式(i)中，n为1、2、3、4或5，r1和r2各自独立地选自h或c1‑
c9烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基，取代基为：卤素、c1‑
c4烷基、c1‑
c4烷氧基或硝基，
[0011]
或者，所述r1和r2各自独立地选自：
[0012][0013]
或者，r1、r2同所连接的氮原子共同形成同所连接的氮原子共同形成
[0014]
在式(ii)中，n为1、2、3、4或5，r3选自以下：选自以下：
[0015]
在一个优选的实施方式中，式(ii)中，n为1、2、3、4或5，r3选自以下：
[0016]
在一个更优选的实施方式中，所述衍生物选自以下：
[0017]
[0018]
[0019]
[0020][0021]
在第二个方面中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含上述实施方式所述的多甲氧基黄酮衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
[0022]
在一个优选的实施方式中，所述药物组合物的剂型为口服剂型或注射剂型。
[0023]
在一个更优选的实施方式中，所述口服剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂或控释制剂。
[0024]
在第三个方面中，本发明提供了上述实施方式所述的多甲氧基黄酮衍生物或其药学上可接受的盐制备方法，所述制备方法包括下述步骤：2,4,6
‑
三羟基苯乙酮a为起始原料之一，丙酮为溶剂，得中间体b；以中间体b为原料，在丙酮溶液中与硫酸二甲酯反应，生成中间体c；以中间体c为原料，3,4,5
‑
三甲氧基苯甲醛为另一起始原料，在氢氧化钾水溶液中生成中间体d；接着中间体d在甲醇中，脱保护生成中间体e；中间体e在丙酮溶液中与氯甲基甲醚选择性保护生成中间体f；中间体f在醋酸钠
‑
乙醇系统中，生成中间体g；然后中间体g脱保护生成中间体h；接着将中间体h溶解在适量的甲醇中，在氰基硼氢化钠的作用下发生还原反应生成中间体i；然后中间体i与溴乙酸乙酯在碳酸钾作用下生成中间体j；将中间体j溶于四氢呋喃溶液中，加入氢氧化钠水溶液生成中间体k；最后将中间体中间体k与有机胺类化合物反应生成ssc1
‑
ssc9，中间体l与取代的苯甲醛反应生成ssc10
‑
ssc37，
[0025]
合成路线如下：
[0026][0027]
进一步地，所述制备方法包括下述步骤：
[0028]
(1)中间体b的合成：将2,4,6
‑
三羟基苯乙酮a溶于丙酮中，在搅拌下加入无水碳酸钾，加热回流15min，用注射器缓慢滴加氯甲基甲醚，继续回流6h，减压蒸去溶剂，残余物加水溶解，乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用蒸馏水洗、饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，用硅胶柱色谱纯化；
[0029]
(2)中间体c的合成：将化合物b溶于丙酮中，在搅拌下加入2
‑
3倍物质的量的无水碳酸钾加热回流30min，用注射器缓慢滴加2
‑
2.5倍硫酸二甲酯，继续回流8h，后处理方式同(1)。
[0030]
(3)中间体d的合成：将化合物c和1
‑
1.2倍物质的量的3,4,5
‑
三甲氧基苯甲醛溶于适量乙醇中，在搅拌下缓慢滴加0℃的氢氧化钾
‑
水
‑
乙醇溶液，并在氮气保护下于0℃反应6
‑
8h，将反应液倒入冰水中，用1mol/l的盐酸调节至ph值小于4；
[0031]
(4)中间体e的合成：将化合物d溶于乙醇中，在0℃下，反应缓慢滴加3mol/l盐酸溶液，反应6
‑
8h；
[0032]
(5)中间体f的合成：将化合物e溶于丙酮中，在搅拌下加入1
‑
2倍无水碳酸钾加热回流30min，缓慢滴加1
‑
1.5倍物质的量的氯甲基甲醚，继续回流6
‑
8h；
[0033]
(6)中间体g的合成：将化合物f溶于乙醇中，在搅拌下，加入2
‑
3倍物质的量的无水
醋酸钠和适量水，加热回流反应20
‑
24h；
[0034]
(7)中间体h的合成：将化合物g溶于乙醇中，在0℃下，反应缓慢滴加3mol/l盐酸溶液，反应6
‑
8h；
[0035]
(8)中间体i的合成：将化合物h溶于甲醇中，在搅拌下加入2
‑
3倍物质的量的氰基硼氢化钠，室温下反应8
‑
12h；
[0036]
(9)中间体j的合成：将化合物i溶于丙酮中，在搅拌下加入1
‑
2倍物质的量的无水碳酸钾，加热回流30min，缓慢滴加1
‑
1.5倍物质的量的溴乙酸乙酯，继续回流6
‑
8h；
[0037]
(10)中间体k的合成：将化合物j溶于四氢呋喃中,在0℃下，反应缓慢滴加20％氢氧化钠溶液，反应4
‑
6h；
[0038]
(11)中间体l的合成：将化合物j溶于乙醇中，加入2
‑
3倍物质的量的水合肼，加热回流反应6
‑
8h；
[0039]
(12)ssc1
‑
ssc9的合成：将化合物k溶于dmf中，搅拌下加入0.5
‑
1倍2
‑
(7
‑
氮杂苯并三氮唑)
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯，1
‑
2倍n,n
‑
二异丙基乙胺和各种不同碳链长度的胺如二甲胺、二乙胺、二丁胺、吡咯烷等或含有不同取代基的芳香胺如4
‑
氟苯胺、4
‑
硝基苯胺、4
‑
氯苯胺、2
‑
氨甲基吡啶等，反应6
‑
8h；
[0040]
(13)ssc10
‑
ssc37的合成：将化合物k溶于乙醇中，搅拌下加入1
‑
2倍物质的量的不同取代基的醛或酮如4
‑
氟苯甲醛、4
‑
溴苯甲醛、4
‑
氯苯甲醛、4
‑
氯苯乙酮、4
‑
溴苯乙酮、4
‑
甲氧基苯乙酮等，再加入催化量的冰乙酸溶液，加热回流反应6
‑
8h。
[0041]
在第四个方面中，本发明提供了上述实施方式所述的多甲氧基黄酮衍生物或其药学上可接受的盐，或者上述实施方式所述的药物组合物在制备抗甲型肝炎病毒感染的药物中的用途。
[0042]
另外地，本发明提供了上述实施方式所述的多甲氧基黄酮衍生物或其药学上可接受的盐，或者上述实施方式所述的药物组合物在制备治疗甲型肝炎的药物中的用途，优选地，所述甲型肝炎为重症甲型肝炎。
[0043]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。
[0044]
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
[0045]
本发明人通过对多甲氧基黄酮进行全合成，并对其进行必要的结构改造，设计并合成了一系列新型多甲氧基黄酮衍生物或其药学上可接受的盐。通过应用可视化药物筛选模型对甲型肝炎病毒复制进行抗病毒药物筛选发现，本发明的多甲氧基黄酮衍生物或其药学上可接受的盐具有良好的抗甲型肝炎病毒活性，因此可以将其开发成新型抗甲型肝炎病毒感染的药物，具有非常高的潜在研究价值和临床应用前景。
附图说明
[0046]
图1为采用hav
‑
nluc系统进行化合物ssc1
‑
ssc37初筛的活性结果；
[0047]
图2为化合物ssc15、19、20、21抑制野生型hav的产生；
[0048]
图3为化合物ssc15、19、20、21对huh7.5.1细胞的毒性；
[0049]
图4为化合物ssc15、19、20、21抑制hav复制；
[0050]
图5为化合物ssc15、19、20、21的免疫荧光染色。
具体实施方式
[0051]
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”选自稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂或溶剂中的一种或多种。
[0052]
本发明所述稀释剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆等；所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；所述稳定剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚和羧甲基甲壳酯等；所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等。
[0053]
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
[0054]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
[0055]
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
[0056]
实施例1：化合物ssc2的制备
[0057][0058]
在25ml茄型瓶中加入中间体化合物k(30mg，0.074mmol)，2
‑
(7
‑
氮杂苯并三氮唑)
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯(28.1mg，0.074mmol)，二乙胺(9mg，0.111mmol)，n,n
‑
二异丙基乙胺(9.5mg，0.074mmol)，干燥的dmf 10ml，60℃反应10h。反应完毕，依次用水、饱和食盐水萃取，分出有机层，干燥过滤浓缩得油状，经硅胶柱色谱纯化得到目标产物ssc2。
[0059]
结构鉴定数据如下：1h nmr(600mhz,cdcl3):δ6.64(s,2h),6.22(d,j＝2.35hz,1h),6.09(d,j＝2.35hz,1h),4.86(dd,j＝10.79,1.85hz,1h),4.63(s,2h)3.88(s,6h,och3),3.85(s,3h,och3),3.81(s,3h,och3),3.05(s,3h),2.98(s,3h),2.78(m,1h),2.63(m,1h)，2.17(m,1h),2.00(m,1h)。
[0060]
实施例2：化合物ssc8的制备
[0061][0062]
在25ml茄型瓶中加入中间体化合物k(30mg，0.074mmol)，四甲氧基硅烷(22.5mg，0.148mmol)，对氯苯胺(14mg，0.111mmol)，甲苯10ml，100℃反应10h。反应完毕，依次用水、饱和食盐水萃取，分出有机层，干燥过滤浓缩得淡黄色粉末，经硅胶柱色谱纯化得到目标产物ssc8。
[0063]
结构鉴定数据如下：1h nmr(600mhz,cdcl3):δ8.22(s,n
‑
h),7.55(d,j＝7.94hz,2h),7.05(d,j＝22.61hz,2h),6.64(s,2h),6.19(d,j＝2.37hz,1h),6.17(d,j＝2.37hz,1h),4.90(dd,j＝10.70,1.90hz,1h),4.57(s,2h),3.88(s,6h,och3),3.85(s,3h,och3),3.84(s,3h,och3),2.80(ddd,j＝16.80,5.57,2.37hz,1h),2.65(m,1h),2.20(ddt,j＝13.59,6.11,2.18hz,1h),2.01(dtd,j＝13.71,11.53,5.67hz,1h)。
[0064]
实施例3：化合物ssc15的制备
[0065][0066]
在25ml茄型瓶中加入中间体化合物l(30mg，0.072mmol)，5
‑
氯噻吩
‑2‑
甲醛(16.0mg，0.111mmol)，乙醇10ml，催化量冰醋酸，加热回流反应10h。反应完毕，依次用水、饱和食盐水萃取，分出有机层，干燥过滤浓缩得油状化合物，经硅胶柱色谱纯化得到目标产物ssc15。
[0067]
结构鉴定数据如下：1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.62(ds,1h,异构体a),11.56(ds,1h,异构体b),8.48(s,1h,异构体a),8.07(s,1h,异构体b),7.34(d,1h,j＝3.98hz异构体a),7.32(d,1h,j＝3.95hz异构体b),7.16(d,1h,j＝3.94hz异构体a),7.13(d,1h,j＝3.94hz异构体b),6.72(s,4h,异构体a,b),6.25(d,j＝2.28hz,1h,异构体a),6.17(d,j＝2.27hz,1h,异构体b),6.08(d,j＝2.26hz,1h,异构体a),5.96(d,j＝2.23hz,1h,异构体b),4.92(m,1h,异构体a),4.90(m,1h,异构体b),3.76(s,18h,och3,异构体a,b),3.65(s,6h,och3,异构体a,b),2.62(m,2h,异构体a,b),2.56(m,2h,异构体a,b),2.12(m,2h,异构体a,b),1.95(m,2h,异构体a,b)。
[0068]
实施例4：化合物ssc19的制备
[0069][0070]
在25ml茄型瓶中加入中间体化合物l(30mg，0.072mmol)，对氯苯甲醛(15.5mg，0.111mmol)，乙醇10ml，催化量冰醋酸，加热回流反应10h。反应完毕，依次用水、饱和食盐水萃取，分出有机层，干燥过滤浓缩得油状化合物，经硅胶柱色谱纯化得到目标产物ssc19。
[0071]
结构鉴定数据如下：1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.62(ds,2h,异构体a,b),8.33(s,1h,异构体a),7.99(s,1h,异构体b),7.70(m,4h,异构体a,b),7.50(m,4h,异构体a,b),6.72(m,4h,异构体a,b),6.26(d,j＝2.27hz,1h,异构体a),6.18(d,j＝2.27hz,1h,异构体b),6.09(d,j＝2.25hz,1h,异构体a),6.01(d,j＝2.25hz,1h,异构体b),5.06(s,2h,异构体a),4.91(dd,j＝10.61,1.49hz,2h,异构体a,b),4.61(s,2h,异构体b),3.76(s,18h,och3,a,b),3.65(s,6h,och3,异构体a,b),2.62(m,2h,异构体a,b),2.57(m,2h,异构体a,b),2.12(m,2h,异构体a,b),1.94(m,2h,异构体a,b)。
[0072]
实施例5：化合物ssc20的制备：
[0073][0074]
在25ml茄型瓶中加入中间体化合物l(30mg，0.072mmol)，对溴苯甲醛(20.5mg，0.111mmol)，乙醇10ml，催化量冰醋酸，加热回流反应10h。反应完毕，依次用水、饱和食盐水萃取，分出有机层，干燥过滤浓缩得油状化合物，经硅胶柱色谱纯化得到目标产物ssc20。
[0075]
结构鉴定数据如下：1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.68(ds,2h,异构体a,b),8.32(s,1h,异构体a),7.97(s,1h,异构体b),7.63(m,8h,异构体a,b),6.72(m,4h,异构体a,b),6.26(d,j＝2.15hz,1h,异构体a),6.18(d,j＝2.18hz,1h,异构体b),6.09(d,j＝2.15hz,1h,异构体a),6.01(d,j＝2.18hz,1h,异构体b),5.07(s,2h,异构体a),4.90(dd,j＝10.61,1.49hz,2h,异构体a,b),4.62(s,2h,异构体b),3.76(s,18h,och3,异构体a,b),3.65(s,6h,och3,异构体a,b),2.62(m,2h,异构体a,b),2.56(m,2h,异构体a,b),2.11(m,2h,异构体a,b),1.95(m,2h,异构体a,b)。
[0076]
实施例6：化合物ssc21的制备
[0077][0078]
在25ml茄型瓶中加入中间体化合物l(30mg，0.072mmol)，对甲基苯甲醛(13.5mg，
0.111mmol)，乙醇10ml，催化量冰醋酸，加热回流反应10h。反应完毕，依次用水、饱和食盐水萃取，分出有机层，干燥过滤浓缩得油状化合物，经硅胶柱色谱纯化得到目标产物ssc21。
[0079]
结构鉴定数据如下：1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ11.51(ds,2h,异构体a,b),8.30(s,1h,异构体a),7.96(s,1h,异构体b),7.58(d,j＝7.84hz,4h,异构体a,b),7.24(d,j＝7.86hz,4h,异构体a,b),6.72(s,4h,异构体a,b),6.26(d,j＝1.42hz,1h,异构体a),6.18(d,j＝1.48hz,1h,异构体b),6.10(d,j＝1.31hz,1h,异构体a),6.00(d,j＝1.40hz,1h,异构体b),5.06(s,2h,异构体a),4.91(m,2h,异构体a,b),4.60(s,2h,异构体b),3.77(s,3h,och3,异构体a,b),3.76(s,12h,och3,异构体a,b),3.74(s,3h,och3,异构体a,b),3.65(s,6h,och3,异构体a,b),2.62(m,2h,异构体a,b),2.56(m,2h,异构体a,b),2.33(s,3h,ch3,异构体a),2.32(s,3h,ch3,异构体b),2.12(m,2h,异构体a,b),1.94(m,2h,异构体a,b)。
[0080]
实施例7：化合物ssc32生物的制备
[0081][0082]
在25ml茄型瓶中加入中间体化合物l(30mg，0.072mmol)，对氯苯乙酮(17.2mg，0.111mmol)，乙醇10ml，催化量冰醋酸，加热回流反应10h。反应完毕，依次用水、饱和食盐水萃取，分出有机层，干燥过滤浓缩得油状化合物，经硅胶柱色谱纯化得到目标产物ssc32。
[0083]
结构鉴定数据如下：1h nmr(600mhz,dmso
‑
d6):δ10.78(s,2h,异构体a,b),7.81(d,4h,j＝8.25hz,异构体a,b),7.47(d,2h,j＝8.40hz,异构体a),7.44(d,2h,j＝8.27hz,异构体b),6.72(s,4h,异构体a,b),6.22(s,1h,异构体a),6.19(s,1h,异构体b),6.08(s,1h,异构体a),5.99(s,1h,异构体b),5.11(s,2h,异构体a),4.90(dd,j＝10.61,1.49hz,2h,异构体a,b),4.71(s,2h,异构体b),3.76(s,6h,och3,异构体a,b),3.75(s,3h,och3,异构体a),3.65(s,3h,och3,异构体b),2.62(m,2h,异构体a,b),2.56(m,2h,异构体a,b),2.27(s,3h,异构体a),2.24(s,3h,异构体b),2.11(m,2h,异构体a,b),1.94(m,2h,异构体a,b)。
[0084]
实施例8：
[0085]
为了证明本发明药物有治疗hav的效果，对所有化合物ssc1
‑
ssc37进行了药效学筛选，研究其是否特异性抑制甲型肝炎病毒的产生。
[0086]
具体的抗病毒化合物筛选方法及结果，如下所示：
[0087]
(1)利用hav
‑
nluc系统进行化合物初筛。以hav
‑
nluc 100拷贝/细胞感染huh7.5.1细胞4小时后，去除含有病毒的培养基，用磷酸盐缓冲液清洗细胞一次。加入含有化合物ssc1
‑
ssc37(最终浓度均为10μm)的培养基培养72小时。分别回收细胞和上清液。细胞用于测定化合物的细胞毒性(celltiter
‑
luminescent cell viability assay)。利用上清液再次感染新的huh7.5.1细胞48小时，通过测定nluc信号来确认nluc/生存率数值，以验证各化合物ssc1
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ssc37分别对hav产生的影响，结果表明大部分化合物具有较强的抑制hav的活性，如图1所示。
[0088]
(2)抑制野生型hav的产生。以野生型hav 100拷贝/细胞感染huh7.5.1细胞4小时
后，去除含有病毒的培养基，用磷酸盐缓冲液清洗细胞一次。加入含有化合物ssc1
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ssc37(2、10、50μm)的培养基培养72小时。分别回收细胞和上清液。细胞用于测定化合物的细胞毒性(celltiter
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luminescent cell viability assay)。利用上清液再次感染新的huh7.5.1细胞48小时，从细胞中提取rna，并通过qrt
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pcr法进行定量。优选(1)中抑制hav活性最强的化合物ssc15、19、20、21进行抑制野生型hav的测试，如图2所示，结果显示化合物ssc15、19、20、21依浓度梯度抑制野生型hav病毒产生，且在50μm浓度下依然没有细胞毒性，如图3所示。
[0089]
(3)抑制hav复制。在体外合成用以模拟hav复制的hav subgenomic rna。通过电穿孔法将hav subgenomic rna导入huh7.5.1细胞后，分别用上述化合物ssc15、19、20、21处理72h，回收细胞进行luc信号测定，用以评价其对hav复制的影响。结果显示化合物ssc15、19、20、21同样对hav的复制也呈现浓度梯度抑制，如图4所示。由此可见，化合物ssc15、19、20、21是通过抑制hav的复制，最终抑制hav的产生。
[0090]
(4)免疫荧光染色。按照100拷贝/细胞用hav病毒感染huh7.5.1细胞4小时，留一个未感染细胞样本作为阴性对照。吸取病毒，用培养基清洗细胞一次，分别加入含有dmso或者各个化合物(10μm)的培养基处理48小时。除去上清液，用pbs清洗样品一次，用固定液(4％甲醛)于室温固定样品30分钟，除去固定液，pbs清洗一次，加入0.1％triton处理十分钟。用pbs稀释适量一次抗体抗
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hav 2c抗体100倍，于4℃处理样品，过夜反应。pbs清洗样品三次，每次静置五分钟，再用pbs稀释适量二抗抗小鼠igg alexa488抗体1000倍，于室温处理样品两小时。pbs清洗样品三次，每次静置五分钟，进行细胞核染色(dapi)，室温反应1分钟。最后pbs清洗样品三次，每次静置五分钟，褪色封入剂处理，盖上盖玻片并固定，用zeiss共聚焦荧光显微镜进行观测。如图5所示，化合物ssc15、19、20、21都能够抑制hav病毒蛋白的表达，而化合物ssc15与其它化合物相比，对hav病毒蛋白的抑制活性更强，该结果与图2以及图4的趋势一致。
[0091]
综上所述，通过应用上述可视化药物筛选模型对甲型肝炎病毒复制进行抗病毒药物筛选发现，本发明的多甲氧基黄酮衍生物具有良好的抗甲型肝炎病毒活性，可以进一步用于开发治疗甲型肝炎的药物。
[0092]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。